التربية حسب التصميم للأرز الوظيفي باستخدام تقنيات تحرير الجينوم

يصف البروتوكول تربية أصناف الأرز النشوي المقاوم حسب التصميم باستخدام تقنيات تحرير الجينوم بطريقة دقيقة وفعالة وبسيطة من الناحية الفنية.

تواجه الأساليب التقليدية لتربية المحاصيل ، والتي تعتمد في الغالب على الأساليب التي تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة مثل التهجين التقليدي وتربية الطفرات ، تحديات في إدخال الصفات المستهدفة بكفاءة وتوليد مجموعات نباتية متنوعة. على العكس من ذلك ، أدى ظهور تقنيات تحرير الجينوم إلى نقلة نوعية ، مما مكن من التلاعب الدقيق والسريع بجينومات النبات لإدخال الخصائص المرغوبة عن قصد. واحدة من أكثر أدوات التحرير انتشارا هي نظام CRISPR / Cas ، والذي استخدمه الباحثون لدراسة المشكلات المهمة المتعلقة بعلم الأحياء. ومع ذلك ، فإن سير العمل الدقيق والفعال لتحرير الجينوم لم يتم تحديده جيدا في تربية المحاصيل. في هذه الدراسة ، أظهرنا العملية الكاملة لتربية أصناف الأرز المخصبة بمستويات عالية من النشا المقاوم (RS) ، وهي سمة وظيفية تلعب دورا مهما في الوقاية من أمراض مثل السكري والسمنة. شمل سير العمل عدة خطوات رئيسية ، مثل اختيار جين SBEIIb الوظيفي ، وتصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) ، واختيار ناقل تحرير الجينوم المناسب ، وتحديد طريقة توصيل النواقل ، وإجراء زراعة الأنسجة النباتية ، وطفرة التنميط الجيني وتحليل النمط الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، تم توضيح الإطار الزمني اللازم لكل مرحلة من مراحل العملية بوضوح. لا يعمل هذا البروتوكول على تبسيط عملية التكاثر فحسب ، بل يعزز أيضا دقة وكفاءة إدخال السمات ، وبالتالي تسريع تطوير أصناف الأرز الوظيفية.

يعتمد التربية التقليدية على إدخال السمات في المحاصيل أو إنتاج مجموعات نباتية ذات تباين كاف ، الأمر الذي يتطلب مراقبة ميدانية طويلة الأجل^1،2. نظرا لقيود التربية التقليدية ، تم تطوير تقنية تحرير الجينات ، والتي يمكنها تعديل جينوم المحاصيل بدقة للحصول على السمات المرغوبة لمجموعات النباتات³. نظام تحرير الجينات الأكثر استخداما في النباتات هو CRISPR / Cas (Retroed Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / Cas endonuclate المرتبط ب CRISPR) ، والذي يعتمد على نوكلياز داخلي موجه بالحمض النووي الريبي القابل للبرمجة لإنشاء فواصل مزدوجة الخيط المستهدفة (DSBs) في الحمض النووي^4،5. ثم يتم إصلاح DSBs هذه بواسطة آليات إصلاح الحمض النووي الطبيعية^{للخلية 6،7} ، مما يؤدي غالبا إلى إدخال التغييرات الجينية المرغوبة. على الرغم من أن هذه التقنية قد تم تنفيذها في محاصيل مختلفة ، بما في ذلك القمح⁸ والذرة⁹ وفول الصويا¹⁰ والأرز¹¹ ، إلا أنها تستخدم في الغالب للكشف عن المشاكل البيولوجية. بالمقارنة مع تطبيقه المكثف في توضيح وظائف الجينات النباتية ، لا تزال الأبحاث حول تطبيق تقنيات تحرير الجينات على تربية المحاصيل نادرة نسبيا¹².

عادة ما تتبع عملية تحرير الجينات في المحاصيل سير عمل محددا جيدا يشمل عدة خطوات رئيسية¹³. تتضمن الخطوة الأولى تحديد الجين أو المنطقة الجينية المحددة التي تحتاج إلى تعديل لتحقيق السمة المرغوبة. ثانيا ، تم تصميم استراتيجية تحرير الجينات ، والتي تتضمن اختيار نظام تحرير الجينات المناسب (على سبيل المثال ، CRISPR-Cas9 أو CRISPR-Cas12) وتصميم دليل محدد للحمض النووي الريبي لتوجيه نوكلياز داخلي إلى الموقع المستهدف. ثالثا ، يتم بعد ذلك دمج نظام تحرير الجينات في ناقل التوصيل ، والذي يستخدم لإدخال آلية التحرير في الخلايا النباتية. يمكن أن تكون هذه النواقل مجمعات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين النووي الريبي (RNP). بعد ذلك ، يتم تسليم نواقل تحرير الجينات إلى الخلايا النباتية باستخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك التحول بوساطة Agrobacterium أو قصف الجسيمات أو التثقيب الكهربائي. على الفور ، يتم زراعة الخلايا النباتية المحولة في ظل ظروف مناسبة لتوليد الكالس المعدل وراثيا أو الأنسجة الجنينية. ثم يتم تجديد هذه الأنسجة إلى نباتات كاملة من خلال تقنيات زراعة الأنسجة. تخضع النباتات المتجددة للتوصيف الجزيئي الصارم لتأكيد وجود التغيرات الجينية المرغوبة.

تقدم مقالة سابقة بقلم Tsakirpaloglou et ^al.14 نظرة عامة واسعة على عملية تحرير الجينات ، من تصميم النواقل إلى توليد الشتلات المعدلة ، لكنها لا تتعمق في التحليل التفصيلي لسمات محددة مرتبطة بالجين المستهدف ولا التقييم اللاحق للأداء الزراعي أو التحقق الوظيفي من صحة المحاصيل المعدلة. لقد تجاوزنا مجرد إثبات جدوى تحرير الجين في الأرز. يقيم عملنا بشكل شامل تأثير هذا التعديل على السمات الكيميائية الحيوية والجزيئية والزراعية لخطوط الأرز المعدلة. يتضمن ذلك تقييم تكوين النشا ، وهو عامل حاسم يؤثر على جودة الحبوب والقيمة الغذائية ، والذي لم يتم استكشافه على نطاق واسع في دراسات تحرير الجينات السابقة.

يتكون نشا الأرز عادة من ~ 20٪ أميلوز و ~ 80٪ أميلوبكتين¹⁵. SBEIIb هو إنزيم ضروري لتخليق الأميلوبكتين ويتم التعبير عنه في السويداء¹⁶. أدى الضربة القاضية ل OsSBEIIb بواسطة الحمض النووي الريبي الشعري (RNAi) وتعبير الحمض النووي الريبي الصغير من محتوى النشا المقاوم^17،18. النشا المقاوم هو نشا ركيزة لا يمكن هضمه وامتصاصه في الأمعاء الدقيقة ولكنه قادر على تقسيمه إلى أحماض دهنية قصيرة السلسلة وغازات بواسطة بعض البكتيريا الهضمية في الأمعاء. نظرا لأنه لا يمكن تكسيره بسرعة ، فإنه يحتوي على مؤشر نسبة السكر في الدم أقل مقارنة بالنشويات الأخرى ولا يسبب ارتفاعا سريعا في نسبة السكر في الدم خلال فترة زمنية قصيرة بعد تناول الطعام ، مما قد يخفف من مرض السكري إلى حد ما في النظام الغذائي¹⁹. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النشا المقاوم له وظائف فسيولوجية أكثر ، مثل تقليل استجابة الأنسولين ، وتنظيم وظيفة الأمعاء ، ومنع تراكم الدهون ، وتسهيل التحكم في الوزن ، وتعزيز امتصاص الأيونات المعدنية. لذلك ، يتم متابعته على نطاق واسع كنوع جديد من الألياف^{الغذائية 20}.

للتغلب على هذه التحديات والاستفادة بنجاح من تقنيات تحرير الجينات لتربية أصناف الأرز الوظيفية ، قمنا بتحسين وتحسين البروتوكولات التشغيلية داخل الأرز. كان تركيزنا على تحليل تصميم مواقع الجينات المستهدفة بدقة ، واختيار أنسب أدوات تحرير الجينات بعناية ، وإجراء تحليل صارم للنمط الظاهري طوال عملية التربية. كدليل على قوة وكفاءة هذه التقنيات ، نقدم دراسة حالة تعرض التطور السريع لصنف أرز وظيفي غني بالنشا عالي المقاومة. يؤكد هذا المثال على إمكانات تحرير الجينات في تسريع تربية الأرز الوظيفي ، ومعالجة الندرة الحالية للأبحاث في هذا المجال.

أجريت الدراسة في شركة Bellagen Biotechnology Co. Ltd في الصين وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري. قبل المشاركة ، تم شرح بروتوكول الدراسة بدقة للمشاركين ، الذين قدموا الموافقة المستنيرة.

1. تصميم sgRNA وناقلات البناء (توقيت 5-7 أيام)

ملاحظة: تم استخدام متجه ثنائي للتعبير عن نظام CRISPR / Cas-SF01²¹. لا يحتوي على أقل من 3 نيوكليوتيدات (nt) غير متطابقة مع الموقع المحتمل خارج الهدف ل sgRNA. يحتاج محول sgRNA إلى استكمال الطرف اللاصق ، والذي يتم إنشاؤه بواسطة هضم إنزيم Bsa I لناقل التحرير. استند اختيار البرنامج إلى الكفاءة العالية والخصوصية المبلغ عنها للبرنامج في الأرز¹⁴ ، فضلا عن سهولة استخدامه وإمكانية الوصول إليه لمجموعة البحث.

1. انتقل إلى موقع NCBI على الويب (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) لاسترداد جين OsSBEIIb (LOC4329532) في Japonica. قم بتنزيل الجينوم المرجعي والوصول إليه داخل برنامج SnapGene.
2. قم بتحليل عمليات الإدراج / الحذف (InDel) وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) في تسلسل exon ل OsSBEIIb من صنف X134 ، ومقارنته بالجينوم المرجعي. استخدم NCBI Primer Blast²² لتصميم بادئات تحيط بمناطق exon (الجدول التكميلي 1).
3. للتحقق من صحة تسلسل exon لجين OsSBEIIb في X134 عن طريق تسلسل Sanger ، قم بإعداد التفاعل على النحو التالي: 10 ميكرولتر من مخزن خلط البوليميراز مع 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، 1 ميكرولتر من gDNA من أنسجة X134 و 7 ميكرولتر من الماء المقطر. تشغيل برنامج PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية ، 3 دقائق ؛ (95 درجة مئوية ، 20 ثانية - 56 درجة مئوية ، 30 ثانية - 72 درجة مئوية ، 60 ثانية) مع 35 دورة ، و 72 درجة مئوية ، 5 دقائق.
4. صمم sgRNA على تسلسل إكسون OsSBEIIb ل X134 ، مع الالتزام ببروتوكول Tsakirpaloglou et ^al.14والتأكد من أن تسلسل PAM هو TTN.
5. قم بتعديل تسلسل sgRNA عن طريق إضافة -ACAC- oligos في نهاية 5 'من التمهيدي الأمامي وإضافة -GGCC- oligos في نهاية 5 'من التمهيدي العكسي. قم بتجميع الاشعال الأمامية / العكسية تجاريا (ل sgRNA).
6. قم بإذابة البادئات الأمامية والخلفية بتركيز 10 ميكرولتر / لتر ، وخذ 1 ميكرولتر من كل منها ، وأضفها إلى 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت الصلب (مخزن ثلاثي الأبعاد لليد + 50 ملي كلوريد الصوديوم) واخلطه عن طريق سحب العينات. ضعه في جهاز PCR وقم بتشغيل برنامج التلدين على النحو التالي على جهاز PCR: عملية التبريد البطيئة من 95 درجة مئوية إلى 16 درجة مئوية عند 0.1 درجة مئوية / ثانية.
7. قم بتجميع sgRNA في ناقل تحرير الجينوم. قم بإعداد التفاعل على النحو التالي: 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للخلط مع 0.5 ميكرولتر من T4 DNA ligase ، 1 ميكرولتر من Bsa I ، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييد 10x ، 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffere ، 2 ميكرولتر من بادئات التلدين ، 2.5 ميكرولتر من المتجه (يتم ضبط حجمه ليناسب النسبة) و 10 ميكرولتر من الماء المقطر. في جميع الحالات ، استخدم نسبة إدراج إلى متجه 2: 1 لتحقيق كفاءة التجميع. قم بتشغيل برنامج تجميع PCR ك (37 درجة مئوية ، 2 دقيقة ؛ 16 درجة مئوية ، 3 دقائق) مع 30 دورة ، و 55 درجة مئوية ، 30 دقيقة.
8. تحويل المتجه الناتج إلى بكتريا قولونية الخلايا كما هو موضح²³.
9. تصميم بادئات تحيط بموقع إدخال الحمض النووي الريبي داخل البلازميد. باستخدام هذه البادئات ، قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل على المستعمرات الفردية للكشف عن عمليات الإدراج الناجحة. قم بإجراء تسلسل Sanger لمنتجات PCR لتأكيد الاستنساخ الناجح وعزل البلازميد²⁴.

2. تحويل Agrobacterium (التوقيت 4 أيام)

1. قم بإذابة الخلية المختصة EHA105 Agrobacterium على الجليد. أضف 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (الذي يحتوي على ~ 100-200 نانوغرام من الحمض النووي) إلى تعليق الخلية واخلطه برفق.
2. قم بإجراء تحويل الصدمة الحرارية عن طريق وضع الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق ، والنيتروجين السائل لمدة 5 دقائق ، والصدمة الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم في الحمام الجليدي لمدة 5 دقائق.
3. أضف 700 ميكرولتر من وسائط الببتون المستخلص من الخميرة (YEP) ، بدون مضادات حيوية ، إلى الأنبوب واخلطها برفق. استرجع الخلايا في حاضنة اهتزاز عند 28 درجة مئوية ، 200-250 دورة في الدقيقة ، لمدة 2-3 ساعات.
4. جهاز الطرد المركزي للثقافة عند 2,800 × جم لمدة 1 دقيقة. تخلص من معظم المادة الطافية ، تاركا حوالي 100 ميكرولتر ، وأعد تعليق الخلايا. انشر الخلايا على ألواح أجار YEP التي تحتوي على 1٪ مضادات حيوية (كاناميسين وريفامبيسين) لاختيار البلازميد. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
5. قم بربط صفيحة YEP (مع مقاومة المضادات الحيوية) بطرف ماصة يحتوي على مستعمرة واحدة من Agrobacterium التي تؤوي CRISPR / Cas وانقل الخلايا إلى 5 مل من وسائط YEP السائلة مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان السائل عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
6. قم بتخزين سلالات Agrobacterium المحولة كمخزون من الجلسرين عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.

3. تحول الأرز بواسطة Agrobacterium (توقيت 3 أشهر)

ملاحظة: تم الإبلاغ عن العديد من طرق تحويل النبات لتوصيل تسلسل الحمض النووي الغريب والتعبير عنه في الخلية النباتية²⁵. بالنظر إلى تكامل النسخة الواحدة والتردد المنخفض ل DSBs في الجينوم ، فإن التحول بوساطة Agrobacterium هو الطريقة المفضلة لدمج جزء الحمض النووي للتعبير في كروموسومات الأرز.

1. إجراء تحويل الأرز بوساطة Agrobacterium باتباع البروتوكول في²⁵. يعتبر الكالي الذي ينمو بنشاط (أبيض مصفر ، جاف نسبيا ، وقطره 1-3 مم) نقطة أساسية للتحول الفعال. تخلص من البذور ذات نمو الشتلات أو الكالس البني قبل إصابة الكالس بالبكتيريا.

4. التنميط الجيني للنباتات المعدلة وراثيا وحصاد البذور (توقيت 8 أشهر)

ملاحظة: سيتم زراعة جيلين من الأرز لتحقيق طفرة متماثلة اللواقح وخطوط أجنبية خالية من الحمض النووي.

1. أخذ عينات من أنسجة الشتلات: زرع النباتات المعدلة وراثيا في الأواني وزراعتها لمدة شهر واحد في دفيئة. لفحص نوع الطفرة ، اجمع 2-3 مجم من الأوراق الطازجة من كل حارث لشتلة واحدة ودمجها في عينة واحدة.
2. استخراج الحمض النووي الجيني: اتبع بروتوكولا راسخا لاستخراج الحمض النووي لجينوم النبات²⁶.
3. تصميم بادئات الطفرات (الجدول التكميلي 1): تصميم بادئات PCR لتضخيم منطقة جين SBEIIb المحيطة بالموقع المستهدف sgRNA¹⁴. يبلغ طول الجزء المضخم 493 نقطة أساس.
4. التنميط الجيني للطفرة: تسلسل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة أو استنساخها في ناقل استنساخ T وتسلسله باستخدام طريقة سانجر لتحديد الطفرات¹⁴.
5. حصاد البذور: اختر خطوط E0 التي تظهر طفرات تحول الإطار متماثلة اللواقح وزرعها في دفيئة للحصول على البذور.
6. تصميم الاشعال لتحديد T-DNA: صمم ثلاثة بادئات محددة لشريط Hygromycin ، كاسيت UBI ، وكاسيت Cas للبناء لتحديد الخطوط الغريبة الخالية من الحمض النووي بين الطفرات (الجدول التكميلي 1).
7. تأكيد الخطوط الأجنبية الخالية من T-DNA: حصاد الأوراق من شتلات عمرها أسبوعين واستخرج الحمض النووي لجينوم النبات كما هو موضح في الخطوة 4.2. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الجيني مع البرنامج التالي: 95 درجة مئوية ، 3 دقائق ؛ (95 درجة مئوية ، 20 ثانية - 56 درجة مئوية ، 30 ثانية - 72 درجة مئوية ، 60 ثانية) مع 35 دورة ، و 72 درجة مئوية ، 5 دقائق. هذا يسمح بالكشف عن كاسيت hygromycin و UBI و Cas في جينوم النبات.
8. قم بتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وحدد الخطوط التي لا تظهر أي نطاقات ، مما يشير إلى أنها خطوط E1 خالية من الجينات المعدلة وراثيا. احصد البذور من هذه الخطوط المختارة.

5. قياس محتوى النشا المقاوم (توقيت 4 أيام)

1. احصد بذور النباتات الطافرة و X134 واتركها تجف بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة ، مع الحفاظ على محتوى رطوبة حوالي 13٪ -15٪. حدد محتوى النشا المقاوم باستخدام إجراء البنكرياس α-أميلوز / أميلوجلوكوزيداز (AMG) الموضح أدناه.
2. قم بتنشيط آلة التقشير وأدخل 10 جم من حبوب الأرز في وحدة التغذية لإزالة قشرة الجلوم بكفاءة ، مما ينتج عنه بذور الأرز المعالجة.
3. انقل بذور الأرز المقشرة إلى مطحنة الأرز وقم بتشغيلها لمدة 60 ثانية للتخلص من طبقة الألورون ، مما ينتج عنه أرز مصقول.
4. ضع الأرز المصقول في مطحنة المناديل ، واضبط تردد الطحن على 60 هرتز. قم بتشغيل المطحنة لمدة 15 ثانية ، وكرر الدورة 2x لإنتاج مسحوق الأرز.
5. ضعي مسحوق الأرز المطحون في طبق بتري وضعيه في فرن مسخن مسبقا. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية واتركها تجف لمدة 12 ساعة.
6. تزن بدقة 100 مجم ± 5 ملغ من العينات وتصب مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل. اضغط برفق على الأنبوب للتأكد من استقرار العينة في الأسفل.
7. أضف 180 ميكرولتر من الماء النقي إلى الأنبوب واغلي العينات لمدة 20 دقيقة في حمام مائي.
8. اترك العينات لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم أدخل 4 مل من AMG (3 U / mL) التي تحتوي على α أميليز البنكرياس (10 مجم / مل) في كل أنبوب.
9. قم بتغطية الأنابيب بإحكام ، واخلطها على مذبذب دوامة ، واحتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع التحريك المستمر.
10. أضف 4 مل من الإيثانول واخلطه باستخدام دوامة. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق.
11. صب المادة الطافية ، أضف 2 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ متبوعا ب 6 مل من 50٪ IMS ، واخلطها باستخدام دوامة وجهاز طرد مركزي.
12. اسكب المادة الطافية بحذر واقلب الأنبوب لتصريف أي سائل زائد. ضع الأنابيب في حمام جليدي ، وأضف 2 مل من 2 M KOH إلى كل أنبوب ، وحرك العينات لمدة 20 دقيقة لإعادة تعليق الكتلة وإذابة النشا المقاوم.
13. أضف 8 مل من محلول أسيتات الصوديوم 1.2 M (درجة الحموضة 3.8) إلى كل أنبوب اختبار واخلطه باستخدام محرك مغناطيسي.
14. أدخل على الفور 0.1 مل من AMG (3300 وحدة / مل) ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حمام مائي عند 50 درجة مئوية مع الخلط المتقطع باستخدام دوامة. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق.
15. انقل 0.1 مل من المادة الطافية إلى أنبوب زجاجي ، وأضف 3 مل من كاشف الجلوكوز أوكسيديز / بيروكسيداز (GOPOD) واحتضانه عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد كاشف فارغ عن طريق خلط 0.1 مل من 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم و 3 مل من كاشف GOPOD. قم بإعداد المعايير عن طريق خلط 0.1 مل من D-glucose مع 3 مل من كاشف GOPOD.
16. قم بتعبئة 200 ميكرولتر من كل محلول فارغ بعناية، والمحلول المراد اختباره، والمحلول القياسي في لوح سعة 96 بئرا.
17. قم بقياس امتصاص كل عينة عند 510 نانومتر مقابل المحلول الفارغ واحسب محتوى النشا المقاوم باستخدام الصيغة المقدمة.
    النشا المقاوم (جم / 100 جم) = ΔA × F / W ×9.27
    حيث ΔA = الامتصاص يقرأ مقابل الكاشف الفارغ. F = التحويل من الامتصاص إلى ميكروغرام (يتم تحديد الامتصاص الذي تم الحصول عليه ل 100 ميكروغرام من D-glucose في تفاعل GOPOD) ؛ W = الوزن الجاف للعينة التي تم تحليلها.

6. استجابة جلوكوز الدم بعد الأكل (التوقيت 5 أيام)

1. استخدم معايير الاشتمال التالية للمشاركين: البالغون الصينيون الآسيويون الأصحاء الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و60 عاما، وغير المدخنين، ومؤشر كتلة الجسم (BMI) بين 18.5 و25 كغ/^م2، وضغط الدم الطبيعي (< 140/90 ملم زئبق). استخدم معايير الاستبعاد التالية: أمراض التمثيل الغذائي (مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وما إلى ذلك) أو اضطرابات الجهاز الهضمي أو تشوهات الغدد الصماء أو الأمراض العقلية. تم فحص ما مجموعه 10 مشاركين وتجنيدهم.
2. إجراء جلسة الاختبار (تمتد ليومين متتاليين)
   1. اليوم 0 (يوم التحضير): اطلب من المشاركين الحفاظ على أنماط نوم منتظمة ونظام غذائي طبيعي لأول 3 أيام تسبق الاختبار. في الليلة التي تسبق الاختبار (بعد الساعة 20:00) ، اطلب من المشاركين الامتناع عن الوجبات الغنية بالألياف والسكر. لا ينصح بممارسة التمارين الرياضية القوية في صباح اليوم الأول.
   2. اليوم 1 (يوم الاختبار): تحضير الأرز الأبيض عن طريق طحن بذور الأرز ، ثم اشطف الأرز الأبيض 2x. املأ قدرا ب 1.5 جزء من الماء إلى جزء واحد من الأرز الأبيض. اسلقي الأرز حتى يمتص الماء بالكامل. أطفئي النار وغطي القدر واتركيه يرتاح لمدة 10 دقائق.
   3. قم بتعيين المشاركين العشرة عشوائيا إلى مجموعتين متساويتين: مجموعة اختبار واحدة ليتم إطعامها بالأرز الأبيض المقاوم للنشا ومجموعة ضابطة واحدة ليتم إطعامها بالأرز الأبيض X134. اطلب من المشاركين الراحة لمدة 10 دقائق قبل بدء الاختبار.
   4. تعقيم أطراف الأصابع بالكحول الطبي بنسبة 75٪. اضغط برفق على جهاز إبرة الوخز على طرف الإصبع وحرر الزنبرك لوخز الجلد. اضغط برفق على الإصبع لإنتاج قطرة دم صغيرة ولمس هذه القطرة إلى الطرف الممتص للدم من شريط الاختبار في جهاز القياس. يقوم جهاز القياس تلقائيا بسحب الدم ويبدأ عملية الاختبار. انتظر حتى تظهر قراءة جلوكوز الدم.
   5. استهلاك الأرز وأخذ عينات الدم: قدم للمشاركين 50 جراما من الأرز المحضر مع 200 مل من الماء واطلب منهم تناوله بوتيرة مريحة في غضون 5-10 دقائق. بعد الوجبة ، اجمع عينات الدم الوريدية في النقاط الزمنية التالية: 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 90 دقيقة و 120 دقيقة من بداية الوجبة. قم بإجراء تحليل جلوكوز الدم كما في الخطوة 6.2.4.

في هذه الدراسة ، تم عرض الإجراءات الكاملة لتربية الأرز الوظيفي عن طريق تحرير الجينوم للحصول على أصناف مستقرة من أرز النشا المقاومة. قمنا بدمج sgRNA الذي يستهدف SBEIIb في CRISPR / Cas-SF01 (الشكل التكميلي 1) ، وتسلل الأرز باستخدام تحويل Agrobacterium ، وحصلنا على نباتات توليد E0 بعد مراحل الغربلة والتجذير. تم فحص النباتات التي تفقد وظيفة الجينات ، وتم تحديد محتواها من النشا المقاوم بعد حصاد البذور (الشكل 1). تم العثور على طفرات متماثلة اللواقح (20.8٪) في نباتات E0 عن طريق تسلسل Sanger ، و sbeIIb-1 (-2bp ، CC) ، و sbeIIb-2 (-4bp ، AGCC) ، و sbeIIb -3 (-4bp ، GTGC) في التسلسل المستهدف أنتجت إزاحة الإطار في منطقة الترميز مما أدى إلى ظهور بروتينات غير وظيفية (الشكل 2 ، الشكل التكميلي 2 ، والشكل التكميلي 3).

تم إجراء عملية اختيار دقيقة لتحديد نباتات E1 التي تؤوي طفرات sbeIIb-1 و sbeIIb-2 و sbeIIb-3 في جين SBEIIb ، مستهدفة على وجه التحديد تلك الخطوط التي تم تأكيد خلوها من إدخالات T-DNA ولا تظهر أي دليل على وجود طفرات خارج الهدف. ثم تم اختيار هذه النباتات لمزيد من تحليل النمط الظاهري. نمت جميع النباتات في ظل ظروف الحقول الطبيعية وتم حصاد البذور بعد النضج (الشكل 3 أ). أشارت الدراسات السابقة إلى أن محتوى النشا المقاوم في السويداء للأرز يحدد درجة الشفافية التي يظهرها الأرز المطحون²⁷. كانت حبيبات النباتات المتحولة sbeIIb ذات مظهر شمعي ، كونها بيضاء وغير شفافة تماما على عكس المظهر الشفاف النموذجي لبذور X134 (الشكل 3 ب). لم يكن من الممكن تمييز النباتات المتحولة عن التحكم X134 في ارتفاع النبات (الشكل التكميلي 4 أ ، ج) ، ومعدل وضع البذور (الشكل 3 ج) ، وعدد الحبوب لكل عناقيد (الشكل 3 د) ، والمحصول لكل نبات (الشكل 3 ه) ، باستثناء طول العناقيد انخفض بنسبة 11.9٪ في الطفرات (الشكل التكميلي 4 ب ، د).

تبلغ محتويات RS في sbeIIb 5.2٪ مقارنة بالنوع البري X134 0.6٪ (الشكل 4 أ). لمزيد من التحقيق في الآثار الوظيفية ، قمنا بتقييم استجابة الجلوكوز في الدم بعد تناول أرز RS. أشارت نتائجنا إلى أن استهلاك أرز RS أدى إلى انخفاض بنسبة 9.7٪ و 3.7٪ في استجابة الجلوكوز بعد 15 دقيقة و 30 دقيقة من استهلاك الأرز ، على التوالي (الشكل 4 ب). الأهم من ذلك ، أن مستويات الجلوكوز في الدم لدى الأفراد الذين يستهلكون الأرز المتحور ارتفعت بشكل أبطأ مقارنة بأولئك الذين يستهلكون أرز X134 ، مما يشير إلى التطبيقات المحتملة لأرز RS في التحكم في نسبة السكر في الدم (الشكل 4 ب).

الشكل 1: نموذج لتربية أرز النشا المقاوم بتقنية تحرير الجينوم. يوضح هذا النموذج الخطوات الرئيسية: توصيل الناقل إلى خلية Agrobacterium ، وإصابة مسمار الأرز بالبكتيريا الزراعية ، وتجديد براعم الأرز ، وحصاد حبوب الأرز ، وتحليل النشا المقاوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النمط الجيني وتسلسل بروتين التنبؤ لطفرات sbeIIb . كروماتوغرامات تسلسل سانجر ل sbellb-1 و sbellb-2 و sbellb-3. يشير اللون الأسود إلى تسلسل الأحماض الأمينية الطبيعية. تشير الخطوط السوداء المنقطة إلى طفرات إزاحة الإطار في الأحماض الأمينية ، ويشير اللون الأحمر إلى كودون التوقف. يظهر الموضع المستهدف بسهم أحمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الخصائص الزراعية وجودة الحبوب لمتحولة sbeIIb . (أ) النمط الظاهري النباتي ل sbeIIb. (ب) مقارنات بين مظهر طفرات X134 و sbeIIb-1 للأرز البني. (C-E) معدل وضع البذور ، والحبوب لكل عناقيد ، والمحصول لكل نبات من X134 و sbeIIb. البيانات هي متوسط ± SDs. NS يعني عدم وجود فرق كبير وفقا لاختبار t للطالب ، n = 20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: محتوى النشا المقاوم في الحبوب الناضجة ومستويات الجلوكوز في الدم. (أ) قياسات محتوى النشا المقاوم في حبوب sbeIIb ، ن = 3. (ب) منحنى الجلوكوز في الدم بعد تناول أرز sbeIIb . البيانات هي متوسط ± SDs. ** ، ص < 0.01 وفقا لاختبار t للطالب ، ن = 5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: متجه CRISPR / Cas-SF01. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تسلسل بروتين التنبؤ ل OsSBEIIb والطفرات sbeIIb . يتم تمييز تسلسلات إزاحة الإطارات باللون الأحمر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تحليل السمات النباتية للطفرة sbeIIb-1. (أ) النمط الظاهري للنمو من sbeIIb-1 متحول. (ب) أنماط سبايك من sbeIIb-1 متحولة. (ج) ارتفاع النبات من sbeIIb-1 متحول. (د) طول عناقيد متحولة sbeIIb-1 . البيانات هي الوسائل ± SDs. NS يعني عدم وجود فرق كبير. ** ، ص < 0.01 وفقا لاختبار t للطالب. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1. قائمة الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

في عملية إنشاء نواقل ضربة قاضية قائمة على CRISPR / Cas-SF01 ، يعد الاختيار الدقيق للحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) أمرا محوريا. هذا يستلزم اعتماد التسلسلات التي تظهر كفاءة تحرير عالية مع الحد الأدنى من التأثيرات غير المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يشتمل توليف البادئات المستهدفة على مواقع لصق المحول القصير المطابقة للمتجه ، مما يضمن التكامل السلس. والجدير بالذكر أنه على عكس المنهجيات السابقة التي تتطلب الهضم الأنزيمي المتسلسل وتنقية الهلام والربط ، فإن دراستنا تبسط العملية من خلال دمج قطع الإنزيم وربطه في نظام الكل في واحد. يعمل هذا التحسين على تحسين الكفاءة التشغيلية وتقليل الجدول الزمني التجريبي.

عند مقارنة Cas-SF01 بنوكاليز Cas 9 المتعارف عليه ، تظهر مزايا مميزة ، مما يسلط الضوء على إمكاناته في تربية النباتات الجزيئية. هذه المزايا تضع بشكل جماعي Cas-SF01 كأداة واعدة في التكنولوجيا الحيوية الزراعية. أولا ، قد يعزز حجم البروتين الأصغر ل Cas-SF01 كفاءة التوصيل الخلوي في بلانتا. ثانيا ، تسهل تسلسلات crRNA الأقصر تصميم استراتيجيات استهداف متعددة الإرسال ، وبالتالي تمكين تعديلات جينية أكثر تعقيدا²⁸. ثالثا ، عادة ما يؤدي Cas-SF01 إلى إحداث طفرات واسعة النطاق مقارنة ب Cas9 النموذجية 1 -bp indels ، مما يشير إلى قدرته على إجراء تغييرات جينية أكثر جوهرية²⁹.

في مجال تحرير جينات المحاصيل ، تلعب عدة عوامل دورا محوريا في ضمان نتائج ناجحة. أولا ، يعد تأكيد التسلسل الجيني في الأصناف المعدلة أمرا ضروريا لمنع أي عمليات إدخال أو حذف محتمل أو تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) التي يمكن أن تعيق التعرف على sgRNA ، مما يؤثر على كفاءة عملية التحرير. ثانيا ، يختلف اختيار سلالة Agrobacterium المناسبة للتحويل بناء على صنف الأرز الذي يتم العمل معه ، مما يسلط الضوء على أهمية اختيار السلالة لتحقيق تحرير جيني ناجح في أصناف الأرز المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التنميط الجيني للشتلات المعدلة من جيل E0 أمرا بالغ الأهمية لضمان الاتساق في أنواع الطفرات. يجب إجراء هذا التنميط الجيني بعد شهر واحد من النمو ، باستخدام الحمض النووي المستخرج من الأوراق العلوية لكل حراثة. نظرا لكفاءة التحرير الرائعة ل Cas-SF01 ، يمكن تأمين الخطوط المعدلة متماثلة اللواقح في الجيل E0 ، مما يسهل اختيار المواد الخالية من T-DNA في الجيل E1 وبالتالي تسريع عملية التكاثر. قبل تقييم السمات الزراعية ، من الضروري إنشاء النمط الظاهري المعدل ، حيث يساعد ذلك في فهم تأثيره على السمات الأخرى وفي تحديد الخصائص المرغوبة للصنف الجديد.

هناك تعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في هذا الإجراء. عند التعامل مع أنواع المحاصيل المختلفة ، لا غنى عن مقارنة كفاءة التحرير ل Cas9 و Cpf1 و Cas-SF01 للتأكد من الأداة الأنسب للتعديلات الجينية المقصودة. علاوة على ذلك ، إذا تعذر تحديد الخطوط المعدلة متماثلة اللواقح في جيل E0 ، فقد يكون من الضروري زيادة حجم عينة الفحص أو إدخال جيل إضافي من الزراعة والغربلة للحصول على نباتات خالية من T-DNA متماثلة اللواقح.

استند اختيار محفز U6 لهذه الدراسة إلى استخدامه على نطاق واسع وفعاليته الراسخة في تحرير الجينوم النباتي ، كما يتضح من العمل الأخير الذي قام به Lv et ^al.29في إنشاء أصناف الأرز الوظيفية بكفاءة. تم التحقق من صحة هذا المروج وتحسينه بدقة في الأرز ، وقد اخترنا اتباع هذا المسار الراسخ لضمان موثوقية نتائجنا وقابليتها للتكرار. مع الاعتراف بالمزايا المحتملة لمروج CmYLCV ، كما اقترح Čermák et ^al.30 ، فإننا ندرك أن المزيد من التحقيقات التي تقارن أداء المروجين المختلفين في نظامنا التجريبي المحدد ستوفر رؤى قيمة.

يؤكد استخدام تقنيات تحرير الجينات لتعديل المواقع الجينومية الوظيفية بدقة في النباتات على أهمية التوصيل الفعال للنواقل واكتشاف الطفرات الجينية. لتطوير خطوط النباتات المعدلة إلى أصناف محاصيل جديدة ، من الضروري التأكد من الحالة متماثلة اللواقح للجين المستهدف واختيار الأفراد الخاليين من شظايا T-DNA الخارجية. يؤكد هذا البروتوكول ، الذي تم تطويره لصنف من الأرز المدعم بالنشا عالي المقاومة ، على إمكانات تقنية تحرير الجينات في تسريع تربية الأرز الوظيفي.

تهدف المخطوطة إلى المساهمة في هذا المجال من خلال تقديم نهج شامل ومنهجي لإنشاء أصناف وظيفية من الأرز من خلال التحرير الجيني. تتجاوز الدراسة مجرد وصف تطبيق أداة تحرير الجينات. بدلا من ذلك ، يركز على تكامل جوانب متعددة ، من اختيار الجينات وتحسين أداة التحرير إلى تحليل النمط الظاهري والزراعي التفصيلي. باختصار ، في حين أن العمل قد لا يقدم تقنيات أو جينات جديدة تماما ، إلا أنه يساهم في المجال من خلال إظهار نهج شامل وصارم لإنشاء أصناف وظيفية من الأرز من خلال تحرير الجينات.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

تم دعم هذا العمل بتمويل من مشاريع التربية البيولوجية الكبرى (2023ZD04074).