Coloration de Gram des bactéries provenant de sources environnementales

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner

Le spectre de la recherche en microbiologie environnementale est large dans la portée et l’application potentielle. Que le travail soit de laboratoire avec des isolats bactériens connus, ou en matière de prélèvement d’échantillons de sol ou d’eau contenant des isolats bactériens inconnus, la capacité de rapidement et visuellement discerner les populations cultivables d’intérêt reste très importante pour les microbiologistes environnementaux encore aujourd'hui avec l’abondance des techniques moléculaires disponibles pour utilisation. Cette vidéo démontrera une telle technique, appelée coloration de Gram.

La coloration de Gram est une classique et importante technique de coloration qui reste largement utilisée par les microbiologistes environnementaux. Semblable à une tache simple, il permet pour l’évaluation de la morphologie de la cellule bactérienne (p. ex., cocci, tiges, spore-formeurs), taille et disposition (p. ex., chaînes ou clusters). En outre, il permet à la différenciation des bactéries en deux groupes distincts de principe — Gram négatif et Gram positif — selon la composition de la paroi cellulaire et de la structure (Figure 1).

Coloration de Gram est un processus en plusieurs étapes. Avant la coloration, un frottis bactérien est préparé à l’aide d’une plaque, oblique ou bouillon de culture. La préparation de frottis est séchée et fixée sur une lame de verre propre. La tache principale de violet de gentiane est ensuite appliquée au frottis fixé. Violet de gentiane est une tache de base composée de positivement chargé ions colorées (c.-à-d. les chromophores) qui forment des liaisons ioniques faibles avec la chargés négative des groupes fonctionnels présents dans la paroi cellulaire bactérienne. Après avoir doucement la lame avec de l’eau de rinçage, iode de Gram est appliqué et forme des complexes insolubles avec le violet de gentiane dans la paroi cellulaire. Les complexes de violet de gentiane-iode plus lient avec peptidoglycane, un composant de principe des parois des cellules bactériennes. Suite à un deuxième rinçage à l’eau, un agent de décoloration est brièvement appliqué pour le frottis. Pour les bactéries à Gram négatif, le complexe de violet de gentiane-iode est emporté durant l’étape décoloration, avec des bactéries Gram-positives, conservant la tache pourpre. Un troisième et dernier rinçage est suivi d’un contre-colorant de safranine qui colore les bactéries Gram-négatives roses ou rouges.

La figure 1. Comparaison de la paroi cellulaire des bactéries Gram-positives et Gram-négatives.

1. le prélèvement

1. Recueillir des échantillons de sol et le transport au laboratoire pour analyse microbienne.
2. Dans le laboratoire, peser un échantillon de 10 g à l’aide d’une balance analytique.
3. Diluer l’échantillon 01:10 dans 95 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (10 pièces sol équivaut à 5 parties liquide aqueux) et vortex de mélanger (Figure 2, étape 1).
4. Effectuer ultérieures 01:10 sur le sol des dilutions jusqu'à au moins 10^-5 g / mL, et plaque de propagation sélectionné dilutions dans réplicats de deux ou trois sur un milieu gélose nutritive faible (p. ex., R2A) (Figure 2, les étapes 2 - 3).
5. Incuber les boîtes pendant une semaine à température ambiante (Figure 2, étape 4).
6. Sélectionnez une ou deux colonies pour l’isolement et ensemencer sur plaques de gélose fraîche (Figure 3, les étapes 1-3).
7. Incuber les boîtes de strie pendant deux ou trois jours à température ambiante (Figure 3, étape 4).

2. préparation des frottis bactériennes

1. Observer les plaques strie des colonies isolées.
2. Pour préparer chaque préparation de frottis, trempez une boucle inoculer dans l’éthanol, flamme-les stériliser et placer 1 à 2 anses d’eau distillée stérile vers le centre de lames de verre préalablement nettoyé.
3. Stérilisez la boucle inoculer à nouveau comme décrit précédemment. Une fois refroidi, prélever une petite quantité de la culture d’une seule colonie isolée et mélangez-le avec les gouttelettes d’eau sur la lame (le frottis doit ressembler à du lait écrémé dilué). La boucle à inoculation doit être refroidie avant l’isolement de la colonie. Une boucle qui est trop chaude qui entraîne la colonie et/ou moyen pour éviter les éclaboussures, qui peut conduire à l’aérosolisation de bactéries. En règle générale, lorsque la boucle est trop chaude pour une utilisation, un « sifflement » sera entendu lorsque appliqué à la gélose ou colonie. Un refroidissement de la boucle peut entraîner également au transfert de la culture-pour-slide moins efficace et les distorsions de la morphologie cellulaire.
4. Etaler le frottis sur la surface de la lame mesure environ 2,5 cm x 2,5 cm et laisser sécher à l’air. Il est important pour l’air de séchage pour se produire dans des conditions d’écoulement laminaire. Diapositives pas devraient être soufflés sec de manière à ne pas perturber le frottis. En outre, diapositives ne doivent pas être séchées flamme, afin de maintenir la morphologie cellulaire.
5. Après séchage, chaleur fixer le frottis en passant les glissent rapidement dans une flamme 2-3 x. La diapositive ne devrait pas être tenue stationnaire dans la flamme, pour éviter des distorsions de la morphologie cellulaire et/ou de dommages à la lame de verre.

3. coloration de gram

1. Fixez la lame à une extrémité à l’aide d’une pince à linge propre.
2. Recouvrir le frottis avec cristal violet (colorant primaire) et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 min.
3. Laver soigneusement la lame avec de l’eau distillée. Le jet d’eau ne devrait pas être dirigé contre le frottis afin d’éviter des dommages et/ou au décollement de la lame de verre.
4. Recouvrir le frottis à l’iode de Gram et maintenez pendant 2 min, puis rincer doucement la lame avec de l’eau.
5. Décolorer le frottis à l’aide d’éthanol à 95 % jusqu'à ce que la tache se lave n’est plus de la lame (cela prend généralement pas plus de 20 s selon l’épaisseur du frottis), puis rincer immédiatement avec de l’eau distillée. Cette étape est essentielle pour éviter une décoloration de la diapositive, qui peut conduire à une fausse gramme tache désignation (c.-à-d., Gram variable).
6. Ajouter le contre-colorant (safranine) pour le frottis et maintenez-le enfoncé pendant 30 s. Puis rincer doucement la lame avec de l’eau distillée et éponger avec du papier absorbant.

4. microscopique Observation de diapositives

1. Observer les diapositives à l’aide de basse (par exemple, 4 X ou 10 X), haute-sèche (par exemple, 40 X), mais les objectifs à immersion (100 X) d’huile. Pour immersion dans l’huile, ajouter l’huile directement sur le frottis.
2. Pour obtenir des résultats représentatifs de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, voir Figures 4 et 5.

Figure 2. Dilution et Technique de propagation-Plating. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. Isolement de colonie en utilisant la Technique de plaque Streak.

Figure 4. Bactérie Gram-positive de sol Staphylococcus aureus .

Figure 5. Bactérie Gram-négative de sol Escherichia coli.

La coloration de Gram est utilisée dans les nombreux sous-champs de la microbiologie environnementale et clinique. Les scientifiques de qualité de l’eau peuvent utiliser la coloration de Gram comme outil de confirmation pour la détection des bactéries fécales dans les échantillons d’eau. Les isolats bactériens provenant de sols sont Gram coloré afin de caractériser davantage les communautés du sol cultivable. Pour les microbiologistes environnementaux, coloration de Gram sida dans la catégorisation des populations bactériennes selon la structure de la paroi cellulaire. Ceci, à son tour, fournit des informations sur la capacité générale d’une communauté microbienne donnée pour résister à la dessiccation et autres facteurs de stress environnementaux. Connaissance de la désignation de coloration de Gram est également d’importance dans la recherche et le développement des produits désinfectants et autres antimicrobiens, comme les bactéries Gram-positives ont tendance à être plus résistant à l’inactivation par des propriétés chimiques particulières que les bactéries Gram-négatives.

Pour les applications de la microbiologie clinique, la coloration de Gram est utilisée pour confirmer l’identité des agents bactériologiques de la maladie ainsi que les méthodes traditionnelles de diagnostic. Il est aussi très utile quand la culture n’a pas, ou n’est pas une option. Coloration de Gram des échantillons cliniques peut révéler la présence d’agents étiologiques qui pas a pu être observée dans le cas contraire.