花香浸改造拟南芥检查 pTSO2：β-葡萄糖醛酸酶报告基因的表达

本文介绍了花卉浸方法农杆菌介导的转化拟南芥。通过引入一个细胞周期调节的发起人，记者， pTSO2：β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的，到拟南芥，我们演示了如何检测到GUS基因在转基因苗记者表达。

一个有机体，引入外源基因的能力，是现代生物学和生物技术的基础。在该模型中的开花植物

一，花香浸拟南芥的转化

1. 改造前约1个月，大约有10-15％的盆栽植物拟南芥种子播撒到4至8盆（5平方英寸的花盆）。与正常生育的植物，4盆植物每质粒的构建就足够了。如果一个人改造拟南芥突变生育率下降，增加相应的盆数。
2. 植物生长标准条件下（16小时光照，8小时黑暗，在22 ° C）。如果较短的一天或更低的温度下生长的植物，他们将需要更长的时间，花和更长的改造做好准备。良好的植物护理，确保健康的植物，这是成功转型的关键。
3. 当植株只是狂奔，并开始开花。他们现在准备转型。为了提高转换效率，改造前的3-4天，剪掉主花序芽，尽快为他们狂奔，以鼓励更多中学拍摄形成。植物浇水改造前的一天。这确保土壤不会吸收太多渗透媒体在花香浸。
4. 改造前两天，接种40毫升含有适当的抗生素的LB农杆菌菌株GV3101中携带的pTSO2（pTSO2情况下的 GUS，50微克/ ml卡那霉素：）：：GUS的构造。 pTSO2：：GUS在pBIN20载体，拥有NPTII基因，赋予抗卡那霉素³克隆。在摇床过夜增长在28-30 ° C。
5. 翌日，转移到含有50微克/ ml卡那霉素LB400毫升8毫升过夜培养。在摇床过夜增长在28-30 ° C。
6. 在转型的一天，当_外径 600农杆菌文化达到约0.8（ _外径 600 0.5 TO1之间是可以接受的），降速在8分钟在5000RPM农杆菌过夜培养。
7. 在1升悬浮农杆菌渗透介质颗粒（升）（10MM氯化镁_2，5％的蔗糖，0.44mM 6 benzyladenine（BA），0.3％silwet L - 77，1X Gamborg的维生素解决方案和灭菌水）。媒介并不需要进行高压灭菌，但需要作出新鲜。成菜（如8“X15”X2“硼硅玻璃盘），倒入1升含农杆菌渗透介质。
8. 反转锅（植物不会脱落）和渗透液浸所有的植物地上部分，一锅煮5分钟举行一次。虽然植物的地上部分是渗透液中浸泡，避免让土壤浸泡渗透媒体，以减少对土壤真菌生长的机会。
9. 浸渍后，放在几层纸巾蘸盆就在自己身边，在一个托盘。纸巾浸泡渗透媒体的访问量。封面用保鲜膜，以确保高湿度的托盘。放置到植物生长室的托盘。
10. 翌日，除去保鲜膜和纸巾，和地方盆直立。不要将这些植物的水为四，五个多天。之后，维持植物正常，直到他们种子，并收集散装种子。
11. MS培养基中含有50微克/ ml卡那霉素（重量2.2克Murashige和Skoog不含维生素基底盐倒入板（150x15mm培养皿），1M氢氧化钠溶解在500毫升的水，pH值至5.8，加4革兰氏琼脂，高压灭菌，冷却和添加卡那霉素50μg/ ml的终浓度）。板都保持在4℃直至需要。
12. 要选择抗生素耐药性的转基因植物，需要至少20000种子屏幕。 0.1克约5000种子。重量和估计的金额的种子。
13. 他们用70％乙醇30秒15毫升猎鹰管清洗消毒种子。用无菌水冲洗种子一次。包含商店买来的，5％漂白水（Clorox公司）1:10稀释的溶液中浸泡30秒的种子。无菌水冲洗3至6倍的种子。在无菌罩，吸管约5000到每个MS板（卡那霉素）的种子，传播的种子均匀板，微孔3M胶带密封板，以避免污染。
14. 孵育板在4 ° C在3-4天的黑暗，然后转板一腔（可能是相同的植物生长室）。经过约14天，转基因苗保持绿色，但非转基因​​的脸色苍白，奄奄一息。放缓拉根从中长期放置在土壤中，转基因苗转移到土壤。

二。检查pTSO2：：GUS表达模式

1. 收获pTSO2：：GUS转基因苗，他们在寒冷的90％丙酮在玻璃闪烁瓶或离心管保存在冰上。聚苯乙烯微孔板（聚丙烯），也可以使用，如果有大量的样品进行分析。
2. 所有样品都收获后，在室温下放置20分钟的小瓶。在这段时间内没有X - Gluc（0.2％Triton X - 100，50mm的NaHPO PH7.2缓冲_4，2MM亚铁氰化钾，2MM钾铁氰化钾），并置于冰上新鲜的染色缓冲。
3. 从样本中删除丙酮和添加染色缓冲。
4. X - Gluc染色的溶液（0.2％的Triton X - _100，4 NaHPO 50mm的缓冲液PH7.2，2MM钾亚铁氰化物，2mm的铁氰化钾，采用2mm x - gluc） 。从样品中取出染色缓冲和添加样品含有X - Gluc染色缓冲。
5. 下15至20分钟的真空渗透的样品。慢慢松开真空和验证，所有样品染色溶液的表面之下下沉。如有必要，重复，直到所有样本下沉渗透，被释放后的真空。
6. 孵育在37 ° C与X - Gluc染色缓冲过夜。
7. 从孵化器中取出样品取出染色缓冲。在连续乙醇系列清洗样品在室温（20％，35％和50％的乙醇）改变每次30分钟。
8. 在FAA固定液（50％乙醇，5％的甲醛，10％的醋酸，其余水）为30分钟，在室温下的组织修复。删除美国联邦航空局（FAA）​​和添加70％的乙醇。此时组织可配备一台数码相机在解剖显微镜下可视化和拍照。深蓝色的颜色表示 TSO2是表示（图1） 。另外，组织可存放在4 ° C以供日后观赏。
   
   
   图1 pTSO2：：GUS 基因在转基因苗（一），（二）侧根，并根尖（C）。请注意，TSO2发起人是非常年轻和分裂组织中的积极。 （C）所示的零星的表达模式是在特定的细胞周期基因表达的典型。

代表性的成果

如果做得正确，转化效率约为0.1-0.2％。换句话说，应该得到筛查每5000种子5-10转基因苗。平均，约100个​​转基因株系可转化野生型植株的4盆。

对于转基因苗含有pTSO2：：GUS基因构建^3，深蓝色的色调反映了GUS活性，是在积极的分裂中的细胞，包括嫩叶，茎尖，根尖和侧根原基（图1）。非均匀的零星模式的特点是细胞周期阶段的具体体现。

转化效率是由许多不同的因素，下面讨论的：

1. 植物的健康和他们的年龄是最重要的。约一个月的老厂生产大量未成熟的花芽，是理想的。修剪主芽，以鼓励中学改造前3-4天拍摄形成会增加转化效率。老厂将产生转化，但在较低的利率。
2. 生育的植物是重要的。如果一个人改造与生育率下降的突变体，植物将需要更多的浸渍。
3. 0.3％Silwet L - 77渗透缓冲区中的表面活性剂被认为是必不可少的。
4. 渗透媒体浸泡时间应至少5分钟。
5. 为了减少真菌污染，应采取一些预防措施。首先，需要浇水的植物/土壤渗透前一天浸泡渗透介质，以避免土壤。不要淹没的土壤渗透媒体。其次，在24小时内删除渗透，以减少水分后的塑料盖和纸巾。第三，不要自来水厂，直到渗透后5天。

根据特定的质粒构建，转基因植物的选择方法可能有所不同。如果一个质粒载体进行大律师公会（bialaphos乙酰转移酶）标记基因抗草胺膦，可以直接种植在土壤中的种子，没有任何消毒种子。一个然后喷洒1:1000稀释草胺膦（商品名：终曲，自由，或Ignite）的幼苗每隔几天来选择抗苗。

GUS染色，重要的是要在丙酮在冰上收获的组织和所有的解决方案保持冷，以避免任何退化。和没有X - Gluc染色缓冲区的需求，取得了新的，虽然可以为每个组件的股票解决方案和存储时间提前（见下文）。亚铁氰化钾和赤血是有毒的，应谨慎处理。此外，它非常重要孵化组织在37 ° C，因为该组织在与X - Gluc染色缓冲区超过1-2天就可以开始恶化和/或染色模式可能成为在漫长的孵化过于分散。最后，较高的含铁和亚铁氰化钾浓度，降低整体染色的水平，但更具体。采用2mm x - Glux作品对于大多数应用，但可能需要对某些需要调整的浓度。 X - Gluc是昂贵的。染色应在最短的卷进行。

股票可以提前解决方案：

10％的Triton X - 100（在室温下储存几个月）
0.5 M的NaHPO ₄缓冲液（PH7.2）（在室温下保存数个月）
100毫米亚铁氰化钾（存储在4 ° C几个月在黑暗中）
100毫米的铁氰化钾（保存在4 ° C几个月在黑暗中）
100毫米x - Gluc（5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基β- D -葡糖苷酸cyclohexamine盐）是在二甲基甲酰胺（DMF），并储存在-20 ° C包裹在锡箔管。它持续了好几个月。

我们感谢春新王建设pTSO2：：GUS和图1，德特勒夫威格尔的照片分享有益的意见的GUS万无一失的协议，帕哈Sijacic和考特尼荷伦德。 Z. L S实验室的研究是由美国国家科学基金会（IOB0616096和MCB0744752）的支持。 ZL是由美国马里兰大学农业试验站的部分支持。