Breeding by Design für funktionellen Reis mit Genome Editing Technologies

Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.

Die konventionellen Ansätze der Pflanzenzüchtung, die überwiegend auf zeit- und arbeitsintensiven Methoden wie der traditionellen Hybridisierung und Mutationszüchtung beruhen, stehen vor Herausforderungen, wenn es darum geht, gezielte Merkmale effizient einzuführen und vielfältige Pflanzenpopulationen zu erzeugen. Umgekehrt hat das Aufkommen von Genome-Editing-Technologien einen Paradigmenwechsel eingeleitet, der eine präzise und beschleunigte Manipulation von Pflanzengenomen ermöglicht, um gewünschte Eigenschaften absichtlich einzuführen. Eines der am weitesten verbreiteten Bearbeitungswerkzeuge ist das CRISPR/Cas-System, das von Forschern verwendet wird, um wichtige biologische Probleme zu untersuchen. Der präzise und effektive Arbeitsablauf der Genom-Editierung ist in der Pflanzenzüchtung jedoch noch nicht genau definiert. In dieser Studie haben wir den gesamten Prozess der Züchtung von Reissorten demonstriert, die mit einem hohen Anteil an resistenter Stärke (RS) angereichert sind, einem funktionellen Merkmal, das eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Diabetes und Fettleibigkeit spielt. Der Arbeitsablauf umfasste mehrere wichtige Schritte, wie z. B. die Auswahl des funktionellen SBEIIb-Gens , das Design der Single-Guide-RNA (sgRNA), die Auswahl eines geeigneten Genom-Editing-Vektors, die Bestimmung der Vektorverabreichungsmethode, die Durchführung von Pflanzengewebekulturen, die Genotypisierung, die Mutation und die phänotypische Analyse. Darüber hinaus wurde der Zeitrahmen, der für jede Phase des Prozesses erforderlich ist, klar aufgezeigt. Dieses Protokoll rationalisiert nicht nur den Züchtungsprozess, sondern verbessert auch die Genauigkeit und Effizienz der Einführung von Merkmalen und beschleunigt so die Entwicklung funktioneller Reissorten.

Die traditionelle Züchtung beruht auf der Einführung von Merkmalen in Kulturpflanzen oder der Erzeugung von Pflanzenpopulationen mit ausreichender Variation, was eine langfristige Feldbeobachtung erfordert ^1,2. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen Züchtung wurde eine Gen-Editing-Technologie entwickelt, die das Genom von Nutzpflanzen präzise modifizieren kann, um die gewünschten Merkmale von Pflanzenpopulationen zu erhalten³. Das am weitesten verbreitete Gen-Editing-System in Pflanzen ist CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), das auf einer programmierbaren RNA-gesteuerten Endonuklease beruht, um gezielte Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA zu erzeugen ^4,5. Diese DSBs werden dann durch die natürlichen DNA-Reparaturmechanismen der Zelle repariert ^6,7, was oft zur Einführung der gewünschten genetischen Veränderungen führt. Obwohl diese Technologie in verschiedenen Kulturen eingesetzt wurde, darunter Weizen⁸, Mais⁹, Sojabohnen¹⁰ und Reis¹¹, wird sie hauptsächlich zur Aufdeckung biologischer Probleme eingesetzt. Verglichen mit ihrer umfangreichen Anwendung bei der Aufklärung der Genfunktionen von Pflanzen ist die Forschung zur Anwendung von Gen-Editing-Technologien in der Pflanzenzüchtung noch relativ spärlich¹².

Der Prozess der Gen-Editierung bei Nutzpflanzen folgt in der Regel einem klar definierten Arbeitsablauf, der mehrere wichtige Schritte umfasst¹³. Der erste Schritt besteht darin, das spezifische Gen oder die genetische Region zu identifizieren, die modifiziert werden muss, um das gewünschte Merkmal zu erreichen. Zweitens wird eine Gen-Editing-Strategie entwickelt, die die Auswahl eines geeigneten Gen-Editing-Systems (z. B. CRISPR-Cas9 oder CRISPR-Cas12) und das Design spezifischer Guide-RNAs umfasst, um die Endonuklease zum Zielort zu leiten. Drittens wird das Gen-Editing-System dann in einen Verabreichungsvektor eingebaut, mit dem die Editierungsmaschinerie in die Pflanzenzellen eingeführt wird. Bei diesen Vektoren kann es sich um DNA-, RNA- oder Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) handeln. Anschließend werden die Gen-Editing-Vektoren mit verschiedenen Methoden, darunter Agrobacterium-vermittelte Transformation, Partikelbeschuss oder Elektroporation, in Pflanzenzellen eingebracht. Sofort werden die transformierten Pflanzenzellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um genetisch veränderten Kallus oder embryogenes Gewebe zu erzeugen. Diese Gewebe werden dann durch Gewebekulturtechniken zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die regenerierten Pflanzen werden einer strengen molekularen Charakterisierung unterzogen, um das Vorhandensein der gewünschten genetischen Veränderungen zu bestätigen.

Ein früherer Artikel von Tsakirpaloglou et ^al.14 bietet einen umfassenden Überblick über den Gen-Editing-Prozess, vom Vektordesign bis zur Erzeugung editierter Sämlinge, geht aber weder auf die detaillierte Analyse spezifischer Merkmale ein, die mit dem Zielgen verbunden sind, noch auf die anschließende Bewertung der agronomischen Leistung oder der funktionellen Validierung der editierten Pflanzen. Wir sind mehr als nur der Nachweis der Machbarkeit der Editierung eines Gens in Reis gegangen. Unsere Arbeit bewertet umfassend die Auswirkungen dieser Bearbeitung auf die biochemischen, molekularen und agronomischen Eigenschaften der editierten Reislinien. Dazu gehört auch die Bewertung der Stärkezusammensetzung, ein kritischer Faktor, der die Getreidequalität und den Nährwert beeinflusst und in früheren Gen-Editing-Studien nicht umfassend untersucht wurde.

Reisstärke besteht typischerweise aus ~20% Amylose und ~80% Amylopektin¹⁵. SBEIIb ist ein Enzym, das für die Amylopektinsynthese essentiell ist und im Endosperm^{exprimiert wird 16}. Der Knockdown von OsSBEIIb durch Hairpin-RNA (RNAi) und microRNA-Expression erhöhte den Gehalt an resistenter Stärke^17,18. Resistente Stärke ist ein Substratstärke, das im Dünndarm nicht verdaut und aufgenommen werden kann, aber von bestimmten Verdauungsbakterien im Darm in kurzkettige Fettsäuren und Gase zerlegt werden kann. Da es nicht schnell abgebaut werden kann, hat es im Vergleich zu anderen Stärken einen niedrigeren glykämischen Index und verursacht innerhalb kurzer Zeit nach dem Essen keinen schnellen Anstieg des Blutzuckers, was Diabetes in der Diät bis zu einem gewissen Grad lindern kann¹⁹. Darüber hinaus hat resistente Stärke physiologischere Funktionen, wie z. B. die Verringerung der Insulinreaktion, die Regulierung der Darmfunktion, die Verhinderung von Fettansammlungen, die Erleichterung der Gewichtskontrolle und die Förderung der Aufnahme von Mineralionen. Daher wird es weithin als neue Art von Ballaststoffen verfolgt²⁰.

Um diese Herausforderungen zu meistern und Gen-Editing-Technologien erfolgreich für die Züchtung funktioneller Reissorten einzusetzen, haben wir die Betriebsprotokolle innerhalb von Reis verfeinert und optimiert. Unser Fokus lag auf der sorgfältigen Analyse des Designs der Zielgenloci, der sorgfältigen Auswahl der am besten geeigneten Gen-Editing-Tools und der Durchführung einer rigorosen phänotypischen Analyse während des gesamten Züchtungsprozesses. Als Beweis für die Leistungsfähigkeit und Effizienz dieser Technologien präsentieren wir eine Fallstudie, die die schnelle Entwicklung einer funktionellen Reissorte zeigt, die mit hochresistenter Stärke angereichert ist. Dieses Beispiel unterstreicht das Potenzial der Gen-Editierung, die Züchtung von funktionellem Reis zu beschleunigen und den derzeitigen Mangel an Forschung in diesem Bereich zu beheben.

Die Studie wurde bei Bellagen Biotechnology Co. Ltd in China nach den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung durchgeführt. Vor der Teilnahme wurde den Probanden das Studienprotokoll ausführlich erklärt, und sie gaben ihre Einverständniserklärung ab.

1. Design der sgRNA und des Konstruktionsvektors (Zeit: 5-7 Tage)

HINWEIS: Zur Expression des CRISPR/Cas-SF01-Systems²¹ wurde ein binärer Vektor verwendet. Sie dürfen nicht weniger als 3 Nukleotide (nt) mit einer potenziellen Off-Target-Stelle für sgRNA nicht übereinstimmen. Der sgRNA-Adapter muss das klebrige Ende ergänzen, das durch den Bsa I-Enzymverdau des Editierungsvektors erzeugt wird. Die Wahl der Software basierte auf der berichteten hohen Effizienz und Spezifität der Software in Reis¹⁴ sowie auf ihrer Benutzerfreundlichkeit und Zugänglichkeit für die Forschungsgruppe.

1. Navigieren Sie zur NCBI-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), um das OsSBEIIb (LOC4329532)-Gen in Japonica abzurufen. Laden Sie das Referenzgenom in der SnapGene-Software herunter und greifen Sie darauf zu.
2. Analysieren Sie die Insertionen/Deletionen (InDel) und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) in der Exon-Sequenz von OsSBEIIb aus der X134-Sorte und vergleichen Sie sie mit dem Referenzgenom. Verwenden Sie NCBI Primer Blast²² , um Primer zu entwerfen, die die Exon-Bereiche flankieren (Ergänzende Tabelle 1).
3. Um die Exonsequenz des OsSBEIIb-Gens in X134 durch Sanger-Sequenzierung zu validieren, bereiten Sie die Reaktion wie folgt vor: 10 μl Polymerase-Mix-Puffer mit 1 μl Forward-Primer, 1 μl Reverse-Primer, 1 μl gDNA aus X134-Geweben und 7 μL destilliertes Wasser. Führen Sie das PCR-Programm wie folgt durch: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) mit 35 Zyklen und 72 °C, 5 min.
4. Entwerfen Sie die sgRNA auf der OsSBEIIb-Exonsequenz von X134 unter Einhaltung des Protokolls von Tsakirpaloglou et ^al.14und stellen Sie sicher, dass die PAM-Sequenz TTN ist.
5. Modifizieren Sie die sgRNA-Sequenz, indem Sie -ACAC-Oligos am 5'-Ende des Forward-Primers und -GGCC-Oligos am 5'-Ende des Reverse-Primers hinzufügen. Kommerzielle Synthese der Vorwärts-/Rückwärtsprimer (für sgRNA).
6. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer werden auf eine Konzentration von 10 μmol/l aufgelöst, jeweils 1 μl entnommen und zu 8 μl Annealpuffer (Tris-EDTA-Puffer + 50 mM NaCl) hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt. Stellen Sie es in die PCR-Maschine und führen Sie das Annealing-Programm wie folgt auf einer PCR-Maschine aus: langsamer Abkühlprozess 95 °C auf 16 °C bei 0,1 °C/s.
7. Assemblieren Sie die sgRNA in den Genom-Editing-Vektor. Bereiten Sie die Reaktion wie folgt vor: 20 μl Mischpuffer mit 0,5 μl T4-DNA-Ligase, 1 μl Bsa I, 2 μl 10x Restriktionspuffer, 2 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 2 μl Annealing-Primer, 2,5 μl Vektor (sein Volumen wird an das Verhältnis angepasst) und 10 μl destilliertes Wasser. Verwenden Sie in allen Fällen ein Insert-to-Vector-Verhältnis von 2:1, um die Montageeffizienz zu erreichen. Führen Sie das PCR-Assemblierungsprogramm wie folgt durch: (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) mit 30 Zyklen und 55 °C, 30 min.
8. Transformieren Sie den resultierenden Vektor in E . coli-Zellen , wie beschrieben²³.
9. Entwerfen Sie Primer, die die gRNA-Insertionsstelle innerhalb des Plasmids flankieren. Führen Sie mit diesen Primern eine PCR-Amplifikation an einzelnen Kolonien durch, um nach erfolgreichen Insertionen zu suchen. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte durch, um die erfolgreiche Klonierung zu bestätigen und das Plasmid²⁴ zu isolieren.

2. Umwandlung von Agrobacterium (Dauer 4 Tage)

1. Auftauen EHA105 Agrobacterium Competent Cell auf Eis. Geben Sie 1-2 μl Plasmid-DNA (mit ~100-200 ng DNA) in die Zellsuspension und mischen Sie vorsichtig.
2. Führen Sie eine Hitzeschockumwandlung durch, indem Sie das Rohr 5 Minuten lang auf Eis, 5 Minuten auf flüssigen Stickstoff, 5 Minuten lang auf 37 °C und dann 5 Minuten lang auf das Eisbad legen.
3. Geben Sie 700 μl Hefeextrakt-Pepton (YEP)-Medien ohne Antibiotikum in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig. Die Zellen werden in einem Schüttelinkubator bei 28 °C, 200-250 U/min, für 2-3 Stunden zurückgewonnen.
4. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.800 x g für 1 min. Verwerfen Sie den größten Teil des Überstands, so dass etwa 100 μl übrig bleiben, und resuspendieren Sie die Zellen. Verteilen Sie die Zellen auf YEP-Agarplatten mit 1% Antibiotika (Kanamycin und Rifampicin) für die Plasmidauswahl. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 24-48 h.
5. Streichen Sie die YEP-Platte (mit Antibiotikaresistenzen) mit einer Pipettenspitze, die eine einzelne Kolonie von Agrobacterium enthält, die das CRISPR/Cas beherbergt, und übertragen Sie die Zellen in 5 ml YEP-Flüssigmedium mit geeigneten Antibiotika. Inkubieren Sie die Flüssigkeit 3 Tage lang bei 28 °C.
6. Lagern Sie die transformierten Agrobacterium-Stämme als Glycerinvorräte bei -80 °C für die weitere Verwendung.

3. Reisumwandlung durch Agrobacterium (Dauer 3 Monate)

ANMERKUNG: Es wurden mehrere pflanzliche Transformationsmethoden für die Abgabe und Expression der fremden DNA-Sequenz in der Pflanzenzelle^{berichtet 25}. Unter Berücksichtigung der Einzelkopienintegration und der geringen Häufigkeit von DSBs im Genom ist die Agrobacterium-vermittelte Transformation die Methode der Wahl, um das Expressions-DNA-Fragment in Reischromosomen zu integrieren.

1. Führen Sie die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis gemäß dem Protokoll in²⁵ durch. Die aktiv wachsenden Calli (gelblich-weiß, relativ trocken und 1-3 mm im Durchmesser) sind ein Schlüsselpunkt für eine effiziente Transformation. Entsorgen Sie die Samen mit Sämlingsentwicklung oder brauner Kallus, bevor Sie die Hornhaut mit Agrobacterium infizieren.

4. Genotypisierung transgener Pflanzen und Samenernte (Zeitdauer 8 Monate)

HINWEIS: Es werden zwei Generationen Reis angebaut, um homozygote Mutationen und fremde DNA-freie Linien zu erreichen.

1. Entnahme von Sämlingsgewebe: Verpflanzen Sie die transgenen Pflanzen in Töpfe und ziehen Sie sie 1 Monat lang in einem Gewächshaus an. Um den Mutationstyp zu bestimmen, sammeln Sie 2-3 mg frische Blätter von jeder Pinne eines einzelnen Sämlings und kombinieren Sie sie in einer einzigen Probe.
2. Extraktion genomischer DNA: Befolgen Sie ein etabliertes Protokoll für die Extraktion von Pflanzengenom-DNA²⁶.
3. Design der Mutationsprimer (Ergänzende Tabelle 1): Design von PCR-Primern zur Amplifikation der SBEIIb-Genregion , die die sgRNA-Zielstelle¹⁴ umgibt. Das amplifizierte Fragment ist 493 bp lang.
4. Genotypisierung der Mutation: Sequenzieren Sie die PCR-Fragmente direkt oder klonen Sie sie in einen T-Klonvektor und sequenzieren Sie sie mit der Sanger-Methode, um Mutationen zu identifizieren¹⁴.
5. Ernte von Samen: Wähle die E0-Linien aus, die homozygote Frame-Shift-Mutationen aufweisen, und pflanze sie in ein Gewächshaus, um Samen zu erhalten.
6. Design der Primer zur Identifizierung der T-DNA: Entwerfen Sie drei spezifische Primer für die Hygromycin-Kassette, die UBI-Kassette und die Cas-Kassette des Konstrukts, um fremde DNA-freie Linien unter den Mutationen zu identifizieren (Ergänzende Tabelle 1).
7. Bestätigung von fremden T-DNA-freien Linien: Ernten Sie Blätter von 2 Wochen alten Sämlingen und extrahieren Sie Pflanzengenom-DNA, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Führen Sie die genomische PCR mit folgendem Programm durch: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) mit 35 Zyklen und 72 °C, 5 min. Dies ermöglicht den Nachweis von Hygromycin-, UBI- und Cas-Kassetten im Pflanzengenom.
8. Analysieren Sie die PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese und wählen Sie Linien aus, die keine Banden aufweisen, was darauf hindeutet, dass es sich um transgenfreie E1-Linien handelt. Ernten Sie die Samen aus diesen ausgewählten Linien.

5. Messung des Gehaltes an resistenter Stärke (Zeitmessung 4 Tage)

1. Ernten Sie die Samen von Mutanten und X134-Pflanzen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auf natürliche Weise trocknen, wobei ein Feuchtigkeitsgehalt von ca. 13%-15% beibehalten wird. Bestimmen Sie den Gehalt an resistenter Stärke mit dem unten beschriebenen Pankreas-α-Amylose/Amyloglucosidase (AMG)-Verfahren.
2. Aktivieren Sie die Schälmaschine und geben Sie 10 g Reiskörner in den Feeder, um die Hüllpelpelpel effizient zu entfernen, was zu verarbeiteten Reissamen führt.
3. Übertragen Sie die geschälten Reissamen in die Reismühle und betreiben Sie sie 60 s lang, um die Aleuronschicht zu entfernen und polierten Reis zu erhalten.
4. Legen Sie den polierten Reis in die Mühle und stellen Sie die Mahlfrequenz auf 60 Hz ein. Lassen Sie die Mühle 15 s lang laufen und wiederholen Sie den Zyklus 2x, um Reispulver herzustellen.
5. Gib das gemahlene Reispulver in eine Petrischale und stelle es in den vorgeheizten Backofen. Die Temperatur auf 37 °C einstellen und 12 h trocknen lassen.
6. Wägen Sie 100 mg ± 5 mg Proben genau ab und gießen Sie sie direkt in ein 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um sicherzustellen, dass sich die Probe am Boden absetzt.
7. Geben Sie 180 μl gereinigtes Wasser in das Röhrchen und kochen Sie die Proben 20 Minuten lang in einem Wasserbad.
8. Lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen und geben Sie dann 4 ml AMG (3 μl) mit Pankreas-α-Amylase (10 mg/ml) in jedes Röhrchen.
9. Verschließen Sie die Röhrchen fest, mischen Sie sie auf einem Wirbeloszillator und inkubieren Sie die Röhrchen 16 h lang bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren.
10. Fügen Sie 4 mL Ethanol hinzu und mischen Sie mit einem Wirbel. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.500 x g für 10 min.
11. Dekantieren Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml 50 % Ethanol hinzu, gefolgt von 6 ml 50 % IMS, und mischen Sie mit einem Wirbel und einer Zentrifuge.
12. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und drehen Sie das Rohr um, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen. Legen Sie die Röhrchen in ein Eisbad, geben Sie 2 ml 2 M KOH in jedes Röhrchen und rühren Sie die Proben 20 Minuten lang um, um die Flocken zu resuspendieren und resistente Stärke aufzulösen.
13. Geben Sie 8 ml 1,2 M Natriumacetatpuffer (pH 3,8) in jedes Reagenzglas und mischen Sie es mit einem Magnetrührer.
14. Sofort 0,1 ml AMG (3300 U/ml) einfüllen, gründlich mischen und 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50 °C inkubieren, wobei das Mischen mit einem Wirbel unterbrochen wird. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 1.500 x g für 10 min.
15. 0,1 ml des Überstands in ein Glasröhrchen geben, 3 ml Glukoseoxidase/Peroxidase (GOPOD)-Reagenz hinzufügen und 20 Minuten lang bei 50 °C inkubieren. Bereiten Sie einen Reagenzrohling vor, indem Sie 0,1 ml 100 mM Natriumacetatpuffer und 3 ml GOPOD-Reagenz mischen. Bereiten Sie Standards vor, indem Sie 0,1 ml D-Glukose mit 3 ml GOPOD-Reagenz mischen.
16. Pipettieren Sie vorsichtig 200 μl jeder Blindlösung, der zu testenden Lösung und der Standardlösung in eine 96-Well-Platte.
17. Messen Sie die Extinktion jeder Probe bei 510 nm gegen die Blindlösung und berechnen Sie den Gehalt an resistenter Stärke mit der bereitgestellten Formel.
    Resistente Stärke (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27
    Dabei ist ΔA = Absorption, die gegen den Reagenzblindwert abgelesen wurde; F = Umrechnung von Extinktion in Mikrogramm (die Extinktion, die für 100 μg D-Glukose in der GOPOD-Reaktion erhalten wird, wird bestimmt); W = Trockengewicht der analysierten Probe.

6. Postprandiale Blutzuckerreaktion (Zeitdauer 5 Tage)

1. Verwenden Sie die folgenden Einschlusskriterien für die Teilnehmer: gesunde asiatische chinesische Erwachsene im Alter zwischen 18 und 60 Jahren, Nichtraucher, einen Body-Mass-Index (BMI) zwischen 18,5 und 25 kg/m² und einen normalen Blutdruck (< 140/90 mm. Hg). Verwenden Sie die folgenden Ausschlusskriterien: Stoffwechselerkrankungen (wie Diabetes, Bluthochdruck usw.), Magen-Darm-Erkrankungen, Anomalien des endokrinen Systems oder psychische Erkrankungen. Insgesamt wurden 10 Teilnehmer gescreent und rekrutiert.
2. Ablauf der Testsitzung (über zwei aufeinanderfolgende Tage)
   1. Tag 0 (Vorbereitungstag): Bitten Sie die Teilnehmer, in den ersten 3 Tagen vor dem Test regelmäßige Schlafmuster und eine normale Ernährung beizubehalten. Bitten Sie die Teilnehmer am Vorabend des Tests (nach 20:00 Uhr), auf ballaststoffreiche und zuckerreiche Mahlzeiten zu verzichten. Von kräftiger Bewegung wird am Morgen von Tag 1 abgeraten.
   2. Tag 1 (Testtag): Bereiten Sie weißen Reis zu, indem Sie die Reissamen mahlen, dann spülen Sie den weißen Reis 2x ab. Füllen Sie einen Topf mit 1,5 Teilen Wasser auf 1 Teil weißen Reis. Den Reis kochen, bis das Wasser vollständig aufgesogen ist. Den Herd ausschalten, den Topf abdecken und 10 Minuten ruhen lassen.
   3. Ordnen Sie die 10 Teilnehmer nach dem Zufallsprinzip zwei gleichen Gruppen zu: eine Testgruppe, die mit weißem Reis mit resistenter Stärke gefüttert wird, und eine Kontrollgruppe, die mit weißem Reis X134 gefüttert wird. Bitten Sie die Teilnehmer, sich 10 Minuten auszuruhen, bevor die Prüfung beginnt.
   4. Sterilisieren Sie die Fingerspitzen mit 75% medizinischem Alkohol. Drücken Sie die Lanzette vorsichtig gegen die Fingerspitze und lassen Sie die Feder los, um in die Haut zu stechen. Drücken Sie den Finger vorsichtig zusammen, um ein kleines Bluttröpfchen zu erzeugen, und berühren Sie dieses Tröpfchen mit dem blutabsorbierenden Ende des Teststreifens im Messgerät. Das Messgerät saugt automatisch das Blut an und startet den Testvorgang. Warten Sie, bis der Blutzuckerwert angezeigt wird.
   5. Reiskonsum und Blutentnahme: Präsentieren Sie den Teilnehmern 50 g des zubereiteten Reises mit 200 mL Wasser und bitten Sie sie, diesen innerhalb von 5-10 min in einem gemütlichen Tempo zu essen. Entnehmen Sie nach der Mahlzeit venöse Blutproben zu den folgenden Zeitpunkten: 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 90 Minuten und 120 Minuten nach Beginn der Mahlzeit. Führen Sie die Blutzuckeranalyse wie in Schritt 6.2.4 durch.

In der vorliegenden Studie wurden alle Verfahren der Züchtung von funktionellem Reis durch Genome Editing demonstriert, um stabile resistente Stärkereissorten zu erhalten. Wir integrierten sgRNA, die auf SBEIIb abzielt, in CRISPR/Cas-SF01 (Ergänzende Abbildung 1), infiltrierten Reis mittels Agrobacterium-Transformation und erhielten nach Screening- und Bewurzelungsphasen Pflanzen zur E0-Generation. Pflanzen mit Verlust der Genfunktion wurden gescreent und ihr Gehalt an resistenter Stärke nach der Samenernte bestimmt (Abbildung 1). Homozygote Mutationen (20,8%) wurden in den E0-Pflanzen durch Sanger-Sequenzierung gefunden, und sbeIIb-1 (-2bp, CC), sbeIIb-2 (-4bp, AGCC) und sbeIIb -3 (-4bp, GTGC) in der Zielsequenz führten zu einer Frameverschiebung in der kodierenden Region, die zu nicht-funktionellen Proteinen führte (Abbildung 2, Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3).

Es wurde ein sorgfältiger Auswahlprozess durchgeführt, um E1-Pflanzen zu identifizieren, die die Mutationen sbeIIb-1, sbeIIb-2 und sbeIIb-3 im SBEIIb-Gen beherbergen, wobei speziell auf die Linien abgezielt wurde, die sich als frei von T-DNA-Insertionen erwiesen haben und keine Hinweise auf Off-Target-Mutationen aufweisen. Diese Pflanzen wurden dann für die weitere phänotypische Analyse ausgewählt. Alle Pflanzen wurden unter natürlichen Feldbedingungen angebaut und nach der Reifung Samen geerntet (Abbildung 3A). Frühere Studien deuteten darauf hin, dass der Gehalt an resistenter Stärke des Reisendosperms den Grad der Transparenz von gemahlenem Reis bestimmt²⁷. Körner von sbeIIb-mutierten Pflanzen hatten ein wachsartiges Aussehen, das weiß und vollständig undurchsichtig war, im Gegensatz zum typischen durchscheinenden Aussehen von X134-Samen (Abbildung 3B). Die mutierten Pflanzen unterschieden sich nicht von der X134-Kontrolle in Bezug auf die Pflanzenhöhe (Ergänzende Abbildung 4A,C), die Samenansatzrate (Abbildung 3C), die Anzahl der Körner pro Rispe (Abbildung 3D) und den Ertrag pro Pflanze (Abbildung 3E), ohne die Rispenlänge nahm die Rispenlänge bei den Mutanten um 11,9% ab (Ergänzende Abbildung 4B,D).

Der RS-Gehalt des sbeIIb beträgt 5,2 % im Vergleich zu 0,6 % des X134-Wildtyps (Abbildung 4A). Um die funktionellen Implikationen weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Blutzuckerreaktion nach dem Verzehr von RS-Reis. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Verzehr von RS-Reis zu einer Verringerung der Glukosereaktion um 9,7 % bzw. 3,7 % nach 15 Minuten bzw. 30 Minuten nach dem Reiskonsum führte (Abbildung 4B). Wichtig ist, dass die Blutzuckerspiegel von Personen, die den mutierten Reis konsumierten, im Vergleich zu denen, die den X134-Reis konsumierten, langsamer anstiegen, was auf mögliche Anwendungen des RS-Reis bei der glykämischen Kontrolle hindeutet (Abbildung 4B).

Abbildung 1: Modell der Züchtung von resistentem Stärkereis mittels Genome-Editing-Technologie. Dieses Modell veranschaulicht die wichtigsten Schritte: die Verabreichung des Vektors in die Agrobacterium-Zelle, die Infektion des Reiskallus durch Agrobacterium, die Regeneration der Reissprossen, die Ernte der Reiskörner und die Analyse resistenter Stärke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Genotyp und Vorhersageproteinsequenz von sbeIIb-Mutanten . Sanger-Sequenzierungschromatogramme von sbellb-1, sbellb-2 und sbellb-3. Schwarz zeigt normale Aminosäuresequenzen an. Schwarz gestrichelte Linien zeigen Frameshift-Mutationen in Aminosäuren an, und rot zeigt das Stoppcodon an. Die Zielposition wird mit einem roten Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Agronomische Eigenschaften und Kornqualität der sbeIIb-Mutante . (A) Pflanzlicher Phänotyp von sbeIIb. (B) Vergleich des Aussehens von X134- und sbeIIb-1-Mutanten von braunem Reis. (C-E) Samenansatz, Körner pro Rispe und Ertrag pro Pflanze von X134 und sbeIIb. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SDs; NS bedeutet keinen signifikanten Unterschied gemäß dem t-Test des Studenten, n=20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Gehalt an resistenter Stärke in reifen Körnern und Blutzuckerspiegel. (A) Messungen des Gehalts an resistenter Stärke in sbeIIb-Getreide , n=3. (B) Die Blutzuckerkurve nach dem Verzehr von sbeIIb-Reis . Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SDs; **, p < 0,01 gemäß dem t-Test des Studenten, n=5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Vektor von CRISPR/Cas-SF01. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Die Vorhersageproteinsequenz von OsSBEIIb und den sbeIIb-Mutanten . Die Frameshift-Sequenzen sind rot markiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Analyse der Pflanzenmerkmale der sbeIIb-1-Mutante. (A) Wachstumsphänotyp der sbeIIb-1-Mutante . (B) Spike-Muster der sbeIIb-1-Mutante . (C) Pflanzenhöhe der sbeIIb-1-Mutante . (D) Rispenlänge der sbeIIb-1-Mutante . Die Daten sind das Mittel ± SDs; NS bedeutet keinen signifikanten Unterschied; **, p < 0,01 gemäß dem t-Test des Studenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1. Liste der in dieser Studie verwendeten Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Bei der Konstruktion von CRISPR/Cas-SF01-basierten Knockdown-Vektoren ist die sorgfältige Auswahl von Single-Guide-RNAs (sgRNA) von entscheidender Bedeutung. Dies erfordert die Verwendung von Sequenzen, die eine hohe Bearbeitungseffizienz mit minimalen Off-Target-Effekten aufweisen. Darüber hinaus enthält die Synthese von Targeting-Primern kurze Adapter-Oligos, die zu den Spleißstellen des Vektors passen, um eine nahtlose Integration zu gewährleisten. Im Gegensatz zu früheren Methoden, die einen sequentiellen enzymatischen Verdau, eine Gelreinigung und eine Ligatur erforderten, rationalisiert unsere Studie den Prozess, indem sie das Enzymschneiden und die Ligatur in ein All-in-One-System integriert. Diese Verbesserung verbessert die betriebliche Effizienz und verkürzt den Zeitrahmen für Experimente.

Vergleicht man Cas-SF01 mit der kanonischen Cas-9-Nuklease, so zeigen sich deutliche Vorteile, die sein Potenzial in der molekularen Pflanzenzüchtung unterstreichen. Diese Vorteile machen Cas-SF01 zu einem vielversprechenden Werkzeug in der landwirtschaftlichen Biotechnologie. Erstens kann die kleinere Proteingröße von Cas-SF01 die zelluläre Verabreichungseffizienz in planta verbessern. Zweitens erleichtern die kürzeren crRNA-Sequenzen das Design von Multiplex-Targeting-Strategien und ermöglichen so komplexere genetische Modifikationen²⁸. Drittens induziert Cas-SF01 im Vergleich zu den typischen 1-bp-Indels von Cas9 typischerweise großskalige Mutationen, was auf sein Potenzial für umfangreichere genetische Veränderungen hinweist²⁹.

Auf dem Gebiet der Gen-Editierung von Nutzpflanzen spielen mehrere Faktoren eine entscheidende Rolle bei der Sicherstellung erfolgreicher Ergebnisse. Erstens ist die Bestätigung der Gensequenz in editierten Sorten unerlässlich, um mögliche Insertionen, Deletionen oder Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu verhindern, die die sgRNA-Erkennung behindern und damit die Effizienz des Editierungsprozesses beeinträchtigen könnten. Zweitens variiert die Auswahl des geeigneten Agrobacterium-Stammes für die Transformation je nach Reissorte, mit der gearbeitet wird, was die Bedeutung der Stammwahl für eine erfolgreiche Genbearbeitung in verschiedenen Reissorten unterstreicht. Darüber hinaus ist die Genotypisierung der editierten Sämlinge der E0-Generation entscheidend, um die Konsistenz der Mutationstypen zu gewährleisten. Diese Genotypisierung sollte nach 1 Monat Wachstum durchgeführt werden, wobei DNA aus den obersten Blättern jeder Pinne extrahiert wird. Dank der bemerkenswerten Editierungseffizienz von Cas-SF01 können homozygote editierte Linien in der E0-Generation gesichert werden, was die Selektion von T-DNA-freien Materialien in der E1-Generation erleichtert und anschließend den Züchtungsprozess beschleunigt. Vor der Bewertung agronomischer Merkmale ist es wichtig, den editierten Phänotyp zu bestimmen, da dies dazu beiträgt, seinen Einfluss auf andere Merkmale zu verstehen und die gewünschten Eigenschaften der neuen Sorte zu bestimmen.

Es gibt Änderungen und Fehlerbehebungen an diesem Verfahren. Beim Umgang mit verschiedenen Kulturpflanzenarten ist es unerlässlich, die Editierungseffizienz von Cas9, Cpf1 und Cas-SF01 zu vergleichen, um das am besten geeignete Werkzeug für die beabsichtigten genetischen Veränderungen zu ermitteln. Wenn homozygote editierte Linien in der E0-Generation nicht identifiziert werden können, kann es außerdem erforderlich sein, die Screening-Stichprobengröße zu erhöhen oder eine zusätzliche Generation von Pflanzungen und Screenings einzuführen, um homozygote T-DNA-freie Pflanzen zu erhalten.

Die Auswahl des U6-Promotors für diese Studie basierte auf seiner weit verbreiteten Verwendung und nachgewiesenen Wirksamkeit bei der Genom-Editierung von Pflanzen, wie die jüngste Arbeit von Lv et ^al.29zur effizienten Schaffung funktioneller Reissorten zeigt. Dieser Promotor wurde in Reis gründlich validiert und optimiert, und wir haben uns entschieden, diesem bewährten Weg zu folgen, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse zu gewährleisten. Obwohl wir die potenziellen Vorteile des CmYLCV-Promotors anerkennen, wie von Čermák et ^al.30 vorgeschlagen, erkennen wir an, dass weitere Untersuchungen, die die Leistung verschiedener Promotoren in unserem spezifischen experimentellen System vergleichen, wertvolle Erkenntnisse liefern würden.

Der Einsatz von Gen-Editing-Technologien zur präzisen Modifikation funktioneller genomischer Loci in Pflanzen unterstreicht die Bedeutung einer effizienten Vektorverabreichung und des Detektions von Genmutationen. Um editierte Pflanzenlinien zu neuen Kultursorten weiterzuentwickeln, ist es zwingend erforderlich, den homozygoten Zustand des Zielgens zu ermitteln und Individuen auszuwählen, die frei von exogenen T-DNA-Fragmenten sind. Dieses Protokoll, das für eine Reissorte entwickelt wurde, die mit hochresistenter Stärke angereichert ist, unterstreicht das Potenzial der Gen-Editing-Technologie, um die Züchtung von funktionellem Reis zu beschleunigen.

Das Manuskript zielt darauf ab, einen Beitrag zum Feld zu leisten, indem es einen umfassenden und systematischen Ansatz zur Schaffung funktionaler Reissorten durch Gen-Editierung präsentiert. Die Studie geht über die bloße Beschreibung der Anwendung eines Gen-Editing-Tools hinaus. Vielmehr konzentriert es sich auf die Integration mehrerer Aspekte, von der Genauswahl und der Optimierung der Editierungswerkzeuge bis hin zur detaillierten phänotypischen und agronomischen Merkmalsanalyse. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Arbeit zwar keine völlig neuen Technologien oder Gene einführt, aber einen Beitrag zum Feld leistet, indem sie einen umfassenden und rigorosen Ansatz zur Schaffung funktionaler Reissorten durch Gen-Editierung demonstriert.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074) unterstützt.