Floral-dip Transformação de Arabidopsis thaliana Examine a PTSO2:: β-glucuronidase Expressão Gênica Reporter

Este artigo ilustra o floral-dip método de Agrobacterium tumefaciens Mediada por transformação de Arabidopsis thaliana. Pela introdução de um ciclo celular regulados promotor-repórter, PTSO2:: β-glucuronidase (GUS), Em Arabidopsis, Que ilustra como um detecta GUS expressão repórter em mudas transgênicas.

A capacidade de introduzir genes estranhos em um organismo é a base para a biologia moderna e biotecnologia. Na planta de floração modelo

I. Floral-dip transformação de Arabidopsis thaliana

1. Aproximadamente 1 mês antes da transformação, semear Arabidopsis para 4-8 vasos (5 polegadas potes quadrados), com cerca de 10-15 plantas por vaso. Para plantas com fertilidade normal, 4 potes de plantas por construir plasmídeo será suficiente. Se alguém tem de transformar Arabidopsis mutantes com a fertilidade reduzida, aumento do número de potes em conformidade.
2. As plantas são cultivadas em condições normais (16 horas luz e 8 horas escuro a 22 ° C). Se as plantas são cultivadas em dia mais curto ou mais baixa temperatura, eles vão demorar mais tempo a flor e mais tempo para estar pronto para a transformação. Cuidados com as plantas bom garantir plantas saudáveis, que são essenciais para a transformação de sucesso.
3. Quando as plantas têm apenas parafusados ​​e começou a florescer. Eles estão agora prontos para a transformação. Para aumentar a eficiência de transformação, 3-4 dias antes da transformação, corte os ramos principais da inflorescência, logo que eles têm aparafusado para incentivar mais a formação secundária atirar. Regar as plantas um dia antes da transformação. Isso garante que o solo não irá absorver media infiltração muito durante floral-dipping.
4. Dois dias antes da transformação, inocular LB 40ml contendo antibióticos apropriados (no caso de pTSO2:: GUS, 50 mg / ml kanamicina) com Agrobacterium tumefaciens GV3101 carregando o pTSO2:: GUS construir. O pTSO2:: GUS é clonado no vetor pBIN20 que possui NPTII gene que confere resistência à canamicina ^3. Crescer durante a noite em uma incubadora de agitação a 28-30 ° C.
5. No dia seguinte, 8ml transferência da cultura durante a noite em 400ml de LB contendo canamicina 50 mcg / ml. Crescer durante a noite em uma incubadora de agitação a 28-30 ° C.
6. No dia da transformação, quando o OD ₆₀₀ da cultura Agrobacterium atinge aproximadamente 0,8 (OD entre 0,5 para 1 ₆₀₀ são aceitáveis), girar a cultura Agrobacterium durante a noite a por 8 minutos a 5000rpm.
7. Ressuspender o sedimento em Agrobacterium 1 L (litro) de meios de infiltração (10mM MgCl _2, 5% de sacarose, 0,44 mm 6-benziladenina (BA), 0,3% Silwet L-77, 1x solução Gamborg s vitaminas e água esterilizada). O meio não precisa ser autoclavados, mas precisa ser feito fresco. Despeje a 1 L médio de infiltração Agrobacterium contendo em um prato (como 8 "x15" x2 "prato de vidro Pyrex).
8. Inverter o pote (plantas não vai cair) e mergulhe todas as partes aéreas das plantas na solução de infiltração, segure por 5 minutos um pote de cada vez. Embora todas as partes aéreas da planta estão imersos no meio de infiltração, evitar que o solo absorva qualquer um dos meios de infiltração para reduzir as chances de crescimento de fungos no solo.
9. Após imersão, colocar todos os potes mergulhado em seu lado em várias camadas de papel toalha em uma bandeja. As toalhas de papel absorver quantidade de acesso dos meios de comunicação de infiltração. Cubra a bandeja com filme plástico para garantir alta umidade. Coloque a bandeja em câmara de crescimento vegetal.
10. No dia seguinte, retire a capa de plástico e toalhas de papel, e potes de lugar na vertical. Não regue as plantas para 4-5 mais dias. Depois, manter as plantas normalmente até que definir sementes e coletar sementes a granel.
11. Preparar placas (placa de petri 150x15mm) com meio MS contendo 50 mg / ml kanamicina (peso 2.2g Murashige e Skoog sal basal sem vitamina, dissolver em 500 ml de água pH, para 5,8 com NaOH 1M, acrescentar 4 gramas de ágar, autoclave, fresco e adicionar canamicina a 50 mg / ml concentração final). Placas são mantidos em 4 ° C até ser necessário.
12. Selecionar para resistentes aos antibióticos plantas transgênicas, é preciso 20 mil sementes de tela no mínimo. 0,1 grama é de cerca de 5000 sementes. Peso e estimar a quantidade de sementes.
13. Esterilizar sementes por lavá-los em 15 tubos Falcon ml com etanol 70% por 30 segundos. Lave as sementes com água estéril uma vez. Embeba as sementes por 30 segundos em uma solução contendo diluição de 1:10 de loja, comprei lixívia a 5% (Clorox). Enxaguar as sementes com água estéril 3-6 vezes. Na capa estéril, pipeta cerca de 5000 sementes em cada placa de MS (canamicina), espalhar as sementes uniformemente sobre a placa, selar as placas com fita Micropore 3M para evitar a contaminação.
14. Incubar as placas a 4 ° C no escuro por 3-4 dias, em seguida, transferir as placas para uma câmara (poderia ser a câmara de crescimento mesma planta). Após cerca de 14 dias, as mudas transgênicas ficar verde, mas os não-transgênicos são empalidecendo e morrer. Transferência das mudas transgênicas para o solo, diminuindo puxar as raízes para fora do meio e colocou-os no solo.

II. Examinando pTSO2:: padrões de expressão GUS

1. Colheita pTSO2:: GUS mudas transgênicas e colocá-los em acetona 90% a frio em um frasco de cintilação de vidro ou tubos de microcentrífugaque são mantidos no gelo. Placas de poliestireno de microtitulação (não polipropileno) também pode ser usado se analisa um grande número de amostras.
2. Depois de todas as amostras são colhidas, coloque os frascos em temperatura ambiente por 20 minutos. Durante este tempo compõem tampão fresco sem coloração x-Glic (0,2% Triton x-100, 50 mM tampão pH7.2 NaHPO _4, 2mM ferrocianeto de potássio, potássio ferricianeto 2mM) e colocar no gelo.
3. Remover acetona a partir das amostras e adicione o buffer de coloração.
4. Make up x-Glic solução corante (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO ₄ buffer pH7.2, potássio 2mM Ferrocianeto, potássio 2mM ferricianeto, 2mM x-glic). Remova o tampão de coloração de amostras e adicione o buffer de coloração contendo x-Glic às amostras.
5. Infiltrar as amostras sob vácuo por 15 a 20 minutos. Liberar o vácuo devagar e verifique se todas as amostras afundar sob a superfície da solução corante. Se necessário, repita a infiltração até que todas as amostras após afundar o vácuo é liberado.
6. Incubar as amostras a 37 ° C durante a noite no buffer coloração com x-Glic.
7. Remover amostras de incubadora e remover manchas de buffer. Lavar as amostras em série de etanol sucessivas (20%, 35% e etanol 50%) em temperatura ambiente por 30 minutos cada mudança.
8. Corrigir os tecidos em FAA fixador (etanol 50%, formaldeído 5%, 10% de ácido acético, água de descanso) por 30 minutos em temperatura ambiente. Remover FAA e adicionar etanol 70%. Neste ponto, os tecidos podem ser visualizados e fotografados em um microscópio de dissecação equipado com uma câmera digital. A cor azul escura indica onde TSO2 é expressa (Figura 1). Alternativamente, os tecidos podem ser armazenados a 4 ° C para posterior visualização.
   
   
   Figura 1 pTSO2:.: GUS expressão em mudas transgênicas (A), raízes lateral (B) e ponta da raiz (C). Note-se que TSO2 promotor é altamente ativo em tecidos jovens e dividindo. O padrão de expressão esporádica mostrado em (C) é típico de genes expressos em fases específicas do ciclo celular.

Resultados representante

Quando feito corretamente, a eficiência de transformação deve ser de aproximadamente 0,1-0,2%. Em outra palavra, deve-se obter mudas transgênicas 10/05 por triagem cada 5000 sementes. Em média, cerca de 100 linhagens transgênicas podem ser obtidas através da transformação 4 potes de plantas do tipo selvagem.

Para mudas transgênicas contendo o pTSO2:: GUS construir ^3, cor azul escuro refletindo a atividade GUS é encontrada em células que se dividem ativamente incluindo folhas jovens, rebentos, ponta da raiz, e lateral de raiz primórdios (Figura 1). O padrão não-uniforme esporádicos é característico do ciclo celular fase específica de expressão.

A eficiência de transformação é determinada por muitos fatores diferentes, que são discutidos abaixo:

1. A saúde das plantas e sua idade é de importância primordial. Cerca de um mês de idade plantas produzindo inúmeros botões florais imaturos são ideais. Aparando os galhos primária para encorajar a formação secundária dia 04/03 tiro antes da transformação irá aumentar a eficiência de transformação. Plantas mais velhas dará origem a transformantes, mas a uma taxa inferior.
2. Fertilidade das plantas é importante. Se alguém tem de transformar mutantes com reduzida fertilidade, plantas muito mais serão necessários para mergulhar.
3. 0,3% Silwet L-77 surfactante em tampão infiltração é considerada essencial.
4. Mergulhando tempo na mídia de infiltração deve ser pelo menos 5 minutos.
5. Para reduzir a contaminação por fungos, várias precauções devem ser tomadas. Primeiro, é preciso evitar que o solo absorve media infiltração de regar as plantas / solo um dia antes de infiltração. Não mergulhe o solo nos meios de comunicação de infiltração. Em segundo lugar, retire a tampa de plástico e papel toalha dentro de 24 horas após a infiltração para reduzir a umidade. Terceiro, não plantas aquáticas até 5 dias após a infiltração.

Dependendo construir plasmídeo específico, os métodos de seleção de plantas transgênicas pode variar. Se um vetor plasmídeo leva o Bar (bialaphos acetiltransferase) gene marcador de resistência conferindo ao glufosinato de amônio, pode-se plantar as sementes diretamente no solo sem qualquer esterilização de sementes. Um, então sprays as mudas com 1:1000 glufosinato de amônio diluído (nome comercial: Finale, Liberty, ou Ignite) uma vez a cada poucos dias para selecionar para mudas resistentes.

Para a coloração de GUS, ela é importante para a colheita de tecidos em acetona sobre o gelo e manter todas as soluções de frio para evitar qualquer degradação. Os buffers coloração com e sem X-Glic precisa ser feito fresco, embora a solução estoque para cada componente podem ser feitas e armazenadas antes do tempo (veja abaixo). Ferrocianeto de potássio e ferrocianeto são tóxicos e devem ser manuseados com cuidado. Além disso, é importante não para incubar o tecido a 37 ° C no buffer de coloração com X-Glic por mais de 1-2 dias, porque o tecido pode começar a deteriorar-se e / ou o padrão de coloração pode se tornar muito difusa durante a incubação longo . Finalmente, maior Ferri e as concentrações de ferrocianeto de dar menor nível de coloração geral, mas mais especificidade. 2mM X-Glux funciona bem para a maioria das aplicações, mas as concentrações podem precisar de ser ajustados para determinadas necessidades. X-Glic é caro. A coloração deve ser realizado em volumes mínimos.

As soluções de reserva que podem ser feitas antes do tempo:

10% Triton X-100 (armazenado em temperatura ambiente por vários meses)
0,5 M NaHPO ₄ Buffer (pH7.2) (armazenado em temperatura ambiente por vários meses)
100 mM de potássio (loja no escuro a 4 ° C por vários meses) Ferrocianeto
100 mM de potássio (loja no escuro a 4 ° C por vários meses) ferricianeto
100 mM X-Glic (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glicuronídeo sal cyclohexamine) é feita em Dimetilformamida (DMF) e armazenados em -20 ° C em tubos de papel alumínio envolto. Tem a duração de vários meses.

Agradecemos a Chunxin Wang para a construção de pTSO2:: GUS e para fotos na Figura 1, Detlef Weigel para compartilhar o protocolo GUS-infalível, Paja Sijacic, e Courtney Hollender para comentários úteis. Pesquisa em laboratório Z. L s é apoiado pela National Science Foundation EUA (IOB0616096 e MCB0744752). ZL é parcialmente financiado pela Universidade de Maryland Estação Experimental Agrícola.