Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

Questo articolo illustra la floreali-dip metodo di Agrobacterium tumefaciens-Mediata trasformazione del Arabidopsis thaliana. Con l'introduzione di un ciclo cellulare regolata promotore-reporter, PTSO2:: β-glucuronidasi (GUS), In Arabidopsis, Ci illustra come si rileva giornalista espressione GUS in piantine transgeniche.

La possibilità di introdurre geni estranei in un organismo è il fondamento della biologia moderna e le biotecnologie. Nella pianta fiorita modello

I. floreale-dip trasformazione di Arabidopsis thaliana

1. Circa 1 mese prima trasformazione, seminare i semi di Arabidopsis sul 4-8 pentole (5 vasi pollice quadrato), con circa 10-15 piante per vaso. Per gli impianti con la fertilità normale, 4 vasi di piante per costruire plasmide sarà sufficiente. Se uno ha a trasformare Arabidopsis mutante con riduzione della fertilità, aumentare il numero di vasi di conseguenza.
2. Le piante sono coltivate in condizioni standard (16 ore di luce e 8 ore al buio a 22 ° C). Se le piante sono coltivate in brevi giorno o abbassare la temperatura, che richiederà più tempo a fiorire e più tempo per essere pronti per la trasformazione. La cura delle piante buona volontà assicurare piante sane, che sono essenziali per la trasformazione di successo.
3. Quando le piante hanno appena cominciato a imbullonati e fiori. Essi sono ora pronti per la trasformazione. Per aumentare l'efficienza della trasformazione, 3-4 giorni prima della trasformazione, tagliare i tralci principali infiorescenza non appena sono imbullonati per incoraggiare la formazione di scattare più secondario. Annaffiare le piante il giorno prima trasformazione. Questo assicura che il terreno non assorbire i media infiltrazione troppo durante floreali-immersione.
4. Due giorni prima della trasformazione, inoculare LB 40ml contenenti antibiotici appropriati (nel caso di pTSO2:: GUS, 50 mg / ml kanamicina) con Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 porta la pTSO2:: GUS costruire. La pTSO2:: GUS è clonato nel vettore pBIN20 che possiede gene nptII che conferisce resistenza alla kanamicina ^3. Crescere durante la notte in una agitazione incubatore a 28-30 ° C.
5. Il giorno seguente, 8ml trasferimento della cultura durante la notte in 400 ml di LB contenente 50 mg / ml kanamicina. Crescere durante la notte in una agitazione incubatore a 28-30 ° C.
6. Il giorno della trasformazione, quando il diametro esterno ₆₀₀ della cultura Agrobacterium raggiunge circa 0,8 (OD ₆₀₀ tra 0,5 a 1 sono accettabili), spin down la cultura Agrobacterium pernottamento per 8 minuti a 5000rpm.
7. Risospendere il pellet Agrobacterium in 1 L (litri) di media infiltrazione (10mM MgCl _2, 5% di saccarosio, 0.44mM 6-benziladenina (BA), 0,3% Silwet L-77, soluzione di vitamina 1x Gamborg s acqua e autoclave). Il mezzo non ha bisogno di essere sterilizzati in autoclave, ma deve essere fatta fresca. Versare la L 1 Agrobacterium contenente medio infiltrazione in un piatto (come 8 "x15" x2 "piatto di vetro Pyrex).
8. Invertire il vaso (piante non cadere) e tuffo tutte le parti aeree delle piante nella soluzione infiltrazione, tenere premuto per 5 minuti un piatto alla volta. Mentre tutte le parti aeree della pianta sono immersi nel mezzo infiltrazione, evitare di lasciare assorbire il terreno dei media infiltrazione per ridurre le possibilità di proliferazione di funghi sul terreno.
9. Dopo l'immersione, luogo immerso tutte le pentole al loro fianco in diversi strati di carta assorbente in un vassoio. I tovaglioli di carta assorbire quantità accesso dei mezzi di infiltrazione. Coprire il vassoio con pellicola trasparente per assicurare elevata umidità. Collocare il vassoio in camera di crescita delle piante.
10. Il giorno seguente, rimuovere l'involucro di plastica e tovaglioli di carta, pentole e posto in posizione verticale. Non acqua queste piante per quattro o cinque più giorni. In seguito, mantenere le piante in genere fino a quando non impostare semi e raccogliere i semi alla rinfusa.
11. Versare nelle piastre (150x15mm capsula di Petri), con media MS contenente 50 mg / ml kanamicina (peso 2.2g Murashige e Skoog sale basale senza vitamina, sciogliere in 500 ml di acqua, il pH a 5,8 con NaOH 1M, aggiungere 4 grammi di agar, autoclave, fresco e aggiungere kanamicina a 50 mg / ml concentrazione finale). Le piastre sono tenuti in 4 ° C fino al momento dell'uso.
12. Per selezionare le piante transgeniche resistenti agli antibiotici, bisogna schermo 20.000 semi al minimo. 0,1 grammi è di circa 5000 semi. Peso e stimare la quantità di semi.
13. Sterilizzare i semi di lavarli in 15 ml di tubo Falcon con il 70% di etanolo per 30 secondi. Lavare i semi con acqua sterile una volta. Mettere a bagno i semi per 30 secondi in una soluzione contenente diluizione 1:10 del negozio-acquistato candeggina al 5% (candeggina). Sciacquare i semi con acqua sterile tre a sei volte. Nel cappuccio sterile, pipetta circa 5000 semi su ogni (kanamicina) piastra SM, diffondere i semi in modo uniforme sul piatto, sigillare le piastre con nastro adesivo 3M Micropore per evitare contaminazioni.
14. Incubare le piastre a 4 ° C al buio per 3-4 giorni, poi trasferire le piastre di una camera (potrebbe essere la stessa camera di crescita delle piante). Dopo circa 14 giorni, piantine transgeniche soggiorno verde ma la non-transgenico quelli si stanno rivolgendo pallido e morente. Trasferire le piantine transgeniche al suolo rallentando tirando le radici fuori dal mezzo e li pose nel suolo.

II. Esaminando pTSO2:: pattern di espressione GUS

1. Vendemmia pTSO2:: GUS piantine transgeniche e metterli in acetone freddo il 90% in un flacone di vetro o tubi di scintillazione microcentrifugache vengono tenuti in ghiaccio. Micropiastre di polistirene (non polipropilene) può essere utilizzato anche se si analizza un numero elevato di campioni.
2. Dopo che tutti i campioni vengono raccolti, posto le fiale a temperatura ambiente per 20 minuti. Durante questo periodo compongono tampone fresca colorazione senza x-Gluc (0,2% Triton X-100, 50mm NaHPO ₄ Buffer pH7.2, 2mM ferrocianuro di potassio, 2mM ferricianuro di potassio) e posto sul ghiaccio.
3. Rimuovere acetone dai campioni e aggiungere la soluzione tampone colorazione.
4. Make up x-Gluc soluzione colorante (0,2% Triton X-100, 50mm NaHPO ₄ Buffer pH7.2, Potassio Ferrocianuro 2mM, 2mM ferricianuro di potassio, 2mm x-Gluc). Rimuovere il tampone colorazione da campioni e aggiungere la soluzione tampone contenente colorazione x-Gluc ai campioni.
5. Infiltrati i campioni sotto vuoto per 15 a 20 minuti. Rilasciare lentamente il vuoto e verificare che tutti i campioni affondare sotto la superficie della soluzione colorante. Se necessario, ripetere l'infiltrazione fino a quando tutti affondare campioni dopo il vuoto è stato rilasciato.
6. Campioni incubare a 37 ° C per una notte nel buffer di colorazione con x-Gluc.
7. Rimuovere i campioni da incubatore e rimuovere buffer di colorazione. Lavare i campioni in serie successive di etanolo (20%, 35% e 50% di etanolo) a temperatura ambiente per 30 minuti ogni modifica.
8. Fissare i tessuti in FAA fissativo (50% etanolo, 5% di formaldeide, 10% di acido acetico, acqua riposo) per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere FAA e aggiungere etanolo al 70%. A questo punto i tessuti possono essere visualizzati e fotografato con un microscopio da dissezione dotato di una fotocamera digitale. Un colore blu scuro indica dove TSO2 è espressa (Figura 1). In alternativa, i tessuti possono essere conservati a 4 ° C per una visione successiva.
   
   
   Figura 1 pTSO2:.: Espressione di GUS in piantine transgeniche (A), radici laterali (B), e la punta della radice (C). Si noti che TSO2 promotore è molto attivo nei tessuti giovani e dividendo. Il pattern di espressione sporadici in (C) è tipica di geni espressi in specifiche fasi del ciclo cellulare.

Rappresentante Risultati

Se fatto correttamente, l'efficienza della trasformazione dovrebbe essere di circa 0,1-0,2%. In un'altra parola, si dovrebbe avere 50-10 piantine transgeniche attraverso lo screening ogni 5000 semi. In media, circa 100 linee transgeniche può essere ottenuto trasformando 4 vasi di piante wild-type.

Per le piantine transgeniche contenenti il pTSO2:: GUS costruire ^3, colore blu scuro che riflette l'attività GUS si trova nelle cellule in divisione attiva tra giovani foglie, all'apice sparare, punta della radice, e laterale radice primordi (Figura 1). La non uniforme modello sporadiche è caratteristico del ciclo cellulare fase-specifici espressione.

L'efficienza di trasformazione è determinato da molti fattori diversi, che sono discussi di seguito:

1. La salute delle piante e la loro età sono di primaria importanza. Circa un mese impianti di produzione di numerose gemme floreali immaturi sono l'ideale. Taglio fuori spara primario di incoraggiare secondaria giornate di formazione sparare 3-4 prima della trasformazione aumenterà l'efficienza della trasformazione. Vecchi impianti darà origine a trasformanti ma ad un tasso inferiore.
2. Fertilità delle piante è importante. Se uno ha a trasformare i mutanti con riduzione della fertilità, le piante molto di più sarà necessario per immersione.
3. 0,3% Silwet L-77 tensioattivo in tampone di infiltrazioni è considerato essenziale.
4. Immersione tempo nei media infiltrazione deve essere di almeno 5 minuti.
5. Per ridurre la contaminazione da funghi, alcune precauzioni dovrebbero essere prese. In primo luogo, bisogna evitare il suolo da assorbire infiltrazione da parte dei media innaffiare le piante / suolo un giorno prima infiltrazione. Non immergere il suolo nei media infiltrazione. In secondo luogo, rimuovere il coperchio di plastica e tovagliolo di carta entro 24 ore dopo l'infiltrazione per ridurre l'umidità. In terzo luogo, non fanno le piante d'acqua fino a 5 giorni dopo l'infiltrazione.

A seconda del costrutto specifico plasmide, i metodi di selezione di piante transgeniche possono variare. Se un vettore plasmide porta il Bar (bialaphos acetil-transferasi) gene marcatore di resistenza conferendo al glufosinato ammonio, si possono piantare i semi direttamente nel terreno senza alcuna sterilizzazione dei semi. Uno spray poi le piantine con glufosinate ammonio diluito 1:1000 (nome commerciale: Finale, Liberty, o Ignite) una volta ogni pochi giorni per selezionare per piantine resistenti.

Per la colorazione GUS, it s importante per la raccolta di tessuto in acetone su ghiaccio e tenere tutte le soluzioni a freddo per evitare il degrado. Il buffer di colorazione con e senza X-Gluc deve essere resa fresca, anche se la soluzione di riserva per ogni componente può essere effettuato e conservato in anticipo (vedi sotto). Ferrocianuro di potassio ferricianuro e sono tossici e devono essere maneggiati con cura. Inoltre, s importante non incubare il tessuto a 37 ° C nel buffer di colorazione con X-Gluc per più di 1-2 giorni perché il tessuto può iniziare a deteriorarsi e / o il pattern di colorazione può diventare troppo diffuso nel corso della lunga incubazione . Infine, una maggiore concentrazione di ferri e ferrocianuro di dare più basso livello generale la colorazione, ma una maggiore specificità. 2mM X-Glux funziona bene per la maggior parte delle applicazioni, ma la concentrazione può essere necessario regolare per diverse necessità. X-Gluc è costoso. La colorazione deve essere effettuata in quantità minima.

Le soluzioni di riserva che può essere fatta prima del tempo:

10% di Triton X-100 (conservato a temperatura ambiente per diversi mesi)
0,5 M NaHPO ₄ Buffer (pH7.2) (conservato a temperatura ambiente per diversi mesi)
100 mM ferrocianuro di potassio (conservare al buio a 4 ° C per diversi mesi)
100 mM di ferricianuro di potassio (Conservare al buio a 4 ° C per diversi mesi)
100 mm x-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronide sale cyclohexamine) è fatto in dimetilformammide (DMF) e conservati in -20 ° C in tubi di carta stagnola avvolto. E 'dura per diversi mesi.

Ringraziamo Chunxin Wang per la costruzione di pTSO2:: GUS e per le foto in figura 1, Detlef Weigel per la condivisione del GUS-infallibile protocollo, Paja Sijacic, e Courtney Hollender per gli utili commenti. La ricerca in laboratorio, Z. L s è supportato dal US National Science Foundation (IOB0616096 e MCB0744752). ZL è parzialmente supportata dalla University of Maryland Stazione esperimento agricola.