利用基因组编辑技术为功能性水稻设计育种

该协议描述了使用基因组编辑技术以精确、高效和技术简单的方式设计培育抗性淀粉稻品种。

传统的作物育种方法主要依赖于耗时和劳动密集型的方法，例如传统的杂交和突变育种，在有效引入目标性状和产生多样化的植物种群方面面临挑战。相反，基因组编辑技术的出现带来了范式转变，能够精确和快速地操作植物基因组，从而有意识地引入所需的特征。CRISPR/Cas 系统是应用最广泛的编辑工具之一，研究人员已使用它来研究重要的生物学相关问题。然而，在作物育种中，基因组编辑的精确和有效的工作流程尚未得到明确定义。在这项研究中，我们展示了培育富含高水平抗性淀粉 （RS） 的水稻品种的整个过程，这种功能性状在预防糖尿病和肥胖等疾病中起着至关重要的作用。该工作流程包括几个关键步骤，例如选择功能性 SBEIIb 基因、设计单向导 RNA （sgRNA）、选择合适的基因组编辑载体、确定载体递送方法、进行植物组织培养、基因分型突变和表型分析。此外，还清楚地证明了该过程每个阶段所需的时间框架。该方案不仅简化了育种过程，还提高了性状引入的准确性和效率，从而加速了功能性水稻品种的开发。

传统育种依赖于将性状引入作物或产生具有足够变异的植物种群，这需要长期的田间观察 ^1,2。由于传统育种的局限性，已经开发了基因编辑技术，该技术可以精确修饰作物的基因组以获得植物种群所需的性状³。植物中使用最广泛的基因编辑系统是 CRISPR/Cas（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR 相关 Cas 核酸内切酶），它依赖于可编程的 RNA 引导的核酸内切酶在 DNA 中产生靶向双链断裂 （DSB） ^4,5。然后，这些 DSB 被细胞的天然 DNA 修复机制修复 ^6,7，通常会导致引入所需的遗传变化。尽管这项技术已经在各种作物中实施，包括小麦⁸、玉米⁹、大豆¹⁰ 和水稻¹¹，但它主要用于揭示生物学问题。与其在阐明植物基因功能方面的广泛应用相比，将基因编辑技术应用于作物育种的研究仍然相对稀少¹²。

作物中的基因编辑过程通常遵循一个明确的工作流程，其中包括几个关键步骤¹³。第一步涉及确定需要修饰以实现所需性状的特定基因或遗传区域。其次，设计基因编辑策略，包括选择合适的基因编辑系统（例如 CRISPR-Cas9 或 CRISPR-Cas12）和设计特异性向导 RNA 以将核酸内切酶引导至靶位点。其次，然后将基因编辑系统整合到递送载体中，用于将编辑机制引入植物细胞。这些载体可以是 DNA、RNA 或核糖核蛋白 （RNP） 复合物。随后，使用各种方法将基因编辑载体递送到植物细胞中，包括 农杆菌介导的转化、粒子轰击或电穿孔。立即在适当的条件下培养转化的植物细胞，以产生基因编辑的愈伤组织或胚胎发生组织。然后通过组织培养技术将这些组织再生成整株植物。再生植物经过严格的分子表征，以确认所需遗传变化的存在。

Tsakirpaloglou 等人的前一篇文章¹⁴ 对基因编辑过程进行了广泛的概述，从载体设计到编辑幼苗的生成，但它没有深入研究与目标基因相关的特定性状的详细分析，也没有深入探讨随后对农艺性能的评估或编辑作物的功能验证。我们已经超越了简单地证明在水稻中编辑基因的可行性。我们的工作全面评估了这种编辑对编辑后水稻品系的生化、分子和农艺性状的影响。这包括评估淀粉组成，淀粉组成是影响谷物质量和营养价值的关键因素，这在以前的基因编辑研究中尚未得到广泛探讨。

大米淀粉通常由 ~20% 的直链淀粉和 ~80% 的支链淀粉¹⁵ 组成。SBEIIb 是支链淀粉合成所必需的酶，在胚乳¹⁶ 中表达。发夹 RNA （RNAi） 和 microRNA 表达敲低 OsSBEIIb 增加了抗性淀粉含量^17,18。抗性淀粉是一种底物淀粉，不能在小肠中消化和吸收，但能够被肠道中的某些消化细菌分解成短链脂肪酸和气体。由于它不能迅速分解，因此与其他淀粉相比，它的升糖指数较低，并且在进食后短时间内不会引起血糖迅速升高，从而可以在一定程度上缓解糖尿病^饮食19.此外，抗性淀粉具有更多的生理功能，如降低胰岛素反应、调节肠道功能、防止脂肪堆积、促进体重控制、促进矿质离子吸收等。因此，它作为一种新型膳食纤维²⁰ 受到广泛追求。

为了克服这些挑战并成功利用基因编辑技术培育功能性水稻品种，我们完善和优化了水稻中的操作方案。我们的重点是仔细分析靶基因位点的设计，精心选择最合适的基因编辑工具，并在整个育种过程中进行严格的表型分析。为了证明这些技术的强大功能和效率，我们提出了一个案例研究，展示了富含高抗性淀粉的功能性水稻品种的快速发展。这个例子强调了基因编辑在加速功能稻育种方面的潜力，解决了目前该领域研究的缺乏。

该研究是按照人类研究伦理委员会的指导方针在中国贝拉根生物技术有限公司进行的。在参与之前，向受试者详细解释了研究方案，受试者提供了知情同意。

1. 设计 sgRNA 和构建载体（时间 5-7 天）

注意:二元载体用于表达 CRISPR/Cas-SF01 系统²¹。与 sgRNA 的潜在脱靶位点不匹配不少于 3 个核苷酸 （nt）。sgRNA 接头需要补充粘性末端，粘性末端由编辑载体的 Bsa I 酶消化产生。软件的选择是基于该软件在水稻¹⁴ 中的高效性和特异性，以及它的易用性和对研究小组的可访问性。

1. 导航到 NCBI 网站 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 以检索 Japonica 中的 OsSBEIIb （LOC4329532） 基因。在 SnapGene 软件中下载并访问参考基因组。
2. 分析 X134 品种 OsSBEIIb 外显子序列中的插入/缺失 （InDel） 和单核苷酸多态性 （SNP），并将其与参考基因组进行比较。利用 NCBI Primer Blast²² 设计外显子区域侧翼的引物（补充表 1）。
3. 为了通过 Sanger 测序验证 X134 中 OsSBEIIb 基因的外显子序列，请按如下方式制备反应:10 μL 聚合酶混合物缓冲液，含 1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、1 μL 来自 X134 组织的 gDNA 和 7 μL 蒸馏水。按如下方式运行 PCR 程序:95 °C，3 分钟;（95 °C， 20 s- 56 °C， 30 s- 72 °C， 60 s） 35 次循环，以及 72 °C，5 分钟。
4. 在 X134 的 OsSBEIIb 外显子序列上设计 sgRNA，遵循 Tsakirpaloglou 等人 ¹⁴方案并确保 PAM 序列为 TTN。
5. 通过在正向引物的 5' 端添加 -ACAC- oligos 并在反向引物的 5' 端添加 -GGCC- oligos 来修饰 sgRNA 序列。商业合成正向/反向引物 （用于 sgRNA）。
6. 将正向和反向引物溶解至浓度为 10 μmol/L，各取 1 μL，加入 8 μL 退火缓冲液（Tris-EDTA 缓冲液 + 50 mM NaCl）中，移液混合。放入 PCR 机器中，在 PCR 机器上按如下方式运行退火程序:以 0.1 °C/s 的速度缓慢冷却 95 °C 至 16 °C。
7. 将 sgRNA 组装到基因组编辑载体中。按如下方式制备反应:20 μL 混合缓冲液，含 0.5 μL T4 DNA 连接酶、1 μL Bsa I、2 μL 10x 限制性缓冲液、2 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、2 μL 退火引物、2.5 μL 载体（调整其体积以适合比例）和 10 μL 蒸馏水。在所有情况下，请使用 2:1 的插入片段与载体比率来实现组装效率。以（37 °C，2 分钟;16 °C，3 分钟）运行 PCR 组装程序，循环 30 个循环，以及 55 °C，30 分钟。
8. 如所述，将所得载体转化为 大肠杆菌 细胞²³。
9. 设计质粒内 gRNA 插入位点两侧的引物。使用这些引物，对单个菌落进行 PCR 扩增，以筛选成功插入。对 PCR 产物进行 Sanger 测序，以确认克隆成功并分离质粒²⁴。

2. 农杆菌 的转化（时间 4 天）

1. 在冰上解冻 EHA105 农杆菌 感受态细胞。向细胞悬液中加入 1-2 μL 质粒 DNA（含有 ~100-200 ng DNA）并轻轻混合。
2. 将试管置于冰上 5 分钟，液氮 5 分钟，在 37 °C 下热休克 5 分钟，然后在冰浴中 5 分钟，进行热休克转化。
3. 向试管中加入 700 μL 酵母提取物蛋白胨 （YEP） 培养基（不含抗生素）并轻轻混合。在28°C，200-250rpm的振荡培养箱中回收细胞2-3小时。
4. 将培养物以 2,800 x g 离心 1 分钟。弃去大部分上清液，留下约 100 μL，然后重悬细胞。将细胞铺展到含有 1% 抗生素（卡那霉素和利福平）的 YEP 琼脂平板上，用于质粒选择。将板在 28 °C 下孵育 24-48 小时。
5. 用含有单个含有 CRISPR/Cas 的 农杆菌 菌落的移液器吸头在 YEP（具有抗生素耐药性）板上划线，并将细胞转移到 5 mL 含有适当抗生素的 YEP 液体培养基中。将液体在 28 °C 下孵育 3 天。
6. 将转化的 农杆菌 菌株作为甘油原液储存在-80°C以备进一步使用。

3. 农杆菌对水稻的转化（时间 3 个月）

注意:已经报道了几种植物转化方法，用于在植物细胞²⁵ 中递送和表达外源 DNA 序列。考虑到基因组中 DSB 的单拷贝整合和低频率，农杆菌介导的转化是将表达 DNA 片段整合到水稻染色体中的首选方法。

1. 按照²⁵ 中的方案对水稻进行农杆菌介导的水稻转化。活跃生长的愈伤组织（黄白色，相对干燥，直径 1-3 毫米）是有效转化的关键点。在用农杆菌感染愈伤组织之前，丢弃幼苗发育或棕色愈伤组织的种子。

4. 基因分型转基因植物和种子收获（时间 8 个月）

注意:将培养两代水稻以实现纯合突变和无外源 DNA 系。

1. 取样幼苗组织:将转基因植物移植到花盆中，并在温室中种植 1 个月。为了测定突变类型，从单个幼苗的每个分蘖中收集 2-3 毫克新鲜叶子，并将它们合并为单个样品。
2. 基因组 DNA 的提取:遵循既定的植物基因组 DNA 提取方案²⁶。
3. 设计突变引物（补充表 1）:设计 PCR 引物以扩增 sgRNA 靶位点周围的 SBEIIb 基因区域¹⁴。扩增的片段长度为 493 bp。
4. 突变的基因分型:直接对 PCR 片段进行测序或将其克隆到 T 克隆载体中，并使用 Sanger 方法进行测序以鉴定突变¹⁴。
5. 收获种子:选择表现出纯合移码突变的 E0 系，并将它们种植在温室中以获得种子。
6. 设计引物以识别 T-DNA:为构建体的潮霉素盒、UBI 盒和 Cas 盒设计三种特异性引物，以识别突变中的无外源 DNA 细胞系（补充表 1）。
7. 确认无外源 T-DNA 的品系:从 2 周龄的幼苗中收获叶子并按照步骤 4.2 中的说明提取植物基因组 DNA。使用以下程序进行基因组PCR:95°C，3分钟;（95 °C， 20 s- 56 °C， 30 s- 72 °C， 60 s） 35 次循环，以及 72 °C，5 分钟。这允许检测植物基因组中的潮霉素、UBI 和 Cas 盒。
8. 通过凝胶电泳分析 PCR 产物，并选择没有条带的细胞系，表明它们是无转基因的 E1 细胞系。从这些选定的品系中收获种子。

5. 抗性淀粉含量测量（计时 4 天）

1. 收获突变体和 X134 植物的种子，让它们在室温下自然干燥，保持约 13%-15% 的水分含量。使用下面概述的胰腺 α-直链淀粉/淀粉葡糖苷酶 （AMG） 程序确定抗性淀粉含量。
2. 启动去皮机，将 10 克米粒引入喂食器中，以有效地去除谷壳，从而得到加工过的稻种。
3. 将去皮的稻种转移到碾米机中并运行 60 秒以消除糊粉层，得到抛光的米。
4. 将磨碎的大米放入纸巾研磨机中，将研磨频率调整为 60 Hz。运行研磨机 15 秒，重复循环 2 次以生产米粉。
5. 将磨碎的米粉放入培养皿中，然后放入预热的烤箱中。将温度设置为 37 °C 并干燥 12 小时。
6. 精密称取 100 mg ± 5 mg 样品，直接倒入 2.0 mL 微量离心管中。轻轻敲击试管，确保样品沉淀在底部。
7. 向试管中加入 180 μL 纯化水，并在水浴中将样品煮沸 20 分钟。
8. 让样品冷却至室温，然后将 4 mL 含有胰腺 α-淀粉酶 （10 mg/mL） 的 AMG （3 U/mL） 加入每个试管中。
9. 盖紧管子，在涡旋振荡器上混合，并在 37 °C 下连续搅拌孵育管 16 小时。
10. 加入 4 mL 乙醇并使用涡旋混合。将试管以 1,500 x g 离心 10 分钟。
11. 倒出上清液，加入 2 mL 50% 乙醇，然后加入 6 mL 50% IMS，使用涡旋混合并离心。
12. 小心地倒出上清液并倒置试管以排出多余的液体。将试管置于冰浴中，向每管中加入 2 mL 2 M KOH，搅拌样品 20 分钟以重悬絮凝物并溶解抗性淀粉。
13. 向每个试管中加入 8 mL 1.2 M 乙酸钠缓冲液 （pH 3.8），并使用磁力搅拌器混合。
14. 立即加入 0.1 mL AMG （3300 U/mL），充分混合，并在 50 °C 水浴中孵育 30 分钟，并使用涡旋间歇混合。然后，将试管以 1,500 x g 离心 10 分钟。
15. 将 0.1 mL 上清液转移到玻璃管中，加入 3 mL 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶 （GOPOD） 试剂，并在 50 °C 下孵育 20 分钟。通过混合 0.1 mL 100 mM 乙酸钠缓冲液和 3 mL GOPOD 试剂制备试剂空白。通过将 0.1 mL D-葡萄糖与 3 mL GOPOD 试剂混合来制备标准品。
16. 小心地将 200 μL 每种空白溶液、待测溶液和标准溶液移液到 96 孔板中。
17. 测量每个样品在 510 nm 处相对于空白溶液的吸光度，并使用提供的公式计算抗性淀粉含量。
    抗性淀粉 （g/100 g） = ΔA × F/W ×9.27
    其中 ΔA = 相对于试剂空白读取的吸光度;F = 从吸光度到微克的转化率（测定 GOPOD 反应中 100 μg D-葡萄糖获得的吸光度）;W = 分析样品的干重。

6. 餐后血糖反应（时间 5 天）

1. 对参与者使用以下纳入标准:年龄在 18 至 60 岁之间的健康亚裔中国成年人，不吸烟，体重指数 （BMI） 在 18.5 至 25 kg/m² 之间，血压正常（< 140/90 毫米汞柱）。使用以下排除标准:代谢性疾病（如糖尿病、高血压等）、胃肠道疾病、内分泌系统异常或精神疾病。共筛选和招募了 10 名参与者。
2. 测试会话程序（连续两天）
   1. 第 0 天（准备日）:要求参与者在测试前的前 3 天保持规律的睡眠模式和正常的饮食。在测试前一天晚上（20:00 之后），要求参与者避免高纤维和高糖的膳食。不鼓励在第 1 天的早晨进行剧烈运动。
   2. 第 1 天（测试日）:将米籽磨碎，准备白米，然后将白米冲洗 2 次。在锅中加入 1.5 份水和 1 份白米饭。将米饭煮至水完全吸收。关火，盖上锅盖，静置 10 分钟。
   3. 将 10 名参与者随机分配到两组相等的组:一组测试组喂食抗性淀粉白米，另一组对照组喂食 X134 白米。测试开始前，请参与者休息 10 分钟。
   4. 用 75% 的医用酒精对指尖消毒。轻轻按压柳叶刀装置的指尖，然后松开弹簧以刺破皮肤。轻轻挤压手指产生一个小血滴，并将此液滴接触血糖仪中试纸的吸血端。仪表自动抽取血液并开始检测过程。等待显示血糖读数。
   5. 大米消费和采血:向参与者提供 50 克准备好的大米和 200 毫升的水，并要求他们在 5-10 分钟内以舒适的速度食用。餐后，在以下时间点采集静脉血样:进餐后 15 分钟、30 分钟、60 分钟、90 分钟和 120 分钟。按照步骤 6.2.4 进行血糖分析。

本研究通过基因组编辑论证了功能稻选育的全过程，以获得稳定的抗性淀粉稻品种。我们将靶向 SBEIIb 的 sgRNA 整合到 CRISPR/Cas-SF01 中（补充图 1），使用农杆菌转化浸润水稻，并在筛选和生根阶段获得 E0 世代植物。筛选基因功能丧失的植物，并在种子收获后测定其抗性淀粉含量（图 1）。通过 Sanger 测序在 E0 植物中发现纯合突变 （20.8%），靶序列中的 sbeIIb-1 （-2bp， CC）、sbeIIb-2 （-4bp， AGCC） 和 sbeIIb -3 （-4bp， GTGC） 在编码区产生移码，从而产生非功能性蛋白（图 2、补充图 2 和补充图 3）。

进行了细致的选择过程，以鉴定在 SBEIIb 基因中携带 sbeIIb-1、sbeIIb-2 和 sbeIIb-3 突变的 E1 植物，特别是针对那些被证实没有 T-DNA 插入且没有脱靶突变证据的细胞系。然后选择这些植物进行进一步的表型分析。所有植物均在自然田间条件下生长，成熟后收获种子（图 3A）。以前的研究表明，水稻胚乳的抗性淀粉含量决定了碾米表现出的透明度²⁷。sbeIIb 突变植物的颗粒呈蜡质外观，白色且完全不透明，与 X134 种子的典型半透明外观形成鲜明对比（图 3B）。突变的植物在株高（补充图 4A，C）、结实率（图 3C）、每穗粒数（图 3D）和每株产量（图 3E）方面与 X134 对照没有区别，不包括突变体中的穗长减少了 11.9%（补充图 4B，D）。

sbeIIb 的 RS 含量为 5.2%，而 X134 野生型 为 0.6%（图 4A）。为了进一步研究功能意义，我们评估了食用 RS 米后的血糖反应。我们的结果表明，食用 RS 大米导致大米食用后 9.7 分钟和 3.7 分钟的葡萄糖反应分别降低 30% 和 30%（图 4B）。重要的是，与食用 X134 大米的个体相比，食用突变大米的个体的血糖水平上升得更慢，这表明 RS 大米在血糖控制方面的潜在应用（图 4B）。

图 1:利用基因组编辑技术培育抗性淀粉稻的模型。 该模型说明了关键步骤:将载体递送到农杆菌细胞中，农杆菌感染水稻愈伤组织，水稻芽再生，收获稻粒，以及抗性淀粉分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:sbeIIb 突变体的基因型和预测蛋白序列。 sbellb-1、sbellb-2 和 sbellb-3 的 Sanger 测序色谱图。黑色表示正常的氨基酸序列。黑色虚线表示氨基酸的移码突变，红色表示终止密码子。目标位置以红色箭头显示。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3: sbeIIb 突变体的农艺特性和籽粒品质。 （A） sbeIIb 的植物表型。（B） 糙米 X134 和 sbeIIb-1 突变体外观的比较。（C-E）X134 和 sbeIIb 的结实率、每穗粒数和每株植物产量。数据是 SD ±平均值;NS 表示根据学生 t 检验 n=20 无显著差异。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:成熟谷物中的抗性淀粉含量和血糖水平。 （A） sbeIIb 颗粒中抗性淀粉含量的测量，n=3。（B） 食用 sbeIIb 大米后的血糖曲线。数据是 SD ±平均值;**， 根据 学生 t 检验，p < 0.01，n=5。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1:CRISPR/Cas-SF01 的载体。请点击此处下载此文件。

补充图 2: OsSBEIIb 和 sbeIIb 突变体的预测蛋白序列。 移码序列用红色标记。 请点击此处下载此文件。

补充图 3:sbeIIb-1 突变体的植物性状分析。 （A） sbeIIb-1 突变体的生长表型。（B） sbeIIb-1 突变体的刺突模式。（C） sbeIIb-1 突变体的株高。（D） sbeIIb-1 突变体的圆穗长度。数据是 SD ±平均值;NS 表示无显著差异;**， 根据 学生 t 检验，p < 0.01。 请点击此处下载此文件。

补充图 4.请点击此处下载此文件。

补充表 1.本研究中使用的引物列表。请点击此处下载此文件。

在构建基于 CRISPR/Cas-SF01 的敲低载体的过程中，单向导 RNA （sgRNA） 的精心选择至关重要。这需要采用具有高编辑效率和最小脱靶效应的序列。此外，靶向引物的合成结合了与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸，确保无缝集成。值得注意的是，与以前需要顺序酶消化、凝胶纯化和连接的方法不同，我们的研究通过将酶切割和连接整合到一个一体化系统中来简化该过程。此增强功能提高了运营效率并缩短了实验时间。

当将 Cas-SF01 与经典 Cas 9 核酸酶进行比较时，出现了明显的优势，突出了其在分子植物育种中的潜力。这些优势共同使 Cas-SF01 成为农业生物技术中前景广阔的工具。首先，Cas-SF01 较小的蛋白质大小可能会提高植物中的细胞递送效率。其次，其较短的 crRNA 序列有助于设计多重靶向策略，从而实现更复杂的遗传修饰²⁸。第三，与 Cas9 的典型 1 -bp 插入缺失相比，Cas-SF01 通常会诱导大规模突变，表明其可能发生更实质性的遗传改变²⁹。

在作物基因编辑领域，有几个因素在确保成功结果方面起着关键作用。首先，必须确认编辑品种中的基因序列，以防止任何可能阻碍 sgRNA 识别的潜在插入、缺失或单核苷酸多态性 （SNP），从而影响编辑过程的效率。其次，选择合适的农 杆菌 菌株进行转化取决于所使用的水稻品种，这突出了菌株选择对于在不同水稻品种中实现成功基因编辑的重要性。此外，E0 代编辑幼苗的基因分型对于保证突变类型的一致性至关重要。这种基因分型应在生长 1 个月后进行，利用从每个分蘖最上面的叶子中提取的 DNA。由于 Cas-SF01 卓越的编辑效率，可以在 E0 代中获得纯合编辑的品系，从而促进 E1 代中不含 T-DNA 的材料的选择，从而加快育种过程。在评估农艺性状之前，建立编辑后的表型至关重要，因为这有助于理解其对其他性状的影响并确定新品种的所需特征。

此过程有修改和故障排除。在处理各种作物物种时，必须比较 Cas9、Cpf1 和 Cas-SF01 的编辑效率，以确定最适合预期基因修饰的工具。此外，如果在 E0 代中无法识别纯合编辑品系，则可能需要增加筛选样本量或引入额外的一代种植和筛选以获得无纯合子的植物。

本研究选择 U6 启动子是基于其在植物基因组编辑中的广泛使用和既定功效，Lv 等人最近在有效创造功能性水稻品种方面的工作证明了这一点²⁹。该启动子已在水稻中进行了彻底的验证和优化，我们选择遵循这一成熟的途径来确保我们结果的可靠性和可重复性。正如 Čermák 等人 ³⁰ 所建议的那样，在承认 CmYLCV 启动子的潜在优势的同时，我们认识到，进一步研究比较我们特定实验系统中不同启动子的性能将提供有价值的见解。

使用基因编辑技术精确修饰植物中的功能性基因组位点强调了高效载体递送和基因突变检测的重要性。为了将编辑后的植物品系推进到新的作物品种中，必须确定靶基因的纯合状态并选择不含外源 T-DNA 片段的个体。该方案是为高抗性淀粉强化的水稻品种开发的，强调了基因编辑技术在加速功能性水稻育种方面的潜力。

该手稿旨在通过提出一种通过基因编辑创造功能性水稻品种的全面和系统的方法，为该领域做出贡献。该研究不仅仅是描述基因编辑工具的应用;相反，它侧重于多个方面的整合，从基因选择和编辑工具优化到详细的表型和农艺性状分析。总之，虽然这项工作可能不会引入全新的技术或基因，但它通过展示一种通过基因编辑创造功能性水稻品种的全面而严格的方法，为该领域做出了贡献。

作者没有需要披露的利益冲突。

这项工作得到了生物育种重大项目 （2023ZD04074） 的资助。