Method Article
Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.
Die konventionellen Ansätze der Pflanzenzüchtung, die überwiegend auf zeit- und arbeitsintensiven Methoden wie der traditionellen Hybridisierung und Mutationszüchtung beruhen, stehen vor Herausforderungen, wenn es darum geht, gezielte Merkmale effizient einzuführen und vielfältige Pflanzenpopulationen zu erzeugen. Umgekehrt hat das Aufkommen von Genome-Editing-Technologien einen Paradigmenwechsel eingeleitet, der eine präzise und beschleunigte Manipulation von Pflanzengenomen ermöglicht, um gewünschte Eigenschaften absichtlich einzuführen. Eines der am weitesten verbreiteten Bearbeitungswerkzeuge ist das CRISPR/Cas-System, das von Forschern verwendet wird, um wichtige biologische Probleme zu untersuchen. Der präzise und effektive Arbeitsablauf der Genom-Editierung ist in der Pflanzenzüchtung jedoch noch nicht genau definiert. In dieser Studie haben wir den gesamten Prozess der Züchtung von Reissorten demonstriert, die mit einem hohen Anteil an resistenter Stärke (RS) angereichert sind, einem funktionellen Merkmal, das eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Diabetes und Fettleibigkeit spielt. Der Arbeitsablauf umfasste mehrere wichtige Schritte, wie z. B. die Auswahl des funktionellen SBEIIb-Gens , das Design der Single-Guide-RNA (sgRNA), die Auswahl eines geeigneten Genom-Editing-Vektors, die Bestimmung der Vektorverabreichungsmethode, die Durchführung von Pflanzengewebekulturen, die Genotypisierung, die Mutation und die phänotypische Analyse. Darüber hinaus wurde der Zeitrahmen, der für jede Phase des Prozesses erforderlich ist, klar aufgezeigt. Dieses Protokoll rationalisiert nicht nur den Züchtungsprozess, sondern verbessert auch die Genauigkeit und Effizienz der Einführung von Merkmalen und beschleunigt so die Entwicklung funktioneller Reissorten.
Die traditionelle Züchtung beruht auf der Einführung von Merkmalen in Kulturpflanzen oder der Erzeugung von Pflanzenpopulationen mit ausreichender Variation, was eine langfristige Feldbeobachtung erfordert 1,2. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen Züchtung wurde eine Gen-Editing-Technologie entwickelt, die das Genom von Nutzpflanzen präzise modifizieren kann, um die gewünschten Merkmale von Pflanzenpopulationen zu erhalten3. Das am weitesten verbreitete Gen-Editing-System in Pflanzen ist CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), das auf einer programmierbaren RNA-gesteuerten Endonuklease beruht, um gezielte Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA zu erzeugen 4,5. Diese DSBs werden dann durch die natürlichen DNA-Reparaturmechanismen der Zelle repariert 6,7, was oft zur Einführung der gewünschten genetischen Veränderungen führt. Obwohl diese Technologie in verschiedenen Kulturen eingesetzt wurde, darunter Weizen8, Mais9, Sojabohnen10 und Reis11, wird sie hauptsächlich zur Aufdeckung biologischer Probleme eingesetzt. Verglichen mit ihrer umfangreichen Anwendung bei der Aufklärung der Genfunktionen von Pflanzen ist die Forschung zur Anwendung von Gen-Editing-Technologien in der Pflanzenzüchtung noch relativ spärlich12.
Der Prozess der Gen-Editierung bei Nutzpflanzen folgt in der Regel einem klar definierten Arbeitsablauf, der mehrere wichtige Schritte umfasst13. Der erste Schritt besteht darin, das spezifische Gen oder die genetische Region zu identifizieren, die modifiziert werden muss, um das gewünschte Merkmal zu erreichen. Zweitens wird eine Gen-Editing-Strategie entwickelt, die die Auswahl eines geeigneten Gen-Editing-Systems (z. B. CRISPR-Cas9 oder CRISPR-Cas12) und das Design spezifischer Guide-RNAs umfasst, um die Endonuklease zum Zielort zu leiten. Drittens wird das Gen-Editing-System dann in einen Verabreichungsvektor eingebaut, mit dem die Editierungsmaschinerie in die Pflanzenzellen eingeführt wird. Bei diesen Vektoren kann es sich um DNA-, RNA- oder Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) handeln. Anschließend werden die Gen-Editing-Vektoren mit verschiedenen Methoden, darunter Agrobacterium-vermittelte Transformation, Partikelbeschuss oder Elektroporation, in Pflanzenzellen eingebracht. Sofort werden die transformierten Pflanzenzellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um genetisch veränderten Kallus oder embryogenes Gewebe zu erzeugen. Diese Gewebe werden dann durch Gewebekulturtechniken zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die regenerierten Pflanzen werden einer strengen molekularen Charakterisierung unterzogen, um das Vorhandensein der gewünschten genetischen Veränderungen zu bestätigen.
Ein früherer Artikel von Tsakirpaloglou et al.14 bietet einen umfassenden Überblick über den Gen-Editing-Prozess, vom Vektordesign bis zur Erzeugung editierter Sämlinge, geht aber weder auf die detaillierte Analyse spezifischer Merkmale ein, die mit dem Zielgen verbunden sind, noch auf die anschließende Bewertung der agronomischen Leistung oder der funktionellen Validierung der editierten Pflanzen. Wir sind mehr als nur der Nachweis der Machbarkeit der Editierung eines Gens in Reis gegangen. Unsere Arbeit bewertet umfassend die Auswirkungen dieser Bearbeitung auf die biochemischen, molekularen und agronomischen Eigenschaften der editierten Reislinien. Dazu gehört auch die Bewertung der Stärkezusammensetzung, ein kritischer Faktor, der die Getreidequalität und den Nährwert beeinflusst und in früheren Gen-Editing-Studien nicht umfassend untersucht wurde.
Reisstärke besteht typischerweise aus ~20% Amylose und ~80% Amylopektin15. SBEIIb ist ein Enzym, das für die Amylopektinsynthese essentiell ist und im Endospermexprimiert wird 16. Der Knockdown von OsSBEIIb durch Hairpin-RNA (RNAi) und microRNA-Expression erhöhte den Gehalt an resistenter Stärke17,18. Resistente Stärke ist ein Substratstärke, das im Dünndarm nicht verdaut und aufgenommen werden kann, aber von bestimmten Verdauungsbakterien im Darm in kurzkettige Fettsäuren und Gase zerlegt werden kann. Da es nicht schnell abgebaut werden kann, hat es im Vergleich zu anderen Stärken einen niedrigeren glykämischen Index und verursacht innerhalb kurzer Zeit nach dem Essen keinen schnellen Anstieg des Blutzuckers, was Diabetes in der Diät bis zu einem gewissen Grad lindern kann19. Darüber hinaus hat resistente Stärke physiologischere Funktionen, wie z. B. die Verringerung der Insulinreaktion, die Regulierung der Darmfunktion, die Verhinderung von Fettansammlungen, die Erleichterung der Gewichtskontrolle und die Förderung der Aufnahme von Mineralionen. Daher wird es weithin als neue Art von Ballaststoffen verfolgt20.
Um diese Herausforderungen zu meistern und Gen-Editing-Technologien erfolgreich für die Züchtung funktioneller Reissorten einzusetzen, haben wir die Betriebsprotokolle innerhalb von Reis verfeinert und optimiert. Unser Fokus lag auf der sorgfältigen Analyse des Designs der Zielgenloci, der sorgfältigen Auswahl der am besten geeigneten Gen-Editing-Tools und der Durchführung einer rigorosen phänotypischen Analyse während des gesamten Züchtungsprozesses. Als Beweis für die Leistungsfähigkeit und Effizienz dieser Technologien präsentieren wir eine Fallstudie, die die schnelle Entwicklung einer funktionellen Reissorte zeigt, die mit hochresistenter Stärke angereichert ist. Dieses Beispiel unterstreicht das Potenzial der Gen-Editierung, die Züchtung von funktionellem Reis zu beschleunigen und den derzeitigen Mangel an Forschung in diesem Bereich zu beheben.
Die Studie wurde bei Bellagen Biotechnology Co. Ltd in China nach den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung durchgeführt. Vor der Teilnahme wurde den Probanden das Studienprotokoll ausführlich erklärt, und sie gaben ihre Einverständniserklärung ab.
1. Design der sgRNA und des Konstruktionsvektors (Zeit: 5-7 Tage)
HINWEIS: Zur Expression des CRISPR/Cas-SF01-Systems21 wurde ein binärer Vektor verwendet. Sie dürfen nicht weniger als 3 Nukleotide (nt) mit einer potenziellen Off-Target-Stelle für sgRNA nicht übereinstimmen. Der sgRNA-Adapter muss das klebrige Ende ergänzen, das durch den Bsa I-Enzymverdau des Editierungsvektors erzeugt wird. Die Wahl der Software basierte auf der berichteten hohen Effizienz und Spezifität der Software in Reis14 sowie auf ihrer Benutzerfreundlichkeit und Zugänglichkeit für die Forschungsgruppe.
2. Umwandlung von Agrobacterium (Dauer 4 Tage)
3. Reisumwandlung durch Agrobacterium (Dauer 3 Monate)
ANMERKUNG: Es wurden mehrere pflanzliche Transformationsmethoden für die Abgabe und Expression der fremden DNA-Sequenz in der Pflanzenzelleberichtet 25. Unter Berücksichtigung der Einzelkopienintegration und der geringen Häufigkeit von DSBs im Genom ist die Agrobacterium-vermittelte Transformation die Methode der Wahl, um das Expressions-DNA-Fragment in Reischromosomen zu integrieren.
4. Genotypisierung transgener Pflanzen und Samenernte (Zeitdauer 8 Monate)
HINWEIS: Es werden zwei Generationen Reis angebaut, um homozygote Mutationen und fremde DNA-freie Linien zu erreichen.
5. Messung des Gehaltes an resistenter Stärke (Zeitmessung 4 Tage)
6. Postprandiale Blutzuckerreaktion (Zeitdauer 5 Tage)
In der vorliegenden Studie wurden alle Verfahren der Züchtung von funktionellem Reis durch Genome Editing demonstriert, um stabile resistente Stärkereissorten zu erhalten. Wir integrierten sgRNA, die auf SBEIIb abzielt, in CRISPR/Cas-SF01 (Ergänzende Abbildung 1), infiltrierten Reis mittels Agrobacterium-Transformation und erhielten nach Screening- und Bewurzelungsphasen Pflanzen zur E0-Generation. Pflanzen mit Verlust der Genfunktion wurden gescreent und ihr Gehalt an resistenter Stärke nach der Samenernte bestimmt (Abbildung 1). Homozygote Mutationen (20,8%) wurden in den E0-Pflanzen durch Sanger-Sequenzierung gefunden, und sbeIIb-1 (-2bp, CC), sbeIIb-2 (-4bp, AGCC) und sbeIIb -3 (-4bp, GTGC) in der Zielsequenz führten zu einer Frameverschiebung in der kodierenden Region, die zu nicht-funktionellen Proteinen führte (Abbildung 2, Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3).
Es wurde ein sorgfältiger Auswahlprozess durchgeführt, um E1-Pflanzen zu identifizieren, die die Mutationen sbeIIb-1, sbeIIb-2 und sbeIIb-3 im SBEIIb-Gen beherbergen, wobei speziell auf die Linien abgezielt wurde, die sich als frei von T-DNA-Insertionen erwiesen haben und keine Hinweise auf Off-Target-Mutationen aufweisen. Diese Pflanzen wurden dann für die weitere phänotypische Analyse ausgewählt. Alle Pflanzen wurden unter natürlichen Feldbedingungen angebaut und nach der Reifung Samen geerntet (Abbildung 3A). Frühere Studien deuteten darauf hin, dass der Gehalt an resistenter Stärke des Reisendosperms den Grad der Transparenz von gemahlenem Reis bestimmt27. Körner von sbeIIb-mutierten Pflanzen hatten ein wachsartiges Aussehen, das weiß und vollständig undurchsichtig war, im Gegensatz zum typischen durchscheinenden Aussehen von X134-Samen (Abbildung 3B). Die mutierten Pflanzen unterschieden sich nicht von der X134-Kontrolle in Bezug auf die Pflanzenhöhe (Ergänzende Abbildung 4A,C), die Samenansatzrate (Abbildung 3C), die Anzahl der Körner pro Rispe (Abbildung 3D) und den Ertrag pro Pflanze (Abbildung 3E), ohne die Rispenlänge nahm die Rispenlänge bei den Mutanten um 11,9% ab (Ergänzende Abbildung 4B,D).
Der RS-Gehalt des sbeIIb beträgt 5,2 % im Vergleich zu 0,6 % des X134-Wildtyps (Abbildung 4A). Um die funktionellen Implikationen weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Blutzuckerreaktion nach dem Verzehr von RS-Reis. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Verzehr von RS-Reis zu einer Verringerung der Glukosereaktion um 9,7 % bzw. 3,7 % nach 15 Minuten bzw. 30 Minuten nach dem Reiskonsum führte (Abbildung 4B). Wichtig ist, dass die Blutzuckerspiegel von Personen, die den mutierten Reis konsumierten, im Vergleich zu denen, die den X134-Reis konsumierten, langsamer anstiegen, was auf mögliche Anwendungen des RS-Reis bei der glykämischen Kontrolle hindeutet (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Modell der Züchtung von resistentem Stärkereis mittels Genome-Editing-Technologie. Dieses Modell veranschaulicht die wichtigsten Schritte: die Verabreichung des Vektors in die Agrobacterium-Zelle, die Infektion des Reiskallus durch Agrobacterium, die Regeneration der Reissprossen, die Ernte der Reiskörner und die Analyse resistenter Stärke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Genotyp und Vorhersageproteinsequenz von sbeIIb-Mutanten . Sanger-Sequenzierungschromatogramme von sbellb-1, sbellb-2 und sbellb-3. Schwarz zeigt normale Aminosäuresequenzen an. Schwarz gestrichelte Linien zeigen Frameshift-Mutationen in Aminosäuren an, und rot zeigt das Stoppcodon an. Die Zielposition wird mit einem roten Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Agronomische Eigenschaften und Kornqualität der sbeIIb-Mutante . (A) Pflanzlicher Phänotyp von sbeIIb. (B) Vergleich des Aussehens von X134- und sbeIIb-1-Mutanten von braunem Reis. (C-E) Samenansatz, Körner pro Rispe und Ertrag pro Pflanze von X134 und sbeIIb. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SDs; NS bedeutet keinen signifikanten Unterschied gemäß dem t-Test des Studenten, n=20. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Gehalt an resistenter Stärke in reifen Körnern und Blutzuckerspiegel. (A) Messungen des Gehalts an resistenter Stärke in sbeIIb-Getreide , n=3. (B) Die Blutzuckerkurve nach dem Verzehr von sbeIIb-Reis . Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± SDs; **, p < 0,01 gemäß dem t-Test des Studenten, n=5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Vektor von CRISPR/Cas-SF01. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Die Vorhersageproteinsequenz von OsSBEIIb und den sbeIIb-Mutanten . Die Frameshift-Sequenzen sind rot markiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Analyse der Pflanzenmerkmale der sbeIIb-1-Mutante. (A) Wachstumsphänotyp der sbeIIb-1-Mutante . (B) Spike-Muster der sbeIIb-1-Mutante . (C) Pflanzenhöhe der sbeIIb-1-Mutante . (D) Rispenlänge der sbeIIb-1-Mutante . Die Daten sind das Mittel ± SDs; NS bedeutet keinen signifikanten Unterschied; **, p < 0,01 gemäß dem t-Test des Studenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1. Liste der in dieser Studie verwendeten Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Bei der Konstruktion von CRISPR/Cas-SF01-basierten Knockdown-Vektoren ist die sorgfältige Auswahl von Single-Guide-RNAs (sgRNA) von entscheidender Bedeutung. Dies erfordert die Verwendung von Sequenzen, die eine hohe Bearbeitungseffizienz mit minimalen Off-Target-Effekten aufweisen. Darüber hinaus enthält die Synthese von Targeting-Primern kurze Adapter-Oligos, die zu den Spleißstellen des Vektors passen, um eine nahtlose Integration zu gewährleisten. Im Gegensatz zu früheren Methoden, die einen sequentiellen enzymatischen Verdau, eine Gelreinigung und eine Ligatur erforderten, rationalisiert unsere Studie den Prozess, indem sie das Enzymschneiden und die Ligatur in ein All-in-One-System integriert. Diese Verbesserung verbessert die betriebliche Effizienz und verkürzt den Zeitrahmen für Experimente.
Vergleicht man Cas-SF01 mit der kanonischen Cas-9-Nuklease, so zeigen sich deutliche Vorteile, die sein Potenzial in der molekularen Pflanzenzüchtung unterstreichen. Diese Vorteile machen Cas-SF01 zu einem vielversprechenden Werkzeug in der landwirtschaftlichen Biotechnologie. Erstens kann die kleinere Proteingröße von Cas-SF01 die zelluläre Verabreichungseffizienz in planta verbessern. Zweitens erleichtern die kürzeren crRNA-Sequenzen das Design von Multiplex-Targeting-Strategien und ermöglichen so komplexere genetische Modifikationen28. Drittens induziert Cas-SF01 im Vergleich zu den typischen 1-bp-Indels von Cas9 typischerweise großskalige Mutationen, was auf sein Potenzial für umfangreichere genetische Veränderungen hinweist29.
Auf dem Gebiet der Gen-Editierung von Nutzpflanzen spielen mehrere Faktoren eine entscheidende Rolle bei der Sicherstellung erfolgreicher Ergebnisse. Erstens ist die Bestätigung der Gensequenz in editierten Sorten unerlässlich, um mögliche Insertionen, Deletionen oder Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu verhindern, die die sgRNA-Erkennung behindern und damit die Effizienz des Editierungsprozesses beeinträchtigen könnten. Zweitens variiert die Auswahl des geeigneten Agrobacterium-Stammes für die Transformation je nach Reissorte, mit der gearbeitet wird, was die Bedeutung der Stammwahl für eine erfolgreiche Genbearbeitung in verschiedenen Reissorten unterstreicht. Darüber hinaus ist die Genotypisierung der editierten Sämlinge der E0-Generation entscheidend, um die Konsistenz der Mutationstypen zu gewährleisten. Diese Genotypisierung sollte nach 1 Monat Wachstum durchgeführt werden, wobei DNA aus den obersten Blättern jeder Pinne extrahiert wird. Dank der bemerkenswerten Editierungseffizienz von Cas-SF01 können homozygote editierte Linien in der E0-Generation gesichert werden, was die Selektion von T-DNA-freien Materialien in der E1-Generation erleichtert und anschließend den Züchtungsprozess beschleunigt. Vor der Bewertung agronomischer Merkmale ist es wichtig, den editierten Phänotyp zu bestimmen, da dies dazu beiträgt, seinen Einfluss auf andere Merkmale zu verstehen und die gewünschten Eigenschaften der neuen Sorte zu bestimmen.
Es gibt Änderungen und Fehlerbehebungen an diesem Verfahren. Beim Umgang mit verschiedenen Kulturpflanzenarten ist es unerlässlich, die Editierungseffizienz von Cas9, Cpf1 und Cas-SF01 zu vergleichen, um das am besten geeignete Werkzeug für die beabsichtigten genetischen Veränderungen zu ermitteln. Wenn homozygote editierte Linien in der E0-Generation nicht identifiziert werden können, kann es außerdem erforderlich sein, die Screening-Stichprobengröße zu erhöhen oder eine zusätzliche Generation von Pflanzungen und Screenings einzuführen, um homozygote T-DNA-freie Pflanzen zu erhalten.
Die Auswahl des U6-Promotors für diese Studie basierte auf seiner weit verbreiteten Verwendung und nachgewiesenen Wirksamkeit bei der Genom-Editierung von Pflanzen, wie die jüngste Arbeit von Lv et al.29zur effizienten Schaffung funktioneller Reissorten zeigt. Dieser Promotor wurde in Reis gründlich validiert und optimiert, und wir haben uns entschieden, diesem bewährten Weg zu folgen, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse zu gewährleisten. Obwohl wir die potenziellen Vorteile des CmYLCV-Promotors anerkennen, wie von Čermák et al.30 vorgeschlagen, erkennen wir an, dass weitere Untersuchungen, die die Leistung verschiedener Promotoren in unserem spezifischen experimentellen System vergleichen, wertvolle Erkenntnisse liefern würden.
Der Einsatz von Gen-Editing-Technologien zur präzisen Modifikation funktioneller genomischer Loci in Pflanzen unterstreicht die Bedeutung einer effizienten Vektorverabreichung und des Detektions von Genmutationen. Um editierte Pflanzenlinien zu neuen Kultursorten weiterzuentwickeln, ist es zwingend erforderlich, den homozygoten Zustand des Zielgens zu ermitteln und Individuen auszuwählen, die frei von exogenen T-DNA-Fragmenten sind. Dieses Protokoll, das für eine Reissorte entwickelt wurde, die mit hochresistenter Stärke angereichert ist, unterstreicht das Potenzial der Gen-Editing-Technologie, um die Züchtung von funktionellem Reis zu beschleunigen.
Das Manuskript zielt darauf ab, einen Beitrag zum Feld zu leisten, indem es einen umfassenden und systematischen Ansatz zur Schaffung funktionaler Reissorten durch Gen-Editierung präsentiert. Die Studie geht über die bloße Beschreibung der Anwendung eines Gen-Editing-Tools hinaus. Vielmehr konzentriert es sich auf die Integration mehrerer Aspekte, von der Genauswahl und der Optimierung der Editierungswerkzeuge bis hin zur detaillierten phänotypischen und agronomischen Merkmalsanalyse. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Arbeit zwar keine völlig neuen Technologien oder Gene einführt, aber einen Beitrag zum Feld leistet, indem sie einen umfassenden und rigorosen Ansatz zur Schaffung funktionaler Reissorten durch Gen-Editierung demonstriert.
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 x Taq Plus Master Mix II | Vazyme Biotech Co.,Ltd | P213 | Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes |
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio | Phyto Technology | D309 | |
AAM medium | Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd | M9051C | |
BsaI-HF | New england biolabs | R3535 | Bsa I enzyme digestion of the editing vector |
Carbenicillin antibiotics | Applygen | APC8250-5 | Selection medium, regeneration medium |
Casaminoacid | BBI-Life SciencesCorporation | A603060-0500 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
DH5α Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | DL1001 | E. coli competent cells |
D-Sorbitol | BBI-Life SciencesCorporation | A610491-0500 | |
EDTA,disodium salt,dihydrate | Diamond | A100105-0500 | CTAB buffer |
EHA105 Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | AC1010 | Agrobacterium competent cells |
FastPure Plasmid Mini Kit | Vazyme Biotech Co.,Ltd | REC01-100 | Plasmid isolated |
Hygromycin antibiotics | Yeasen | 60224ES | co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium |
Kanamycin antibiotics | Yeasen | 60206ES10 | Selection agrobacterium |
KOH | Macklin | P766798 | CTAB buffer |
L-Glutamine | Phyto Technology | G229 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
L-Proline | Phyto Technology | P698 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) | - | - | Japonica varieties for breeding RS rice |
Mill rice mechine | MARUMASU | MHR1500A | To produce white rice |
Murashige Skoog | Phyto Technology | M519 | Root medium, regeneration medium |
Myo-inositol | Phyto Technology | I703 | Regeneration medium |
NaCl | Macklin | S805275 | For YEP media |
NB Basal Medium | Phyto Technology | N492 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Peptone | Solarbio | LA8800 | For YEP media |
Phytogel | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S24793 | |
Pot | Midea group Co. | MB-5E86 | For cooking rice |
Refrigerator | Haier | BCD-170 | Storage the medium |
Resistant Starch Assay Kit | Megazyme | K-RSTAR | Measurement and analysis resistant starch |
Rifampicin antibiotics | Sigma | R3501-250MG | Selection agrobacterium |
Sodium hypochlorite solution | Macklin | S817439 | For seed sterilization |
Sucrose | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | B21647 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
T4 DNA Ligase | New england biolabs | M0202 | Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector |
The glucose monitor | Medical Equipment & Supply Co., Ltd | Xuetang 582 | Detection the blood glucose |
Tris-HCL | Macklin | T766494 | CTAB buffer |
Yeast Agar | Solarbio | LA1370 | For YEP media |
YEP media | - | - | Cultivation of Agrobacterium |
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