Gramfärbung von Bakterien aus Umweltquellen

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Das Spektrum der Forschung in Umweltmikrobiologie ist in Umfang und Anwendungspotenzial breit. Ob die Arbeit Tischwaage mit bekannten bakterielle Isolate oder im Feld mit unbekannten bakterielle Isolate Probenahmen Boden oder Wasser, bleibt die Möglichkeit, schnell und visuell erkennen kultivierbare Populationen von Interesse von großer Tragweite zu ökologischen Mikrobiologen auch heute noch mit der Fülle der molekularen Techniken zur Verfügung. Dieses Video zeigt eine solche Technik, bekannt als Gramfärbung.

Die Gram-Färbung ist eine klassische und wichtig Färbung Technik, die bleibt von ökologischen Mikrobiologen eingesetzt. Ähnlich wie bei einem einfachen Fleck, ermöglicht es für die Beurteilung der Bakterienzelle Morphologie (z.B., Kokken, Stäbchen, Spore-Spanten), Größe und Anordnung (z.B., Ketten oder Cluster). Darüber hinaus ermöglicht es zur Differenzierung von Bakterien in zwei grundsätzlich verschiedene Gruppen — gramnegative und grampositive – je nach Zusammensetzung der Zellwand und Struktur (Abbildung 1).

Gramfärbung ist ein mehrstufiger Prozess. Vor der Färbung, mit einer Platte, schräge oder Brühe Kultur ein bakterieller Abstrich zubereitet. Die Abstrich Prep wird getrocknet und auf einen sauberen Objektträger fixiert. Ein primäre Fleck von Kristallviolett wird dann auf die fixe Abstrich angewendet. Kristallviolett ist, dass ein grundlegende Fleck bestehend aus positiv gefärbte Ionen (d.h. Chromophore) aufgeladen, die schwache ionische Bindungen mit negativ geladenen funktionellen Gruppen anwesend in der bakteriellen Zellwand zu bilden. Nach dem sanft spülen der Folie mit Wasser, Gram Jod wird angewendet und bildet unlösliche komplexe mit der Kristallviolett in der Zellwand. Kristallviolett-Jod-komplexen weiter binden mit Peptidoglycane, grundsätzlich Bestandteil des bakteriellen Zellwände. Nach einer zweiten Wasserspülung wird ein Aufhellung Agent kurz dem Abstrich angewendet. Für Gram-negativen Bakterien ist der Kristallviolett-Jod-Komplex während der Aufhellung Schritt mit Gram-positiven Bakterien, die Beibehaltung des lila Flecks weggespült. Eine dritte und letzte Wasserspülung folgt eine Gegenfärbung Safranin, die Gram-negativen Bakterien, rosa oder rot färbt.

Abbildung 1. Vergleich der Zellwand grampositive und gramnegative Bakterien.

1. die Probenahme

1. Bodenprobe und Transport in das Labor zur mikrobiellen Analyse zu sammeln.
2. Wiegen Sie im Labor eine 10 g Probe mit einer Analysenwaage.
3. Verdünnen der Probe 01:10 in 95 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (10 Teile Boden entspricht 5 Teile wässrige Flüssigkeit), und Vortex mischen (Abbildung 2, Schritt 1).
4. Führen Sie nachfolgende 01:10 Verdünnungen bis mindestens 10^-5 g Boden pro mL und Ausbreitung-Platte Verdünnungen in Wiederholungen von zwei oder drei auf eine niedrige Nähragar Medium (z. B.R2A) ausgewählt (Abbildung 2, Schritt 2 - 3).
5. Inkubieren Sie die Platten für eine Woche bei Raumtemperatur (Bild 2, Schritt 4).
6. Wählen Sie ein oder zwei Kolonien für Isolation und Streifen auf frischen Agarplatten (Abbildung 3, Schritte 1-3).
7. Inkubieren Sie die Streifen-Platten für zwei bis drei Tage bei Zimmertemperatur (Abbildung 3, Schritt 4).

2. Vorbereitung des bakteriellen Abstrich

1. Beobachten Sie die Streifen-Platten für isolierte Kolonien.
2. Für die Vorbereitung jeder Abstrich Prep, Tauchen eine Impfkeimen Schleife in Ethanol, Flamme-sterilisieren, und legen Sie 1 bis 2 Loopfuls von sterilem destilliertem Wasser in die Mitte des vorgereinigten Objektträger.
3. Sterilisieren Sie die Impfkeimen Schleife wieder wie zuvor beschrieben. Sobald Sie abgekühlt, entfernen Sie eine kleine Menge der Kultur aus einer einzigen isolierten Kolonie und mischen Sie es mit den Wassertropfen auf der Folie (der Abstrich sollte verdünnte Magermilch ähneln). Die Impfkeimen Schleife muss vor der Kolonie isoliert gekühlt werden. Eine Schleife, die zu heiß ist verursacht die Kolonie und/oder Medium, splatter, Aerosolization von Bakterien führen. In der Regel, wenn die Schleife zu heiß für den Einsatz ist, ein "Zischen" ertönt wenn Agar oder Kolonie angewendet. Unsachgemäße Kühlung der Schleife kann auch weniger effiziente Übertragung der Kultur-Folie und Verzerrung der Zellmorphologie führen.
4. Der Abstrich auf die Oberfläche der Folie messen ca. 2,5 cm x 2,5 cm, verteilt und lassen Sie es an der Luft trocknen. Es ist wichtig für die Lufttrocknung unter Laminar-Flow-Bedingungen auftreten. Folien sollten nicht um den Abstrich stören nicht zu trocken geblasen werden. Auch darf Folien Flamme getrocknet, um Zellmorphologie halten.
5. Nach dem Trocknen Hitze fixieren den Abstrich indem man der Folie schnell durch eine Flamme 2-3 X. Die Folie sollte nicht stationär in der Flamme, um Verzerrung Zellmorphologie und Beschädigungen auf den Objektträger zu verhindern gehalten werden.

(3) Gramfärbung

1. Befestigen Sie die Folie an einem Ende mit einem sauberen Wäscheklammer.
2. Decken Sie den Abstrich mit Kristallviolett (Primärfärbung) und halten Sie für 2 bis 3 Minuten.
3. Objektträger mit destilliertem Wasser sorgfältig abspülen. Der Wasserstrahl sollte nicht auf den Abstrich gerichtet werden, zur Vermeidung von Schäden und/oder Loslösung von den Objektträger.
4. Der Abstrich mit Gram Jod zu decken und 2 min. lang halten, dann vorsichtig die Folie mit Wasser spülen.
5. Bleichmittel der Abstrich mit 95 % Ethanol bis Fleck nicht mehr aus der Folie wäscht (Dies dauert in der Regel nicht mehr als 20 s je nach Stärke der Abstrich), dann sofort mit destilliertem Wasser abspülen. Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung über Entfärbung der Folie, was zu einer falschen Gramm Fleck Bezeichnung (z. B. Gramm-Variable) führen kann.
6. Der Abstrich der Gegenfärbung (Safranin) hinzu und halten Sie für 30 s. Dann sanft die Folie mit destilliertem Wasser abspülen und mit Küchenpapier trocken tupfen.

(4) mikroskopische Beobachtung der Folien

1. Beobachten Sie die Folien mit niedrigen (z.B.4 X oder 10 X), hoch-trocken (z.B.40 X) und Öl-Immersion (100 X) Ziele. Fügen Sie für Ölimmersion das Öl direkt auf den Abstrich.
2. Für repräsentative Ergebnisse der grampositive und gramnegative Bodenbakterien siehe Abbildungen 4 und 5.

Abbildung 2: Verdünnung und Spread-Plating-Technik. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Kolonie Isolation mit der Streak-Plate-Technik.

Abbildung 4. Grampositiven Bodenbakterium Staphylococcus aureus .

Abbildung 5. Gram-negatives Bodenbakterium Escherichia coli.

Die Gram-Färbung ist in vielen Teilbereichen der Umwelt- und klinische Mikrobiologie verwendet. Wasser Qualität Wissenschaftler können die Gram-Färbung als bestätigende Werkzeug zur Erkennung von fäkalen Bakterien in Wasserproben. Bakterielle Isolate aus Böden sind Gram gefärbt um weitere kultivierbare Erde Gemeinschaften zu charakterisieren. Für ökologische Mikrobiologen Gramm Fleck hilft bei der Kategorisierung der Bakterienpopulationen nach Zellwandstruktur. Dies wiederum liefert Informationen über die allgemeine Fähigkeit einer bestimmten mikrobiellen Gemeinschaft Austrocknung und andere ökologische Belastungen standhalten. Kenntnis der Gramm-Fleck-Bezeichnung ist auch von Bedeutung in der Forschung und Entwicklung von Desinfektions- und anderen Antibiotika, wie Gram-positiven Bakterien sind in der Regel widerstandsfähiger gegen Inaktivierung von bestimmten Chemikalien als Gram-negativen Bakterien.

Für klinische Mikrobiologie Anwendungen wird der Gram-Färbung zur Bestätigung der Identität des bakteriologischen Krankheit-Agenten zusammen mit traditionellen Diagnoseverfahren. Es ist auch sehr hilfreich bei der Kultivierung fehlgeschlagen ist, oder ist keine Option. Gramfärbung von klinischen Proben kann ätiologische Substanzen enthalten, die kann sonst nicht beobachtet worden.