Melhoramento por Design para Arroz Funcional com Tecnologias de Edição de Genoma

O protocolo descreve a criação de variedades de arroz para amido resistentes por design usando tecnologias de edição de genoma de maneira precisa, eficiente e tecnicamente simples.

As abordagens convencionais para o melhoramento de culturas, que dependem predominantemente de métodos demorados e trabalhosos, como hibridização tradicional e melhoramento por mutação, enfrentam desafios na introdução eficiente de características direcionadas e na geração de diversas populações de plantas. Por outro lado, o surgimento de tecnologias de edição de genoma deu início a uma mudança de paradigma, permitindo a manipulação precisa e rápida de genomas de plantas para introduzir intencionalmente as características desejadas. Uma das ferramentas de edição mais difundidas é o sistema CRISPR/Cas, que tem sido usado por pesquisadores para estudar importantes problemas relacionados à biologia. No entanto, o fluxo de trabalho preciso e eficaz da edição do genoma não foi bem definido no melhoramento de culturas. Neste estudo, demonstramos todo o processo de melhoramento de variedades de arroz enriquecido com altos níveis de amido resistente (AR), uma característica funcional que desempenha um papel crucial na prevenção de doenças como diabetes e obesidade. O fluxo de trabalho abrangeu várias etapas importantes, como a seleção do gene SBEIIb funcional, o design do RNA de guia único (sgRNA), a seleção de um vetor de edição de genoma apropriado, a determinação do método de entrega do vetor, a realização de cultura de tecidos vegetais, a mutação de genotipagem e a análise fenotípica. Além disso, o prazo necessário para cada etapa do processo foi claramente demonstrado. Este protocolo não apenas agiliza o processo de melhoramento, mas também aumenta a precisão e a eficiência da introdução de características, acelerando assim o desenvolvimento de variedades funcionais de arroz.

O melhoramento tradicional depende da introdução de características nas culturas ou da produção de populações de plantas com variação suficiente, o que requer observação de campo de longo prazo ^1,2. Devido às limitações do melhoramento tradicional, foi desenvolvida a tecnologia de edição de genes, que pode modificar com precisão o genoma das culturas para obter as características desejadas das populações de plantas³. O sistema de edição de genes mais amplamente utilizado em plantas é o CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), que depende de uma endonuclease guiada por RNA programável para criar quebras de fita dupla direcionadas (DSBs) no DNA ^4,5. Esses DSBs são então reparados pelos mecanismos naturais de reparo do DNA da célula ^6,7, muitas vezes resultando na introdução das alterações genéticas desejadas. Embora essa tecnologia tenha sido implementada em várias culturas, incluindo trigo⁸, milho⁹, soja¹⁰ e arroz¹¹, ela é predominantemente usada para revelar problemas biológicos. Em comparação com sua extensa aplicação na elucidação das funções dos genes das plantas, a pesquisa sobre a aplicação de tecnologias de edição de genes ao melhoramento de culturas permanece relativamente escassa¹².

O processo de edição de genes em culturas normalmente segue um fluxo de trabalho bem definido que abrange várias etapas importantes¹³. O primeiro passo envolve a identificação do gene específico ou região genética que precisa ser modificada para atingir a característica desejada. Em segundo lugar, uma estratégia de edição de genes é projetada, envolvendo a seleção de um sistema de edição de genes apropriado (por exemplo, CRISPR-Cas9 ou CRISPR-Cas12) e o design de RNAs guia específicos para direcionar a endonuclease para o local alvo. Em terceiro lugar, o sistema de edição de genes é então incorporado a um vetor de entrega, que é usado para introduzir o maquinário de edição nas células vegetais. Esses vetores podem ser complexos de DNA, RNA ou ribonucleoproteína (RNP). Posteriormente, os vetores de edição de genes são entregues às células vegetais usando vários métodos, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, bombardeio de partículas ou eletroporação. Imediatamente, as células vegetais transformadas são cultivadas em condições apropriadas para gerar calos geneticamente editados ou tecidos embriogênicos. Esses tecidos são então regenerados em plantas inteiras por meio de técnicas de cultura de tecidos. As plantas regeneradas são submetidas a rigorosa caracterização molecular para confirmar a presença das alterações genéticas desejadas.

Um artigo anterior de Tsakirpaloglou et ^al.14 fornece uma ampla visão geral do processo de edição de genes, desde o design do vetor até a geração de mudas editadas, mas não se aprofunda na análise detalhada de características específicas associadas ao gene alvo nem na avaliação subsequente do desempenho agronômico ou validação funcional das culturas editadas. Fomos além de simplesmente demonstrar a viabilidade de editar um gene no arroz. Nosso trabalho avalia de forma abrangente o impacto dessa edição nas características bioquímicas, moleculares e agronômicas das linhas de arroz editadas. Isso inclui a avaliação da composição do amido, um fator crítico que influencia a qualidade do grão e o valor nutricional, que não foi extensivamente explorado em estudos anteriores de edição de genes.

O amido de arroz normalmente consiste em ~ 20% de amilose e ~ 80% de amilopectina¹⁵. O SBEIIb é uma enzima essencial para a síntese de amilopectina e é expresso no endosperma¹⁶. O knockdown de OsSBEIIb pelo RNA hairpin (RNAi) e a expressão de microRNA aumentaram o teor de amido resistente^17,18. O amido resistente é um amido de substrato que não pode ser digerido e absorvido no intestino delgado, mas pode ser decomposto em ácidos graxos de cadeia curta e gases por certas bactérias digestivas nos intestinos. Como não pode ser decomposto rapidamente, tem um índice glicêmico mais baixo em comparação com outros amidos e não causa um rápido aumento do açúcar no sangue em um curto período de tempo após a ingestão, o que pode aliviar o diabetes até certo ponto na dieta¹⁹. Além disso, o amido resistente tem funções mais fisiológicas, como reduzir a resposta à insulina, regular a função intestinal, prevenir o acúmulo de gordura, facilitar o controle de peso e promover a absorção de íons minerais. Portanto, está sendo amplamente perseguida como um novo tipo de fibra alimentar²⁰.

Para superar esses desafios e utilizar com sucesso as tecnologias de edição de genes para o melhoramento de variedades de arroz funcionais, refinamos e otimizamos os protocolos operacionais do arroz. Nosso foco tem sido analisar meticulosamente o design dos loci de genes-alvo, selecionar cuidadosamente as ferramentas de edição de genes mais adequadas e realizar análises fenotípicas rigorosas durante todo o processo de melhoramento. Como prova do poder e eficiência dessas tecnologias, apresentamos um estudo de caso que mostra o rápido desenvolvimento de uma variedade de arroz funcional enriquecida com amido de alta resistência. Este exemplo ressalta o potencial da edição de genes na aceleração da criação de arroz funcional, abordando a atual escassez de pesquisas neste campo.

O estudo foi conduzido na Bellagen Biotechnology Co. Ltd na China, seguindo as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana. Antes de participar, o protocolo do estudo foi minuciosamente explicado aos sujeitos, que forneceram o consentimento informado.

1. Projetando sgRNA e vetor de construção (tempo de 5 a 7 dias)

NOTA: Um vetor binário foi usado para expressar o sistema CRISPR/Cas-SF01²¹. Não tem menos de 3 nucleotídeos (nt) incompatíveis com o potencial local fora do alvo para sgRNA. O adaptador de sgRNA precisa complementar a extremidade pegajosa, que é gerada pela digestão da enzima Bsa I do vetor de edição. A escolha do software foi baseada na alta eficiência e especificidade relatadas pelo software no arroz¹⁴, bem como em sua facilidade de uso e acessibilidade ao grupo de pesquisa.

1. Navegue até o site do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para recuperar o gene OsSBEIIb (LOC4329532) em Japonica. Baixe e acesse o genoma de referência no software SnapGene.
2. Analisar as inserções/deleções (InDel) e polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) na sequência de éxons de OsSBEIIb da variedade X134, comparando-a com o genoma de referência. Utilize o NCBI Primer Blast²² para projetar primers flanqueando as regiões dos éxons (Tabela Suplementar 1).
3. Para validar a sequência exon do gene OsSBEIIb em X134 por sequenciamento de Sanger, prepare a reação da seguinte forma: 10 μL de tampão de mistura de polimerase com 1 μL de primer direto, 1 μL de primer reverso, 1 μL de gDNA de tecidos X134 e 7 μL de água destilada. Execute o programa de PCR da seguinte forma: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) com 35 ciclos e 72 °C, 5 min.
4. Projete o sgRNA na sequência do exon OsSBEIIb de X134, aderindo ao protocolo de Tsakirpaloglou et ^al.14e garantindo que a sequência PAM seja TTN.
5. Modifique a sequência de sgRNA adicionando oligos -ACAC- na extremidade 5' do primer direto e adicionando oligos -GGCC- na extremidade 5' do primer reverso. Sintetize comercialmente os primers diretos/reversos (para sgRNA).
6. Dissolva os primers direto e reverso a uma concentração de 10 μmol / L, pegue 1 μL de cada um e adicione a 8 μL de tampão de recozimento (tampão Tris-EDTA + 50 mM NaCl) e misture por pipetagem. Coloque na máquina de PCR e execute o programa de recozimento da seguinte forma em uma máquina de PCR: processo de resfriamento lento de 95 °C a 16 °C a 0.1 °C/s.
7. Monte o sgRNA no vetor de edição do genoma. Prepare a reação da seguinte forma: 20 μL de tampão de mistura com 0,5 μL de T4 DNA ligase, 1 μL de Bsa I, 2 μL de tampão de restrição 10x, 2 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 2 μL de primers de recozimento, 2,5 μL de vetor (seu volume é ajustado para se ajustar à proporção) e 10 μL de água destilada. Em todos os casos, use uma proporção de 2:1 entre pastilha e vetor para obter eficiência de montagem. Execute o programa de montagem de PCR como (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) com 30 ciclos e 55 °C, 30 min.
8. Transforme o vetor resultante em células de E. coli conforme descrito²³.
9. Projete primers flanqueando o local de inserção do gRNA dentro do plasmídeo. Usando esses primers, execute a amplificação por PCR em colônias individuais para rastrear inserções bem-sucedidas. Realize o sequenciamento Sanger dos produtos de PCR para confirmar a clonagem bem-sucedida e isolar o plasmídeo²⁴.

2. Transformação de Agrobacterium (tempo de 4 dias)

1. Descongele a célula competente de EHA105 Agrobacterium no gelo. Adicione 1-2 μL de DNA plasmidial (contendo ~ 100-200 ng de DNA) à suspensão celular e misture suavemente.
2. Realize a transformação de choque térmico colocando o tubo no gelo por 5 min, nitrogênio líquido por 5 min, choque térmico a 37 ° C por 5 min e, em seguida, no banho de gelo por 5 min.
3. Adicione 700 μL de meio de peptona de extrato de levedura (YEP), sem antibiótico, ao tubo e misture suavemente. Recuperar as células numa incubadora agitada a 28 °C, 200-250 rpm, durante 2-3 h.
4. Centrifugue a cultura a 2.800 x g por 1 min. Descarte a maior parte do sobrenadante, deixando cerca de 100 μL, e ressuspenda as células. Espalhe as células em placas de ágar YEP contendo antibióticos a 1% (canamicina e rifampicina) para seleção de plasmídeos. Incubar a placa a 28 °C durante 24-48 h.
5. Risque a placa YEP (com resistências a antibióticos) com uma ponta de pipeta contendo uma única colônia de Agrobacterium que abriga o CRISPR / Cas e transfira as células para 5 mL de meio líquido YEP com antibióticos apropriados. Incubar o líquido a 28 °C durante 3 dias.
6. Armazene as cepas de Agrobacterium transformadas como estoques de glicerol a -80 °C para uso posterior.

3. Transformação do arroz por Agrobacterium (tempo de 3 meses)

NOTA: Vários métodos de transformação de plantas foram relatados para a entrega e expressão da sequência de DNA estranha na célula vegetal²⁵. Considerando a integração de cópia única e a baixa frequência de DSBs no genoma, a transformação mediada por Agrobacterium é o método de escolha para integrar o fragmento de DNA de expressão em cromossomos de arroz.

1. Realizar transformação mediada por Agrobacterium do arroz seguindo o protocolo em²⁵. Os calos em crescimento ativo (branco amarelado, relativamente seco e com 1-3 mm de diâmetro) são um ponto-chave para uma transformação eficiente. Descarte as sementes com desenvolvimento de mudas ou calo marrom antes de infectar o calo com Agrobacterium.

4. Genotipagem de plantas transgênicas e colheita de sementes (tempo de 8 meses)

NOTA: Duas gerações de arroz serão cultivadas para obter mutação homozigótica e linhagens estranhas livres de DNA.

1. Amostragem de tecido de mudas: Transplante as plantas transgênicas em vasos e cultive-as por 1 mês em uma estufa. Para testar o tipo de mutação, colete 2-3 mg de folhas frescas de cada perfilho de uma única muda e combine-as em uma única amostra.
2. Extração de DNA genômico: Siga um protocolo estabelecido para extração de DNA do genoma da planta²⁶.
3. Projetando os primers de mutação (Tabela Suplementar 1): Projete primers de PCR para amplificar a região do gene SBEIIb ao redor do local alvo do sgRNA¹⁴. O fragmento amplificado tem 493 pb de comprimento.
4. Genotipagem da mutação: Sequenciar os fragmentos de PCR diretamente ou cloná-los em um vetor de clone T e sequenciar usando o método de Sanger para identificar mutações¹⁴.
5. Colhendo sementes: Escolha as linhas E0 exibindo mutações homozigóticas de mudança de quadro e plante-as em uma estufa para obter sementes.
6. Projetando os primers para identificar o T-DNA: Projete três primers específicos para o de higromicina, UBI e de Cas da construção para identificar linhas estranhas livres de DNA entre as mutações (Tabela Suplementar 1).
7. Confirmando linhas estranhas livres de T-DNA: Colha folhas de mudas de 2 semanas e extraia o DNA do genoma da planta conforme descrito na etapa 4.2. Realizar PCR genômico com o seguinte programa: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) com 35 ciclos e 72 °C, 5 min. Isso permite a detecção de de higromicina, RBU e Cas no genoma da planta.
8. Analise os produtos de PCR por eletroforese em gel e selecione as linhas que não apresentam bandas, indicando que são linhas E1 livres de transgenes. Colha as sementes dessas linhas selecionadas.

5. Medição do teor de amido resistente (tempo de 4 dias)

1. Colha sementes de plantas mutantes e X134 e deixe-as secar naturalmente à temperatura ambiente, mantendo um teor de umidade de aproximadamente 13% a 15%. Determine o teor de amido resistente usando o procedimento pancreático de α-amilose/amiloglucosidase (AMG) descrito abaixo.
2. Ative a máquina de descascar e introduza 10 g de grãos de arroz no comedouro para remover com eficiência a casca da gluma, resultando em sementes de arroz processadas.
3. Transfira as sementes de arroz descascadas para o moinho de arroz e opere-o por 60 s para eliminar a camada de aleurona, produzindo arroz polido.
4. Coloque o arroz polido no moedor de tecidos, ajustando a frequência de moagem para 60 Hz. Deixe o moedor funcionar por 15 s, repetindo o ciclo 2x para produzir arroz em pó.
5. Deposite o pó de arroz moído em uma placa de Petri e leve ao forno pré-aquecido. Regular a temperatura para 37 °C e deixar secar durante 12 h.
6. Pese com precisão 100 mg ± 5 mg de amostras e despeje diretamente em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL. Bata suavemente no tubo para garantir que a amostra assente no fundo.
7. Adicione 180 μL de água purificada ao tubo e ferva as amostras por 20 min em banho-maria.
8. Deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente e, em seguida, introduza 4 mL de AMG (3 U / mL) contendo α-amilase pancreática (10 mg / mL) em cada tubo.
9. Tampe bem os tubos, misture-os em um oscilador de vórtice e incube os tubos a 37 ° C por 16 h com agitação contínua.
10. Adicione 4 mL de etanol e misture usando um vórtice. Centrifugue o tubo a 1.500 x g por 10 min.
11. Decantar o sobrenadante, adicionar 2 ml de etanol a 50% seguidos de 6 ml de 50% de IMS e misturar com vórtice e centrífuga.
12. Despeje cuidadosamente o sobrenadante e inverta o tubo para drenar o excesso de líquido. Coloque os tubos em um banho de gelo, adicione 2 mL de 2 M KOH a cada tubo e mexa as amostras por 20 minutos para ressuspender os flocos e dissolver o amido resistente.
13. Adicione 8 mL de tampão acetato de sódio 1,2 M (pH 3,8) a cada tubo de ensaio e misture usando um agitador magnético.
14. Introduza imediatamente 0,1 mL de AMG (3300 U / mL), misture bem e incube por 30 min em banho-maria a 50 ° C com mistura intermitente usando um vórtice. Em seguida, centrifugue o tubo a 1.500 x g por 10 min.
15. Transfira 0,1 mL do sobrenadante para um tubo de vidro, adicione 3 mL de reagente de glicose oxidase / peroxidase (GOPOD) e incube a 50 ° C por 20 min. Prepare um branco de reagente misturando 0,1 mL de tampão acetato de sódio 100 mM e 3 mL de reagente GOPOD. Prepare os padrões misturando 0,1 mL de D-glicose com 3 mL de reagente GOPOD.
16. Pipetar cuidadosamente 200 μL de cada solução em branco, da solução a ser testada e da solução-padrão para uma placa de 96 poços.
17. Medir a absorvância de cada amostra a 510 nm em relação à solução em branco e calcular o teor de amido resistente utilizando a fórmula fornecida.
    Amido Resistente (g/100 g) = ΔA × F/W ×9.27
    Em que ΔA = absorbância lida contra o branco do reagente; F = conversão da absorvância em microgramas (determina-se a absorvância obtida para 100 μg de D-glucose na reacção GOPOD); W = peso seco da amostra analisada.

6. Resposta pós-prandial da glicose no sangue (tempo de 5 dias)

1. Use os seguintes critérios de inclusão para os participantes: adultos asiáticos chineses saudáveis com idade entre 18 e 60 anos, não fumantes, índice de massa corporal (IMC) entre 18,5 e 25 kg/m² e pressão arterial normal (< 140/90 mm. Use os seguintes critérios de exclusão: doenças metabólicas (como diabetes, hipertensão, etc.), distúrbios gastrointestinais, anormalidades do sistema endócrino ou doenças mentais. Um total de 10 participantes foram selecionados e recrutados.
2. Procedimento da sessão de teste (abrangendo dois dias consecutivos)
   1. Dia 0 (Dia de Preparação): Peça aos participantes que mantenham padrões regulares de sono e uma dieta normal nos primeiros 3 dias anteriores ao teste. Na noite anterior ao teste (após as 20:00), peça aos participantes que se abstenham de refeições ricas em fibras e açúcar. O exercício vigoroso é desencorajado na manhã do dia 1.
   2. Dia 1 (Dia do Teste): Prepare o arroz branco moendo as sementes de arroz e depois enxágue o arroz branco 2x. Encha uma panela com 1,5 partes de água para 1 parte de arroz branco. Ferva o arroz até que a água seja totalmente absorvida. Desligue o fogo, tampe a panela e deixe descansar por 10 min.
   3. Atribua aleatoriamente os 10 participantes a dois grupos iguais: um grupo de teste para ser alimentado com arroz branco com amido resistente e um grupo de controle para ser alimentado com arroz branco X134. Peça aos participantes que descansem por 10 minutos antes do início do teste.
   4. Esterilize as pontas dos dedos com álcool medicinal a 75%. Pressione suavemente o dispositivo de lanceta contra a ponta do dedo e solte a mola para picar a pele. Aperte suavemente o dedo para produzir uma pequena gota de sangue e toque essa gota na extremidade absorvente de sangue da tira de teste no medidor. O medidor coleta automaticamente o sangue e inicia o processo de teste. Aguarde até que a leitura da glicose no sangue seja exibida.
   5. Consumo de arroz e amostragem de sangue: Apresente aos participantes 50 g do arroz preparado com 200 mL de água e peça-lhes que comam em um ritmo confortável dentro de 5 a 10 minutos. Após a refeição, colete amostras de sangue venoso nos seguintes momentos: 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min do início da refeição. Realize a análise da glicose no sangue como na etapa 6.2.4.

No presente estudo, todos os procedimentos de melhoramento de arroz funcional foram demonstrados por edição do genoma para obter variedades estáveis de arroz para amido resistente. Integramos sgRNA direcionado a SBEIIb em CRISPR/Cas-SF01 (Figura Suplementar 1), infiltramos arroz usando transformação de Agrobacterium e obtivemos plantas de geração E0 após os estágios de triagem e enraizamento. As plantas com perda da função gênica foram triadas e seu teor de amido resistente foi determinado após a colheita das sementes (Figura 1). Mutações homozigóticas (20,8%) foram encontradas nas plantas E0 por sequenciamento de Sanger, e sbeIIb-1 (-2bp, CC), sbeIIb-2 (-4bp, AGCC) e sbeIIb -3 (-4bp, GTGC) na sequência alvo produziram frameshift na região codificante dando origem a proteínas não funcionais (Figura 2, Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3).

Um processo de seleção meticuloso foi realizado para identificar plantas E1 que abrigam as mutações sbeIIb-1, sbeIIb-2 e sbeIIb-3 no gene SBEIIb , visando especificamente as linhagens que foram confirmadas como livres de inserções de T-DNA e não exibindo evidências de mutações fora do alvo. Essas plantas foram então selecionadas para posterior análise fenotípica. Todas as plantas foram cultivadas em condições naturais de campo e colhidas as sementes após a maturação (Figura 3A). Estudos anteriores indicaram que o teor de amido resistente do endosperma do arroz determina o grau de transparência exibido pelo arroz branqueado²⁷. Os grãos das plantas mutantes sbeIIb tinham uma aparência cerosa, sendo brancos e totalmente opacos em contraste com a aparência translúcida típica das sementes X134 (Figura 3B). As plantas mutadas foram indistinguíveis do controle X134 em altura de planta (Figura Suplementar 4A, C), taxa de fixação de sementes (Figura 3C), número de grãos por panícula (Figura 3D) e rendimento por planta (Figura 3E), excluindo o comprimento da panícula diminuiu 11,9% nos mutantes (Figura Suplementar 4B, D).

O conteúdo de RS do sbeIIb é de 5,2% em comparação com o X134 do tipo selvagem de 0,6% (Figura 4A). Para investigar melhor as implicações funcionais, avaliamos a resposta glicêmica após o consumo do arroz RS. Nossos resultados indicaram que o consumo de arroz RS resultou em uma redução de 9,7% e 3,7% na resposta à glicose em 15 min e 30 min após o consumo de arroz, respectivamente (Figura 4B). É importante ressaltar que os níveis de glicose no sangue dos indivíduos que consumiram o arroz mutante aumentaram mais lentamente em comparação com aqueles que consumiram o arroz X134, sugerindo as potenciais aplicações do arroz RS no controle glicêmico (Figura 4B).

Figura 1: Modelo de melhoramento de arroz com amido resistente por tecnologia de edição de genoma. Este modelo ilustra as principais etapas: entrega do vetor na célula de Agrobacterium, infecção do calo de arroz por Agrobacterium, regeneração de brotos de arroz, colheita de grãos de arroz e análise de amido resistente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Genótipo e sequência de proteína de predição de mutantes sbeIIb . Cromatogramas de sequenciamento de Sanger de sbellb-1, sbellb-2 e sbellb-3. Preto indica sequências normais de aminoácidos. Linhas pontilhadas pretas indicam mutações frameshift em aminoácidos e vermelho indica o códon de parada. A posição alvo é mostrada com uma seta vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Característica agronômica e qualidade do grão do mutante sbeIIb . (A) Fenótipo vegetal de sbeIIb. (B) Comparações da aparência de mutantes X134 e sbeIIb-1 de arroz integral. (CE) Taxa de pegamento de sementes, grãos por panícula e produtividade por planta de X134 e sbeIIb. Os dados são a média ± DPs; NS significa que não houve diferença significativa de acordo com o teste t de Student, n=20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Teor de amido resistente em grãos maduros e níveis de glicose no sangue. (A) Medições do teor de amido resistente no grão sbeIIb , n = 3. (B) A curva de glicose no sangue após o consumo de arroz sbeIIb . Os dados são a média ± DPs; **, p < 0,01 de acordo com o teste t de Student, n=5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Vetor de CRISPR/Cas-SF01. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: A sequência da proteína de previsão de OsSBEIIb e os mutantes sbeIIb . As sequências de frameshift são marcadas pela cor vermelha. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Análise das características das plantas do mutante sbeIIb-1. (A) Fenótipo de crescimento do mutante sbeIIb-1 . (B) Padrões de pico do mutante sbeIIb-1 . (C) Altura da planta do mutante sbeIIb-1 . (D) Comprimento da panícula do mutante sbeIIb-1 . Os dados são os meios ± SDs; NS significa que não há diferença significativa; **, p < 0,01 de acordo com o teste t de Student. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1. Lista de primers usados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

No processo de construção de vetores knockdown baseados em CRISPR/Cas-SF01, a seleção meticulosa de RNAs de guia único (sgRNA) é fundamental. Isso exige a adoção de sequências que exibam alta eficiência de edição com efeitos mínimos fora do alvo. Além disso, a síntese de primers de direcionamento incorpora oligos adaptadores curtos que correspondem aos locais de emenda do vetor, garantindo uma integração perfeita. Notavelmente, ao contrário das metodologias anteriores que exigiam digestão enzimática sequencial, purificação em gel e ligadura, nosso estudo agiliza o processo integrando o corte e a ligação enzimática em um sistema tudo-em-um. Esse aprimoramento melhora a eficiência operacional e reduz o cronograma experimental.

Ao comparar Cas-SF01 com a nuclease Cas 9 canônica, surgem vantagens distintas, destacando seu potencial no melhoramento molecular de plantas. Essas vantagens posicionam coletivamente o Cas-SF01 como uma ferramenta promissora em biotecnologia agrícola. Em primeiro lugar, o tamanho menor da proteína Cas-SF01 pode aumentar a eficiência da entrega celular na planta. Em segundo lugar, suas sequências de crRNA mais curtas facilitam o desenho de estratégias de direcionamento multiplexadas, permitindo modificações genéticas mais complexas²⁸. Em terceiro lugar, Cas-SF01 normalmente induz mutações em larga escala em comparação com os indels típicos de 1 pb de Cas9, indicando seu potencial para alterações genéticas mais substanciais²⁹.

No campo da edição de genes de culturas, vários fatores desempenham um papel fundamental na garantia de resultados bem-sucedidos. Em primeiro lugar, a confirmação da sequência gênica em variedades editadas é imperativa para evitar possíveis inserções, deleções ou polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que possam dificultar o reconhecimento do sgRNA, afetando assim a eficiência do processo de edição. Em segundo lugar, a seleção da cepa apropriada de Agrobacterium para transformação varia de acordo com a cultivar de arroz com a qual está sendo trabalhada, destacando a importância da escolha da cepa para alcançar a edição de genes bem-sucedida em diferentes variedades de arroz. Além disso, a genotipagem das mudas editadas da geração E0 é crucial para garantir a consistência nos tipos de mutação. Essa genotipagem deve ser realizada após 1 mês de crescimento, utilizando DNA extraído das folhas mais altas de cada perfilho. Devido à notável eficiência de edição do Cas-SF01, as linhas editadas homozigóticas podem ser garantidas na geração E0, facilitando a seleção de materiais livres de T-DNA na geração E1 e, posteriormente, acelerando o processo de melhoramento. Antes de avaliar as características agronômicas, é vital estabelecer o fenótipo editado, pois isso ajuda a compreender sua influência em outras características e a determinar as características desejadas da nova cultivar.

Há modificações e solução de problemas deste procedimento. Ao lidar com várias espécies de culturas, é indispensável comparar a eficiência de edição de Cas9, Cpf1 e Cas-SF01 para determinar a ferramenta mais apropriada para as modificações genéticas pretendidas. Além disso, se as linhas editadas homozigóticas não puderem ser identificadas na geração E0, pode ser necessário aumentar o tamanho da amostra de triagem ou introduzir uma geração extra de plantio e triagem para adquirir plantas homozigóticas livres de T-DNA.

A seleção do promotor U6 para este estudo foi baseada em seu uso generalizado e eficácia estabelecida na edição do genoma da planta, como evidenciado pelo recente trabalho de Lv et ^al.29na criação eficiente de variedades funcionais de arroz. Este promotor foi completamente validado e otimizado em arroz, e optamos por seguir este caminho bem estabelecido para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade de nossos resultados. Embora reconheçamos as vantagens potenciais do promotor CmYLCV, conforme sugerido por Čermák et ^al.30, reconhecemos que novas investigações comparando o desempenho de diferentes promotores em nosso sistema experimental específico forneceriam informações valiosas.

O uso de tecnologias de edição de genes para modificar com precisão loci genômicos funcionais em plantas ressalta a importância da entrega eficiente de vetores e detecção de mutações genéticas. Para avançar linhagens de plantas editadas em novas cultivares de culturas, é imperativo determinar o estado homozigoto do gene alvo e selecionar indivíduos livres de fragmentos exógenos de T-DNA. Este protocolo, desenvolvido para uma variedade de arroz fortificada com amido de alta resistência, ressalta o potencial da tecnologia de edição de genes para acelerar a criação de arroz funcional.

O manuscrito visa contribuir para o campo, apresentando uma abordagem abrangente e sistemática para a criação de variedades funcionais de arroz por meio da edição de genes. O estudo vai além de simplesmente descrever a aplicação de uma ferramenta de edição de genes; em vez disso, ele se concentra na integração de vários aspectos, desde a seleção de genes e otimização da ferramenta de edição até a análise detalhada de características fenotípicas e agronômicas. Em resumo, embora o trabalho possa não introduzir tecnologias ou genes inteiramente novos, ele contribui para o campo, demonstrando uma abordagem abrangente e rigorosa para a criação de variedades funcionais de arroz por meio da edição de genes.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este trabalho foi apoiado por financiamento dos Grandes Projetos de Melhoramento Biológico (2023ZD04074).