Breeding by Design per riso funzionale con tecnologie di editing genomico

Il protocollo descrive l'allevamento di varietà di riso da amido resistenti utilizzando tecnologie di editing del genoma in modo preciso, efficiente e tecnicamente semplice.

Gli approcci convenzionali alla selezione delle colture, che si basano prevalentemente su metodi dispendiosi in termini di tempo e manodopera come l'ibridazione tradizionale e la selezione per mutazione, incontrano sfide nell'introdurre in modo efficiente tratti mirati e generare popolazioni vegetali diversificate. Al contrario, l'emergere delle tecnologie di editing del genoma ha inaugurato un cambiamento di paradigma, consentendo la manipolazione precisa e rapida dei genomi delle piante per introdurre intenzionalmente le caratteristiche desiderate. Uno degli strumenti di editing più diffusi è il sistema CRISPR/Cas, che è stato utilizzato dai ricercatori per studiare importanti problemi legati alla biologia. Tuttavia, il flusso di lavoro preciso ed efficace dell'editing del genoma non è stato ben definito nella selezione delle colture. In questo studio, abbiamo dimostrato l'intero processo di selezione di varietà di riso arricchite con alti livelli di amido resistente (RS), un tratto funzionale che svolge un ruolo cruciale nella prevenzione di malattie come il diabete e l'obesità. Il flusso di lavoro comprendeva diverse fasi chiave, come la selezione del gene SBEIIb funzionale, la progettazione dell'RNA a guida singola (sgRNA), la selezione di un vettore di editing genomico appropriato, la determinazione del metodo di consegna del vettore, la conduzione della coltura di tessuti vegetali, la genotipizzazione della mutazione e l'analisi fenotipica. Inoltre, è stato chiaramente dimostrato il lasso di tempo necessario per ogni fase del processo. Questo protocollo non solo semplifica il processo di selezione, ma migliora anche l'accuratezza e l'efficienza dell'introduzione dei caratteri, accelerando così lo sviluppo di varietà di riso funzionali.

L'allevamento tradizionale si basa sull'introduzione di tratti nelle colture o sulla produzione di popolazioni vegetali con una variazione sufficiente, il che richiede un'osservazione sul campo a lungo termine ^1,2. A causa dei limiti dell'allevamento tradizionale, è stata sviluppata una tecnologia di editing genetico, in grado di modificare con precisione il genoma delle colture per ottenere i tratti desiderati delle popolazioni vegetali³. Il sistema di editing genetico più utilizzato nelle piante è CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), che si basa su un'endonucleasi programmabile guidata da RNA per creare rotture mirate a doppio filamento (DSB) nel DNA ^4,5. Questi DSB vengono poi riparati dai meccanismi naturali di riparazione del DNA della cellula ^6,7, spesso con conseguente introduzione dei cambiamenti genetici desiderati. Sebbene questa tecnologia sia stata implementata in varie colture, tra cui il grano⁸, il mais⁹, la soia¹⁰ e il riso¹¹, viene utilizzata prevalentemente per rivelare problemi biologici. Rispetto alla sua ampia applicazione nel chiarire le funzioni geniche delle piante, la ricerca sull'applicazione delle tecnologie di editing genetico alla selezione delle colture rimane relativamente scarsa¹².

Il processo di editing genetico nelle colture segue tipicamente un flusso di lavoro ben definito che comprende diversi passaggi chiave¹³. Il primo passo consiste nell'identificare il gene specifico o la regione genetica che deve essere modificata per ottenere il tratto desiderato. In secondo luogo, viene progettata una strategia di editing genetico, che prevede la selezione di un sistema di editing genetico appropriato (ad esempio, CRISPR-Cas9 o CRISPR-Cas12) e la progettazione di RNA guida specifici per dirigere l'endonucleasi verso il sito bersaglio. In terzo luogo, il sistema di editing genetico viene quindi incorporato in un vettore di consegna, che viene utilizzato per introdurre il macchinario di editing nelle cellule vegetali. Questi vettori possono essere complessi di DNA, RNA o ribonucleoproteine (RNP). Successivamente, i vettori di editing genetico vengono consegnati nelle cellule vegetali utilizzando vari metodi, tra cui la trasformazione mediata da Agrobacterium, il bombardamento di particelle o l'elettroporazione. Immediatamente, le cellule vegetali trasformate vengono coltivate in condizioni appropriate per generare callo geneticamente modificato o tessuti embriogenici. Questi tessuti vengono poi rigenerati in piante intere attraverso tecniche di coltura tissutale. Le piante rigenerate vengono sottoposte a rigorosa caratterizzazione molecolare per confermare la presenza delle modificazioni genetiche desiderate.

Un precedente articolo di Tsakirpaloglou et ^al.14 fornisce un'ampia panoramica del processo di editing genetico, dalla progettazione del vettore alla generazione di piantine modificate, ma non approfondisce l'analisi dettagliata di tratti specifici associati al gene bersaglio né la successiva valutazione delle prestazioni agronomiche o la validazione funzionale delle colture modificate. Siamo andati oltre la semplice dimostrazione della fattibilità dell'editing di un gene nel riso. Il nostro lavoro valuta in modo completo l'impatto di questa modifica sui tratti biochimici, molecolari e agronomici delle linee di riso modificate. Ciò include la valutazione della composizione dell'amido, un fattore critico che influenza la qualità del grano e il valore nutrizionale, che non è stato ampiamente esplorato in precedenti studi di editing genetico.

L'amido di riso è tipicamente costituito da ~20% di amilosio e ~80% di amilopectina¹⁵. SBEIIb è un enzima essenziale per la sintesi dell'amilopectina ed è espresso nell'endosperma¹⁶. Il knockdown di OsSBEIIb da parte dell'RNA a forcina (RNAi) e dell'espressione del microRNA ha aumentato il contenuto di amido resistente^17,18. L'amido resistente è un amido substrato che non può essere digerito e assorbito nell'intestino tenue, ma è in grado di essere scomposto in acidi grassi a catena corta e gas da alcuni batteri digestivi nell'intestino. Poiché non può essere scomposto rapidamente, ha un indice glicemico più basso rispetto ad altri amidi e non provoca un rapido aumento della glicemia entro un breve periodo di tempo dopo aver mangiato, il che può alleviare il diabete in una certa misura nella dieta¹⁹. Inoltre, l'amido resistente ha funzioni più fisiologiche, come ridurre la risposta all'insulina, regolare la funzione intestinale, prevenire l'accumulo di grasso, facilitare il controllo del peso e favorire l'assorbimento degli ioni minerali. Pertanto, viene ampiamente perseguito come un nuovo tipo di fibra alimentare²⁰.

Per superare queste sfide e utilizzare con successo le tecnologie di editing genetico per la selezione di varietà di riso funzionali, abbiamo perfezionato e ottimizzato i protocolli operativi all'interno del riso. Il nostro obiettivo è stato quello di analizzare meticolosamente la progettazione dei loci genici bersaglio, selezionare attentamente gli strumenti di editing genetico più adatti e condurre un'analisi fenotipica rigorosa durante tutto il processo di allevamento. A testimonianza della potenza e dell'efficienza di queste tecnologie, presentiamo un caso di studio che mostra il rapido sviluppo di una varietà di riso funzionale arricchita con amido ad alta resistenza. Questo esempio sottolinea il potenziale dell'editing genetico nell'accelerare la selezione del riso funzionale, affrontando l'attuale carenza di ricerca in questo campo.

Lo studio è stato condotto presso la Bellagen Biotechnology Co. Ltd in Cina seguendo le linee guida del comitato etico per la ricerca umana. Prima di partecipare, il protocollo di studio è stato spiegato in modo approfondito ai soggetti, che hanno fornito il consenso informato.

1. Progettazione di sgRNA e vettore di costruzione (tempistica 5-7 giorni)

NOTA: Un vettore binario è stato utilizzato per esprimere il sistema CRISPR/Cas-SF01²¹. Non avere meno di 3 nucleotidi (nt) in discrepanza con un potenziale sito fuori bersaglio per l'sgRNA. L'adattatore sgRNA deve integrare l'estremità appiccicosa, che viene generata dalla digestione dell'enzima Bsa I del vettore di editing. La scelta del software si è basata sull'elevata efficienza e specificità del software nel riso¹⁴, nonché sulla sua facilità d'uso e accessibilità al gruppo di ricerca.

1. Vai al sito web dell'NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) per recuperare il gene OsSBEIIb (LOC4329532) in Japonica. Scarica e accedi al genoma di riferimento all'interno del software SnapGene.
2. Analizzare le inserzioni/delezioni (InDel) e i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nella sequenza esone di OsSBEIIb della varietà X134, confrontandola con il genoma di riferimento. Utilizzare NCBI Primer Blast²² per progettare primer che fiancheggiano le regioni dell'esone (Tabella supplementare 1).
3. Per convalidare la sequenza dell'esone del gene OsSBEIIb in X134 mediante sequenziamento Sanger, preparare la reazione come segue: 10 μL di tampone di miscela di polimerasi con 1 μL di primer diretto, 1 μL di primer inverso, 1 μL di gDNA da tessuti X134 e 7 μL di acqua distillata. Eseguire il programma PCR come segue: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) con 35 cicli, e 72 °C, 5 min.
4. Progettare l'sgRNA sulla sequenza dell'esone OsSBEIIb di X134, aderendo al protocollo Tsakirpaloglou et ^al.14e assicurando che la sequenza PAM sia TTN.
5. Modificare la sequenza dell'sgRNA aggiungendo oligo -ACAC- all'estremità 5' del primer diretto e aggiungendo oligo -GGCC- all'estremità 5' del primer inverso. Sintetizzare commercialmente i primer forward/reverse (per sgRNA).
6. Sciogliere i primer diretti e inversi a una concentrazione di 10 μmol/L, prelevare 1 μL di ciascuno e aggiungere 8 μL di tampone di ricottura (tampone Tris-EDTA + 50 mM di NaCl) e miscelare mediante pipettaggio. Inserire nella macchina PCR ed eseguire il programma di ricottura come segue su una macchina PCR: processo di raffreddamento lento da 95 °C a 16 °C a 0,1 °C/s.
7. Assemblare l'sgRNA nel vettore di editing del genoma. Preparare la reazione come segue: 20 μl di tampone di miscelazione con 0,5 μl di DNA ligasi T4, 1 μl di Bsa I, 2 μl di tampone di restrizione 10x, 2 μl di tampone 10x T4 DNA ligasi, 2 μl di primer di ricottura, 2,5 μl di vettore (il suo volume viene regolato per adattarsi al rapporto) e 10 μl di acqua distillata. In tutti i casi, utilizzare un rapporto inserto/vettore di 2:1 per ottenere l'efficienza dell'assemblaggio. Eseguire il programma di assemblaggio PCR come (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) con 30 cicli e 55 °C, 30 min.
8. Trasformare il vettore risultante in cellule di E. coli come descritto²³.
9. Progettare primer che fiancheggiano il sito di inserimento del gRNA all'interno del plasmide. Utilizzando questi primer, eseguire l'amplificazione PCR su singole colonie per verificare la corretta inserzione. Eseguire il sequenziamento Sanger dei prodotti PCR per confermare il successo del clonaggio e isolare il plasmide²⁴.

2. Trasformazione dell'Agrobacterium (tempistica 4 giorni)

1. Scongelare EHA105 Agrobacterium Competent Cell sul ghiaccio. Aggiungere 1-2 μL di DNA plasmidico (contenente ~100-200 ng di DNA) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente.
2. Eseguire la trasformazione dello shock termico posizionando il tubo sul ghiaccio per 5 minuti, sull'azoto liquido per 5 minuti, sullo shock termico a 37 °C per 5 minuti e poi nel bagno di ghiaccio per 5 minuti.
3. Aggiungere 700 μl di terreno peptone estratto di lievito (YEP), senza antibiotico, alla provetta e mescolare delicatamente. Recuperare le cellule in un incubatore agitatore a 28 °C, 200-250 giri/min, per 2-3 ore.
4. Centrifugare la coltura a 2.800 x g per 1 min. Scartare la maggior parte del surnatante, lasciando circa 100 μL, e risospendere le cellule. Distribuire le cellule su piastre di agar YEP contenenti l'1% di antibiotici (Kanamicina e Rifampicina) per la selezione dei plasmidi. Incubare la piastra a 28 °C per 24-48 h.
5. Striare la piastra YEP (con resistenze agli antibiotici) con un puntale per pipetta contenente una singola colonia di Agrobacterium contenente il CRISPR/Cas e trasferire le cellule in 5 mL di terreno liquido YEP con antibiotici appropriati. Incubare il liquido a 28 °C per 3 giorni.
6. Conservare i ceppi di Agrobacterium trasformati come scorte di glicerolo a -80 °C per un ulteriore utilizzo.

3. Trasformazione del riso mediante Agrobacterium (tempistica 3 mesi)

NOTA: Sono stati riportati diversi metodi di trasformazione delle piante per la consegna e l'espressione della sequenza di DNA estraneo nella cellula vegetale²⁵. Considerando l'integrazione di una singola copia e la bassa frequenza di DSB nel genoma, la trasformazione mediata da Agrobacterium è il metodo di scelta per integrare il frammento di DNA di espressione nei cromosomi del riso.

1. Eseguire la trasformazione del riso mediata da Agrobacterium seguendo il protocollo in²⁵. I calli a crescita attiva (bianco giallastro, relativamente secchi e di 1-3 mm di diametro) sono un punto chiave per una trasformazione efficiente. Scartare i semi con lo sviluppo della piantina o il callo marrone prima di infettare il callo con l'Agrobacterium.

4. Genotipizzazione delle piante transgeniche e raccolta dei semi (tempistica 8 mesi)

NOTA: Verranno coltivate due generazioni di riso per ottenere mutazioni omozigoti e linee estranee prive di DNA.

1. Campionamento del tessuto della piantina: Trapiantare le piante transgeniche in vaso e farle crescere per 1 mese in serra. Per analizzare il tipo di mutazione, raccogliere 2-3 mg di foglie fresche da ciascun timone di una singola piantina e combinarle in un unico campione.
2. Estrazione del DNA genomico: seguire un protocollo stabilito per l'estrazione del DNA del genoma vegetale²⁶.
3. Progettazione dei primer di mutazione (Tabella supplementare 1): Progettazione di primer PCR per amplificare la regione del gene SBEIIb che circonda il sito target¹⁴ dell'sgRNA. Il frammento amplificato è lungo 493 bp.
4. Genotipizzazione della mutazione: sequenziare direttamente i frammenti di PCR o clonarli in un vettore di clone T e sequenziarli utilizzando il metodo Sanger per identificare le mutazioni¹⁴.
5. Raccolta dei semi: Scegli le linee E0 che presentano mutazioni omozigoti di frame-shift e piantale in una serra per ottenere i semi.
6. Progettazione dei primer per identificare il T-DNA: Progettazione di tre primer specifici per la cassetta di igromicina, la cassetta UBI e la cassetta Cas del costrutto per identificare le linee estranee prive di DNA tra le mutazioni (Tabella supplementare 1).
7. Conferma di linee estranee prive di T-DNA: raccogliere le foglie da piantine di 2 settimane ed estrarre il DNA del genoma delle piante come descritto nel passaggio 4.2. Condurre la PCR genomica con il seguente programma: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) con 35 cicli, e 72 °C, 5 min. Ciò consente il rilevamento di igromicina, UBI e cassetta Cas nel genoma della pianta.
8. Analizza i prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel e seleziona linee che non mostrano bande, indicando che si tratta di linee E1 prive di transgeni. Raccogli i semi da queste linee selezionate.

5. Misurazione del contenuto di amido resistente (tempistica 4 giorni)

1. Raccogli i semi di piante mutanti e X134 e lasciali essiccare naturalmente a temperatura ambiente, mantenendo un contenuto di umidità di circa il 13%-15%. Determinare il contenuto di amido resistente utilizzando la procedura pancreatica α-amilosio/amiloglucosidasi (AMG) descritta di seguito.
2. Attiva la pelatrice e introduci 10 g di chicchi di riso nell'alimentatore per rimuovere efficacemente il guscio della gluma, ottenendo semi di riso lavorati.
3. Trasferire i semi di riso sbucciati nella riseria e azionarla per 60 s per eliminare lo strato di aleurone, ottenendo riso lucido.
4. Mettere il riso lucidato nel macina fazzoletti, regolando la frequenza di macinazione a 60 Hz. Far funzionare il macinacaffè per 15 s, ripetendo il ciclo 2 volte per produrre polvere di riso.
5. Depositare la polvere di riso macinata in una capsula di Petri e metterla in forno preriscaldato. Impostare la temperatura a 37 °C e lasciarlo asciugare per 12 ore.
6. Pesare con precisione 100 mg ± 5 mg di campioni e versare direttamente in una provetta per microcentrifuga da 2,0 mL. Picchiettare delicatamente il tubo per assicurarsi che il campione si depositi sul fondo.
7. Aggiungere 180 μl di acqua purificata alla provetta e far bollire i campioni per 20 minuti a bagnomaria.
8. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente, quindi introdurre 4 mL di AMG (3 U/mL) contenenti α-amilasi pancreatica (10 mg/mL) in ciascuna provetta.
9. Tappare saldamente le provette, mescolarle su un oscillatore a vortice e incubare le provette a 37 °C per 16 ore con agitazione continua.
10. Aggiungere 4 ml di etanolo e mescolare con un vortice. Centrifugare la provetta a 1.500 x g per 10 min.
11. Decantare il surnatante, aggiungere 2 mL di etanolo al 50% seguiti da 6 mL di IMS al 50% e mescolare utilizzando un vortice e una centrifuga.
12. Versare con cautela il surnatante e capovolgere il tubo per drenare il liquido in eccesso. Immergere le provette in un bagno di ghiaccio, aggiungere 2 mL di 2 M KOH a ciascuna provetta e agitare i campioni per 20 minuti per risospendere i fiocchi e sciogliere l'amido resistente.
13. Aggiungere 8 mL di tampone acetato di sodio 1,2 M (pH 3,8) a ciascuna provetta e mescolare utilizzando un agitatore magnetico.
14. Introdurre immediatamente 0,1 mL di AMG (3300 U/mL), miscelare accuratamente e incubare per 30 minuti in un bagno d'acqua a 50 °C con miscelazione intermittente utilizzando un vortice. Quindi, centrifugare la provetta a 1.500 x g per 10 minuti.
15. Trasferire 0,1 mL di surnatante in una provetta di vetro, aggiungere 3 mL di reagente Glucosio ossidasi/perossidasi (GOPOD) e incubare a 50 °C per 20 min. Preparare un bianco di reagente mescolando 0,1 mL di tampone acetato di sodio 100 mM e 3 mL di reagente GOPOD. Preparare gli standard mescolando 0,1 mL di D-glucosio con 3 mL di reagente GOPOD.
16. Pipettare con cura 200 μl di ciascuna soluzione bianca, la soluzione da testare e la soluzione standard in una piastra a 96 pozzetti.
17. Misurare l'assorbanza di ciascun campione a 510 nm rispetto alla soluzione in bianco e calcolare il contenuto di amido resistente utilizzando la formula fornita.
    Amido resistente (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27
    dove ΔA = assorbanza letta rispetto al bianco del reagente; F = conversione da assorbanza a microgrammi (si determina l'assorbanza ottenuta per 100 μg di D-glucosio nella reazione GOPOD); W = peso secco del campione analizzato.

6. Risposta glicemica postprandiale (tempistica 5 giorni)

1. Utilizzare i seguenti criteri di inclusione per i partecipanti: adulti cinesi asiatici sani di età compresa tra 18 e 60 anni, non fumatori, un indice di massa corporea (BMI) compreso tra 18,5 e 25 kg/m² e pressione sanguigna normale (< 140/90 mm. Hg). Utilizzare i seguenti criteri di esclusione: malattie metaboliche (come diabete, ipertensione, ecc.), disturbi gastrointestinali, anomalie del sistema endocrino o malattie mentali. Un totale di 10 partecipanti sono stati selezionati e reclutati.
2. Procedura della sessione di test (che si estende su due giorni consecutivi)
   1. Giorno 0 (giorno di preparazione): chiedi ai partecipanti di mantenere schemi di sonno regolari e una dieta normale per i primi 3 giorni precedenti il test. La sera prima del test (dopo le 20:00), chiedi ai partecipanti di astenersi da pasti ricchi di fibre e zuccheri. L'esercizio fisico vigoroso è scoraggiato la mattina del giorno 1.
   2. Giorno 1 (giorno del test): Preparare il riso bianco macinando i semi di riso, quindi sciacquare il riso bianco 2 volte. Riempi una pentola con 1,5 parti di acqua e 1 parte di riso bianco. Lessare il riso fino a quando l'acqua non sarà completamente assorbita. Spegnete il fuoco, coprite la pentola e lasciate riposare per 10 min.
   3. Assegna in modo casuale i 10 partecipanti a due gruppi uguali: un gruppo di prova da nutrire con riso bianco resistente all'amido e un gruppo di controllo da nutrire con riso bianco X134. Chiedi ai partecipanti di riposare per 10 minuti prima dell'inizio del test.
   4. Sterilizzare i polpastrelli con alcol medico al 75%. Premere delicatamente il dispositivo a lancetta contro la punta del dito e rilasciare la molla per pungere la pelle. Stringere delicatamente il dito per produrre una piccola gocciolina di sangue e toccare questa gocciolina con l'estremità che assorbe il sangue della striscia reattiva nello strumento. Il misuratore aspira automaticamente il sangue e avvia il processo di analisi. Attendere che venga visualizzata la lettura della glicemia.
   5. Consumo di riso e prelievo di sangue: Presentare ai partecipanti 50 g di riso preparato con 200 ml di acqua e chiedere loro di mangiarlo a un ritmo confortevole entro 5-10 minuti. Dopo il pasto, raccogliere campioni di sangue venoso nei seguenti momenti: 15 minuti, 30 minuti, 60 minuti, 90 minuti e 120 minuti dall'inizio del pasto. Eseguire l'analisi della glicemia come al punto 6.2.4.

Nel presente studio, l'intera procedura di selezione del riso funzionale è stata dimostrata mediante l'editing del genoma per ottenere varietà di riso da amido stabili e resistenti. Abbiamo integrato l'sgRNA mirato a SBEIIb in CRISPR/Cas-SF01 (Figura supplementare 1), infiltrato il riso utilizzando la trasformazione di Agrobacterium e ottenuto piante di generazione E0 dopo le fasi di screening e radicazione. Le piante con perdita di funzione genica sono state sottoposte a screening e il loro contenuto di amido resistente è stato determinato dopo la raccolta dei semi (Figura 1). Mutazioni omozigoti (20,8%) sono state riscontrate nelle piante E0 mediante sequenziamento Sanger, e sbeIIb-1 (-2bp, CC), sbeIIb-2 (-4bp, AGCC) e sbeIIb -3 (-4bp, GTGC) nella sequenza bersaglio hanno prodotto frameshift nella regione codificante dando origine a proteine non funzionali (Figura 2, Figura 2 supplementare e Figura 3 supplementare).

È stato intrapreso un meticoloso processo di selezione per identificare le piante E1 che ospitano le mutazioni sbeIIb-1, sbeIIb-2 e sbeIIb-3 nel gene SBEIIb , mirando specificamente a quelle linee che sono state confermate prive di inserzioni di T-DNA e che non mostrano evidenza di mutazioni off-target. Queste piante sono state poi selezionate per ulteriori analisi fenotipiche. Tutte le piante sono state coltivate in condizioni naturali di campo e hanno raccolto i semi dopo la maturazione (Figura 3A). Studi precedenti hanno indicato che il contenuto di amido resistente dell'endosperma del riso determina il grado di trasparenza esibito dal riso lavorato²⁷. I chicchi delle piante mutate in sbeIIb avevano un aspetto ceroso, essendo bianchi e completamente opachi in contrasto con il tipico aspetto traslucido dei semi X134 (Figura 3B). Le piante mutate erano indistinguibili dal controllo X134 per l'altezza della pianta (Figura 4A, C), il tasso di allegagione (Figura 3C), il numero di grani per pannocchia (Figura 3D) e la resa per pianta (Figura 3E), escludendo la lunghezza della pannocchia diminuita dell'11,9% nei mutanti (Figura 4B, D).

Il contenuto di RS dello sbeIIb è del 5,2% rispetto allo 0,6% del wild-type X134 (Figura 4A). Per indagare ulteriormente le implicazioni funzionali, abbiamo valutato la risposta glicemica dopo aver consumato il riso RS. I nostri risultati hanno indicato che il consumo di riso RS ha comportato una riduzione del 9,7% e del 3,7% della risposta glicemica rispettivamente a 15 minuti e 30 minuti dopo il consumo di riso (Figura 4B). È importante sottolineare che i livelli di glucosio nel sangue degli individui che consumavano il riso mutante sono aumentati più lentamente rispetto a quelli che consumavano il riso X134, suggerendo le potenziali applicazioni del riso RS nel controllo glicemico (Figura 4B).

Figura 1: Modello di allevamento del riso Resistant Starch mediante tecnologia di editing del genoma. Questo modello illustra i passaggi chiave: consegna del vettore nella cellula di Agrobacterium, infezione del callo di riso da parte di Agrobacterium, rigenerazione dei germogli di riso, raccolta dei chicchi di riso e analisi dell'amido resistente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Genotipo e sequenza proteica predittiva dei mutanti sbeIIb . Cromatogrammi di sequenziamento Sanger di sbellb-1, sbellb-2 e sbellb-3. Il nero indica le normali sequenze di aminoacidi. Le linee tratteggiate nere indicano le mutazioni frameshift negli amminoacidi, mentre il rosso indica il codone di stop. La posizione di destinazione viene visualizzata con una freccia rossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratteristiche agronomiche e qualità della granella del mutante sbeIIb . (A) Fenotipo vegetale di sbeIIb. (B) Confronti dell'aspetto dei mutanti X134 e sbeIIb-1 del riso integrale. (C-E) Tasso di allegagione, chicchi per pannocchia e resa per pianta di X134 e sbeIIb. I dati sono la media ± SD; NS significa nessuna differenza significativa secondo il test t di Student, n=20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Contenuto di amido resistente nei cereali maturi e livelli di glucosio nel sangue. (A) Misurazioni del contenuto di amido resistente nei cereali sbeIIb , n=3. (B) La curva della glicemia dopo il consumo di riso sbeIIb . I dati sono la media ± SD; **, p < 0,01 secondo il test t di Student, n=5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Vettore di CRISPR/Cas-SF01. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: La sequenza proteica predittiva di OsSBEIIb e dei mutanti sbeIIb . Le sequenze di frameshift sono contrassegnate dal colore rosso. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Analisi dei tratti vegetali del mutante sbeIIb-1. (A) Fenotipo di crescita del mutante sbeIIb-1 . (B) Pattern spike del mutante sbeIIb-1 . (C) Altezza della pianta del mutante sbeIIb-1 . (D) Lunghezza della pannocchia del mutante sbeIIb-1 . I dati sono il mezzo ± SD; NS significa nessuna differenza significativa; **, p < 0,01 secondo il test t di Student. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1. Elenco dei primer utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Nel processo di costruzione di vettori di knockdown basati su CRISPR/Cas-SF01, la selezione meticolosa di RNA a guida singola (sgRNA) è fondamentale. Ciò richiede l'adozione di sequenze che mostrino un'elevata efficienza di editing con effetti fuori bersaglio minimi. Inoltre, la sintesi dei primer di targeting incorpora brevi oligo adattatori che corrispondono ai siti di splicing del vettore, garantendo un'integrazione senza soluzione di continuità. In particolare, a differenza delle metodologie precedenti che richiedevano la digestione enzimatica sequenziale, la purificazione del gel e la legatura, il nostro studio semplifica il processo integrando il taglio enzimatico e la legatura in un sistema all-in-one. Questo miglioramento migliora l'efficienza operativa e riduce la tempistica sperimentale.

Confrontando Cas-SF01 con la nucleasi canonica di Cas 9, emergono vantaggi distinti, evidenziando il suo potenziale nel miglioramento genetico molecolare delle piante. Questi vantaggi posizionano collettivamente Cas-SF01 come uno strumento promettente nelle biotecnologie agricole. In primo luogo, le dimensioni più piccole delle proteine di Cas-SF01 possono migliorare l'efficienza della consegna cellulare nelle planta. In secondo luogo, le sue sequenze di crRNA più corte facilitano la progettazione di strategie di targeting multiplexate, consentendo così modifiche genetiche più complesse²⁸. In terzo luogo, Cas-SF01 induce tipicamente mutazioni su larga scala rispetto alle tipiche indel 1-bp di Cas9, indicando il suo potenziale per alterazioni genetiche più sostanziali²⁹.

Nel campo dell'editing genetico delle colture, diversi fattori giocano un ruolo fondamentale nel garantire risultati di successo. In primo luogo, la conferma della sequenza genica nelle varietà modificate è fondamentale per prevenire potenziali inserzioni, delezioni o polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) che potrebbero ostacolare il riconoscimento dell'sgRNA, influenzando così l'efficienza del processo di editing. In secondo luogo, la selezione del ceppo di Agrobacterium appropriato per la trasformazione varia in base alla cultivar di riso con cui si lavora, evidenziando l'importanza della scelta del ceppo per ottenere un editing genetico di successo in diverse varietà di riso. Inoltre, la genotipizzazione delle piantine modificate con generazione E0 è fondamentale per garantire la coerenza nei tipi di mutazione. Questa genotipizzazione dovrebbe essere condotta dopo 1 mese di crescita, utilizzando il DNA estratto dalle foglie più alte di ciascuna motozappa. Grazie alla notevole efficienza di editing di Cas-SF01, le linee modificate omozigoti possono essere fissate nella generazione E0, facilitando la selezione di materiali privi di T-DNA nella generazione E1 e successivamente accelerando il processo di riproduzione. Prima di valutare i caratteri agronomici, è fondamentale stabilire il fenotipo modificato, in quanto ciò aiuta a comprendere la sua influenza su altri caratteri e a determinare le caratteristiche desiderate della nuova cultivar.

Questa procedura è stata modificata e risolta in modo adeguato. Quando si ha a che fare con varie specie di colture, è indispensabile confrontare l'efficienza di editing di Cas9, Cpf1 e Cas-SF01 per accertare lo strumento più appropriato per le modificazioni genetiche previste. Inoltre, se le linee modificate omozigoti non possono essere identificate nella generazione E0, potrebbe essere necessario aumentare la dimensione del campione di screening o introdurre una generazione extra di piantagione e screening per acquisire piante omozigoti prive di T-DNA.

La selezione del promotore U6 per questo studio si è basata sul suo uso diffuso e sulla sua efficacia dimostrata nell'editing del genoma delle piante, come evidenziato dal recente lavoro di Lv et ^al.29nella creazione efficiente di varietà di riso funzionali. Questo promotore è stato accuratamente convalidato e ottimizzato nel riso, e abbiamo scelto di seguire questo percorso consolidato per garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei nostri risultati. Pur riconoscendo i potenziali vantaggi del promotore CmYLCV, come suggerito da Čermák et ^al.30, riconosciamo che ulteriori indagini che confrontano le prestazioni di diversi promotori nel nostro specifico sistema sperimentale fornirebbero preziose intuizioni.

L'uso di tecnologie di editing genetico per modificare con precisione i loci genomici funzionali nelle piante sottolinea l'importanza di un'efficiente consegna dei vettori e del rilevamento delle mutazioni geniche. Per far avanzare le linee di piante modificate in nuove cultivar di colture, è imperativo accertare lo stato omozigote del gene bersaglio e selezionare individui privi di frammenti di T-DNA esogeno. Questo protocollo, sviluppato per una varietà di riso fortificata con amido ad alta resistenza, sottolinea il potenziale della tecnologia di editing genetico nell'accelerare la selezione del riso funzionale.

Il manoscritto mira a contribuire al campo presentando un approccio completo e sistematico alla creazione di varietà di riso funzionali attraverso l'editing genetico. Lo studio va oltre la semplice descrizione dell'applicazione di uno strumento di editing genetico; piuttosto, si concentra sull'integrazione di molteplici aspetti, dalla selezione genica e l'ottimizzazione degli strumenti di editing all'analisi dettagliata dei tratti fenotipici e agronomici. In sintesi, anche se il lavoro potrebbe non introdurre tecnologie o geni completamente nuovi, contribuisce al campo dimostrando un approccio completo e rigoroso alla creazione di varietà di riso funzionali attraverso l'editing genetico.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento del Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074).