게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

이 프로토콜은 유전체 편집 기술을 사용하여 정확하고 효율적이며 기술적으로 간단한 방식으로 설계에 따라 저항성 전분 쌀 품종을 육종하는 것을 설명합니다.

전통적인 교잡 및 돌연변이 육종과 같이 주로 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 방법에 의존하는 작물 육종에 대한 기존의 접근 방식은 표적 형질을 효율적으로 도입하고 다양한 식물 개체군을 생성하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 반대로, 게놈 편집 기술의 출현은 패러다임의 변화를 가져왔으며, 식물 게놈의 정확하고 신속한 조작을 가능하게 하여 원하는 특성을 의도적으로 도입할 수 있게 되었습니다. 가장 널리 사용되는 편집 도구 중 하나는 CRISPR/Cas 시스템으로, 연구자들이 중요한 생물학 관련 문제를 연구하는 데 사용해 왔습니다. 그러나 게놈 편집의 정확하고 효과적인 워크플로우는 작물 육종에서 잘 정의되지 않았습니다. 이 연구에서는 당뇨병 및 비만과 같은 질병을 예방하는 데 중요한 역할을 하는 기능적 특성인 저항성 전분(RS)이 높은 수준으로 풍부한 쌀 품종을 육종하는 전 과정을 보여주었습니다. 워크플로우에는 기능성 SBEIIb 유전자 선택, 단일 가이드 RNA(sgRNA) 설계, 적절한 게놈 편집 벡터 선택, 벡터 전달 방법 결정, 식물 조직 배양 수행, 유전형 분석 돌연변이 및 표현형 분석과 같은 몇 가지 주요 단계가 포함되었습니다. 또한 프로세스의 각 단계에 필요한 시간 프레임이 명확하게 입증되었습니다. 이 프로토콜은 육종 과정을 간소화할 뿐만 아니라 형질 도입의 정확성과 효율성을 향상시켜 기능성 쌀 품종의 개발을 가속화합니다.

전통적인 육종은 작물에 형질을 도입하거나 충분한 다양성을 가진 식물 개체군을 생산하는 데 의존하며, 이를 위해서는 장기적인 현장 관찰이 필요하다 ^1,2. 전통적인 육종의 한계로 인해 유전자 편집 기술이 개발되어 작물의 게놈을 정밀하게 수정하여 식물 개체군의 원하는 형질을 얻을 수 있습니다³. 식물에서 가장 널리 사용되는 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease)로, 프로그래밍 가능한 RNA 유도 엔도뉴클레아제에 의존하여 DNA ^4,5에서 표적 이중 가닥 절단(DSB)을 생성합니다. 그런 다음 이러한 DSB는 세포의 자연적인 DNA 복구 메커니즘 ^6,7에 의해 복구되며, 종종 원하는 유전적 변화가 도입됩니다. 이 기술은 밀⁸, 옥수수⁹, 대두¹⁰, 쌀¹¹ 등 다양한 작물에 적용되어 왔지만, 주로 생물학적 문제를 드러내는 데 사용된다. 식물 유전자 기능을 규명하는 데 광범위하게 응용되는 것에 비해, 유전자 편집 기술을 작물 육종에 적용하는 연구는 상대적으로 부족하다¹².

작물의 유전자 편집 과정은 일반적으로 몇 가지 주요 단계를 포함하는 잘 정의된 워크플로우를 따른다¹³. 첫 번째 단계는 원하는 형질을 얻기 위해 수정해야 하는 특정 유전자 또는 유전 영역을 식별하는 것입니다. 둘째, 적절한 유전자 편집 시스템(예: CRISPR-Cas9 또는 CRISPR-Cas12)의 선택과 엔도뉴클레아제를 표적 부위로 유도하기 위한 특정 가이드 RNA의 설계를 포함하는 유전자 편집 전략을 설계합니다. 셋째, 유전자 편집 시스템은 그런 다음 전달 벡터에 통합되며, 이는 편집 기계를 식물 세포에 도입하는 데 사용됩니다. 이러한 벡터는 DNA, RNA 또는 리보핵단백질(RNP) 복합체일 수 있습니다. 그 후, 유전자 편집 벡터는 Agrobacterium 매개 형질전환, 입자 충격 또는 전기천공법을 포함한 다양한 방법을 사용하여 식물 세포로 전달됩니다. 즉시, 형질전환된 식물 세포는 유전적으로 편집된 굳은살 또는 배아 조직을 생성하기 위해 적절한 조건에서 배양됩니다. 그런 다음 이러한 조직은 조직 배양 기술을 통해 전체 식물로 재생됩니다. 재생된 식물은 원하는 유전적 변화의 존재를 확인하기 위해 엄격한 분자 특성 분석을 거칩니다.

Tsakirpaloglou et ^al.14 의 이전 논문은 벡터 설계에서 편집된 묘목 생성에 이르기까지 유전자 편집 과정에 대한 광범위한 개요를 제공하지만, 표적 유전자와 관련된 특정 형질에 대한 자세한 분석이나 편집된 작물의 농업 성능 또는 기능 검증에 대한 후속 평가는 다루지 않습니다. 우리는 단순히 쌀에서 유전자를 편집하는 것의 타당성을 입증하는 것을 넘어섰습니다. 우리의 연구는 편집된 쌀 라인의 생화학적, 분자적, 농업학적 특성에 대한 이 편집의 영향을 종합적으로 평가합니다. 여기에는 이전 유전자 편집 연구에서 광범위하게 탐구되지 않은 곡물 품질과 영양가에 영향을 미치는 중요한 요소인 전분 조성 평가가 포함됩니다.

쌀 전분은 일반적으로 ~20% 아밀로오스와 ~80% 아밀로펙틴¹⁵로 구성됩니다. SBEIIb는 아밀로펙틴 합성에 필수적인 효소이며 배젖에서 발현된다¹⁶. 헤어핀 RNA (RNAi) 및 microRNA 발현에 의한 OsSBEIIb의 녹다운은 저항성 전분 함량을 증가시켰습니다^17,18. 저항성 전분은 소장에서 소화 및 흡수될 수 없지만 장의 특정 소화 박테리아에 의해 단쇄 지방산과 가스로 분해될 수 있는 기질 전분입니다. 당뇨병은 빠르게 분해되지 않기 때문에 다른 전분에 비해 혈당지수가 낮고 식후 단기간 내에 혈당이 급격히 상승하지 않아 식이요법으로 당뇨병을 어느 정도 완화할 수 있다¹⁹. 또한 저항성 전분은 인슐린 반응 감소, 장 기능 조절, 지방 축적 방지, 체중 조절 촉진, 미네랄 이온의 흡수 촉진과 같은 더 많은 생리적 기능을 가지고 있습니다. 따라서 새로운 유형의 식이 섬유로 널리 추구되고 있습니다²⁰.

이러한 문제를 극복하고 기능성 벼 품종 육종을 위한 유전자 편집 기술을 성공적으로 활용하기 위해 우리는 쌀 내 운영 프로토콜을 개선하고 최적화했습니다. 우리의 초점은 표적 유전자 자리의 디자인을 꼼꼼하게 분석하고, 가장 적합한 유전자 편집 도구를 신중하게 선택하며, 육종 과정 전반에 걸쳐 엄격한 표현형 분석을 수행하는 것이었습니다. 이러한 기술의 힘과 효율성에 대한 증거로, 우리는 고저항성 전분이 풍부한 기능성 쌀 품종의 급속한 개발을 보여주는 사례 연구를 제시합니다. 이 사례는 기능성 쌀의 육종을 가속화하는 유전자 편집의 잠재력을 강조하며, 현재 이 분야의 연구 부족을 해결합니다.

이 연구는 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 중국의 Bellagen Biotechnology Co. Ltd에서 수행되었습니다. 참여하기 전에 연구 프로토콜은 정보에 입각한 동의를 제공한 피험자에게 철저히 설명되었습니다.

1. sgRNA 및 구축 벡터 설계(타이밍 5-7일)

참고: CRISPR/Cas-SF01 시스템(²¹)을 표현하기 위해 이진 벡터가 사용되었습니다. sgRNA에 대한 잠재적인 off-target site와 3개 미만의 뉴클레오티드(nt) 불일치가 없어야 합니다. sgRNA adapter는 편집 벡터의 Bsa I 효소 분해에 의해 생성되는 끈적한 말단을 보완해야 합니다. 소프트웨어 선택은 rice¹⁴에서 보고된 소프트웨어의 높은 효율성과 특이성, 그리고 연구 그룹에 대한 사용 편의성 및 접근성을 기반으로 했습니다.

1. NCBI 웹 사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로 이동하여 Japonica에서 OsSBEIIb(LOC4329532) 유전자를 검색합니다. SnapGene 소프트웨어 내에서 참조 게놈을 다운로드하고 액세스하십시오.
2. X134 품종의 OsSBEIIb 의 엑손 염기서열에서 삽입/결실(InDel) 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 분석하여 참조 게놈과 비교합니다. NCBI Primer Blast²² 를 활용하여 엑손 영역 측면의 프라이머를 설계합니다(보충 표 1).
3. Sanger 염기서열분석으로 X134 내 OsSBEIIb 유전자의 엑손 염기서열을 검증하기 위해 10μL의 중합효소 혼합 완충액과 1μL의 순방향 프라이머, 1μL의 역방향 프라이머, X134 조직의 gDNA 1μL 및 7μL의 증류수를 사용하여 반응을 준비합니다. 다음과 같이 PCR 프로그램을 실행하십시오 : 95 °C, 3 분; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) 35 사이클 및 72 °C, 5 분.
4. Tsakirpaloglou et ^al.14프로토콜을 준수하고 PAM 염기서열이 TTN인지 확인하여 X134의 OsSBEIIb 엑손 염기서열에서 sgRNA를 설계합니다.
5. forward primer의 5' 말단에 -ACAC- oligos를 추가하고 reverse primer의 5' 말단에 -GGCC- oligos를 추가하여 sgRNA 염기서열을 수정합니다. 정방향/역방향 프라이머(sgRNA용)를 상업적으로 합성합니다.
6. 정방향 및 역방향 프라이머를 10μmol/L의 농도로 용해시키고 각각 1μL를 취한 다음 8μL의 어닐 버퍼(Tris-EDTA 버퍼 + 50mM NaCl)를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. PCR 기계에 넣고 PCR 기계에서 다음과 같이 어닐링 프로그램을 실행합니다: 0.1 °C/s에서 95 °C에서 16 °C까지 느린 냉각 과정.
7. sgRNA를 게놈 편집 벡터로 조립합니다. 다음과 같이 반응을 준비합니다: 0.5 μL의 T4 DNA 리가아제, 1 μL의 Bsa I, 2 μL의 10x 제한 완충액, 2 μL의 10x T4 DNA 리가아제 완충액, 2 μL의 어닐링 프라이머, 2.5 μL의 벡터(그 부피는 비율에 맞게 조정됨) 및 10 μL의 증류수를 함유합니다. 모든 경우에 2:1 인서트 대 벡터 비율을 사용하여 조립 효율성을 달성하십시오. PCR 조립 프로그램을 30 사이클로 (37 °C, 2 분; 16 °C, 3 분) 및 55 °C, 30 분으로 실행합니다.
8. 생성된 벡터를 설명된 대로 E. coli cell로 변환한다²³.
9. 플라스미드 내 gRNA 삽입 부위 측면에 있는 프라이머를 설계합니다. 이러한 프라이머를 사용하여 개별 콜로니에서 PCR 증폭을 수행하여 성공적인 삽입을 스크리닝합니다. PCR 산물의 Sanger 염기서열분석을 수행하여 성공적인 클로닝을 확인하고 plasmid²⁴를 분리합니다.

2. 아그로박테리움 의 형질전환(타이밍 4일)

1. EHA105 Agrobacterium Competent Cell을 얼음 위에서 해동합니다. 1-2 μL의 플라스미드 DNA(~100-200 ng의 DNA 포함)를 세포 현탁액에 넣고 부드럽게 섞습니다.
2. 튜브를 얼음 위에 5분 동안, 액체 질소를 5분 동안, 37°C에서 열 충격을 5분 동안 가한 다음 얼음 수조에 5분 동안 넣어 열 충격 변형을 수행합니다.
3. 항생제 없이 700μL의 효모 추출물 펩톤(YEP) 배지를 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다. 28°C, 200-250rpm에서 2-3시간 동안 진탕 인큐베이터에서 세포를 회수합니다.
4. 배양액을 2,800 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 약 100μL를 남기고 대부분의 상층액을 버리고 세포를 재현탁시킵니다. 플라스미드 선택을 위해 1% 항생제(Kanamycin 및 Rifampicin)가 포함된 YEP 한천 플레이트에 세포를 펼칩니다. 플레이트를 28 °C에서 24-48 시간 동안 배양합니다.
5. CRISPR/Cas를 함유하고 있는 단일 Agrobacterium 콜로니가 포함된 피펫 팁으로 YEP(항생제 내성 포함) 플레이트를 줄무늬 만들고 세포를 적절한 항생제와 함께 5mL의 YEP 액체 배지로 옮깁니다. 액체를 28 °C에서 3 일 동안 배양합니다.
6. 형질전환된 Agrobacterium 균주를 -80°C에서 글리세롤 스톡으로 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.

3. Agrobacterium에 의한 벼 형질전환 (타이밍 3개월)

주의: 식물 세포(²⁵)에서 외래 DNA 서열의 전달 및 발현을 위해 여러 식물 형질전환 방법이 보고되었다. 게놈에서 DSB의 단일 복제 통합 및 낮은 빈도를 고려할 때 Agrobacterium 매개 형질전환은 발현 DNA 단편을 쌀 염색체에 통합하기 위해 선택되는 방법입니다.

1. ²⁵년 프로토콜에 따라 벼의 Agrobacterium 매개 형질전환을 수행합니다. 활발하게 자라는 캘리(황백색, 비교적 건조하고 직경 1-3mm)는 효율적인 변형을 위한 핵심 포인트입니다. 굳은살을 Agrobacterium에 감염시키기 전에 묘목이 발달하거나 갈색 굳은살이 있는 씨앗을 버리십시오.

4. 유전자형 전환 식물 유전형 분석 및 종자 수확(타이밍 8개월)

참고: 동형접합 돌연변이(homozygous mutation)와 외래 DNA가 없는 계통을 달성하기 위해 2세대의 벼를 재배할 것입니다.

1. 묘목 조직 샘플링: 형질전환 식물을 화분에 이식하고 온실에서 1개월 동안 키웁니다. 돌연변이 유형을 분석하려면 단일 묘목의 각 경운기에서 2-3mg의 신선한 잎을 수집하여 단일 샘플로 결합합니다.
2. 게놈 DNA 추출: 식물 게놈 DNA 추출을 위해 확립된 프로토콜을 따릅니다²⁶.
3. 돌연변이 프라이머 설계(보충 표 1): sgRNA 타겟 부위를 둘러싼 SBEIIb 유전자 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머 설계(¹⁴). 증폭된 단편의 길이는 493bp입니다.
4. 돌연변이의 유전형 분석: PCR 단편을 직접 염기서열분석하거나 T-클론 벡터로 클로닝하고 Sanger 방법을 사용하여 변이를 식별하기 위해 염기서열을 분석합니다¹⁴.
5. 씨앗 수확: 동형접합 프레임 시프트 돌연변이를 보이는 E0 계통을 선택하고 온실에 심어 씨앗을 얻습니다.
6. T-DNA를 식별하기 위한 프라이머 설계: 돌연변이 중 외래 DNA-free 라인을 식별하기 위해 구조체의 Hygromycin 카세트, UBI 카세트 및 Cas 카세트에 대한 3개의 특정 프라이머를 설계합니다(보충 표 1).
7. 외국 T-DNA가 없는 계통 확인: 4.2단계에서 설명한 대로 2주령 묘목에서 잎을 수확하고 식물 게놈 DNA를 추출합니다. 다음 프로그램으로 게놈 PCR을 수행합니다: 95°C, 3분; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) 35 사이클 및 72 °C, 5 분. 이를 통해 식물 게놈에서 hygromycin, UBI 및 Cas cassette를 검출할 수 있습니다.
8. 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분석하고 띠가 보이지 않는 계열을 선택하여 transgene-free E1 계열임을 나타냅니다. 이 선택된 라인에서 씨앗을 수확하십시오.

5. 저항성 전분 함량 측정(타이밍 4일)

1. 돌연변이 및 X134 식물의 씨앗을 수확하고 실온에서 자연 건조시켜 약 13%-15%의 수분 함량을 유지합니다. 아래에 설명된 췌장 α-아밀로오스/아밀로코시다아제(AMG) 절차를 사용하여 저항성 전분 함량을 측정합니다.
2. 필링 기계를 작동시키고 쌀알 10g을 피더에 넣어 글루메 껍질을 효율적으로 제거하면 벼씨를 가공할 수 있습니다.
3. 껍질을 벗긴 쌀씨를 정미소에 넣고 60초 동안 작동시켜 알류론층을 제거하여 광택이 나는 쌀을 만듭니다.
4. 도정된 쌀을 티슈 그라인더에 넣고 분쇄 빈도를 60Hz로 조정합니다. 그라인더를 15초 동안 실행하고 사이클을 2번 반복하여 쌀가루를 생성합니다.
5. 빻은 쌀가루를 페트리 접시에 넣고 예열된 오븐에 넣습니다. 온도를 37°C로 설정하고 12시간 동안 건조시킵니다.
6. 100 mg ± 5 mg의 시료를 정확하게 칭량하고 2.0 mL 미세 원심분리 튜브에 직접 붓습니다. 튜브를 부드럽게 두드려 샘플이 바닥에 가라앉도록 합니다.
7. 튜브에 정제수 180μL를 넣고 샘플을 수조에서 20분 동안 끓입니다.
8. 샘플을 실온으로 식힌 다음 췌장 α-아밀라아제(10mg/mL)를 함유한 AMG 4mL(3U/mL)를 각 튜브에 주입합니다.
9. 튜브를 단단히 닫고 와류 발진기에 혼합한 다음 연속 교반으로 37°C에서 16시간 동안 튜브를 배양합니다.
10. 4mL의 에탄올을 넣고 소용돌이를 사용하여 혼합합니다. 튜브를 1,500 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
11. 상층액을 디캔팅하고 50% 에탄올 2mL와 50% IMS 6mL를 넣고 와류와 원심분리기를 사용하여 혼합합니다.
12. 상층액을 조심스럽게 붓고 튜브를 뒤집어 과도한 액체를 배출합니다. 튜브를 얼음 수조에 넣고 각 튜브에 2M KOH 2mL를 첨가하고 샘플을 20분 동안 저어 플록을 재현탁시키고 저항성 전분을 용해시킵니다.
13. 각 시험관에 8mL의 1.2M 아세트산나트륨 완충액(pH 3.8)을 추가하고 자석 교반기를 사용하여 혼합합니다.
14. 즉시 0.1mL의 AMG(3300U/mL)를 도입하고 철저히 혼합한 다음 와류를 사용하여 간헐적으로 혼합하면서 50°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 1,500 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
15. 상층액 0.1mL를 유리관에 옮기고 3mL의 포도당 산화효소/과산화효소(GOPOD) 시약을 첨가하고 50°C에서 20분 동안 배양합니다. 0.1mL의 100mM 아세트산나트륨 완충액과 3mL의 GOPOD 시약을 혼합하여 시약 블랭크를 준비합니다. 0.1mL의 D-glucose와 3mL의 GOPOD 시약을 혼합하여 표준물질을 준비합니다.
16. 각 블랭크 용액 200μL, 테스트할 용액 및 표준 용액을 96웰 플레이트에 조심스럽게 피펫팅합니다.
17. 블랭크 용액에 대해 510nm에서 각 샘플의 흡광도를 측정하고 제공된 공식을 사용하여 저항성 전분 함량을 계산합니다.
    저항성 전분(g/100g) = ΔA × F/W ×9.27
    여기서 ΔA = 흡광도는 시약 블랭크에 대해 판독됩니다. F = 흡광도에서 마이크로그램으로의 변환(GOPOD 반응에서 D-글루코스 100μg에 대해 얻어진 흡광도가 측정됨); W = 분석된 샘플의 건조 중량.

6. 식후 혈당 반응 (타이밍 5일)

1. 참가자에 대해 다음 포함 기준을 사용하십시오: 18세에서 60세 사이의 건강한 아시아계 중국인, 비흡연자, 체질량 지수(BMI) 18.5에서 25kg/^m2 사이, 정상 혈압(< 140/90mm. Hg). 대사 질환(예: 당뇨병, 고혈압 등), 위장 장애, 내분비계 이상 또는 정신 질환과 같은 제외 기준을 사용하십시오. 총 10명의 참가자를 심사하고 모집했습니다.
2. 테스트 세션 절차(2일 연속)
   1. Day 0 (준비일): 참가자에게 시험 전 처음 3일 동안 규칙적인 수면 패턴과 정상적인 식단을 유지하도록 요청합니다. 시험 전날 저녁(20:00 이후)에는 참가자에게 고섬유질 및 고설탕 식사를 자제하도록 요청하십시오. 격렬한 운동은 1일차 아침에 권장되지 않습니다.
   2. 1일차(시험일): 쌀씨를 제분하여 백미를 준비한 다음 백미를 2번 헹굽니다. 냄비에 물 1.5:백미 1:1로 채웁니다. 물이 완전히 흡수될 때까지 쌀을 끓입니다. 불을 끄고 냄비 뚜껑을 덮고 10분 동안 그대로 둡니다.
   3. 10명의 참가자를 두 개의 동일한 그룹에 무작위로 할당합니다: 한 그룹은 저항성 전분 백미를 먹일 테스트 그룹이고 다른 한 그룹은 X134 백미를 먹일 대조군입니다. 테스트가 시작되기 전에 참가자에게 10분 동안 휴식을 취하도록 요청합니다.
   4. 75% 의료용 알코올로 손가락 끝을 소독합니다. 란셋 장치를 손가락 끝으로 부드럽게 누르고 스프링을 풀어 피부를 찌릅니다. 손가락을 부드럽게 쥐어 작은 물방울을 만들고 이 물방울을 측정기에 있는 테스트 스트립의 혈액 흡수 끝에 접촉합니다. 측정기는 자동으로 혈액을 채취하고 테스트 프로세스를 시작합니다. 혈당 수치가 표시될 때까지 기다립니다.
   5. 쌀 섭취 및 혈액 샘플링: 참가자에게 준비된 쌀 50g과 물 200mL를 제시하고 5-10분 이내에 편안한 속도로 먹도록 요청합니다. 식사 후 정맥혈을 수집하십시오.amp식사 시작으로부터 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 시점에 정맥혈 샘플을 채취합니다. 6.2.4단계와 같이 혈당 분석을 수행합니다.

본 연구에서는 안정적인 저항성 전분 쌀 품종을 얻기 위해 게놈 편집을 통해 기능성 벼를 육종하는 전 과정을 입증했습니다. SBEIIb 를 타겟으로 하는 sgRNA를 CRISPR/Cas-SF01에 통합하고(Supplementary Figure 1), Agrobacterium transformation을 이용하여 벼에 침투하였으며, 스크리닝 및 발근 단계를 거쳐 E0 생성 식물을 획득하였습니다. 유전자 기능이 상실된 식물을 스크리닝하고 종자 수확 후 저항성 전분 함량을 측정했습니다(그림 1). Sanger 염기서열분석에 의해 E0 식물에서 동형접합 돌연변이(20.8%)가 발견되었으며, 표적 염기서열의 sbeIIb-1(-2bp, CC), sbeIIb-2 (-4bp, AGCC) 및 sbeIIb -3(-4bp, GTGC)은 코딩 영역에서 프레임시프트를 생성하여 비기능성 단백질을 생성했습니다(그림 2, 보충 그림 2 및 추가 그림 3).

SBEIIb 유전자에 sbeIIb-1, sbeIIb-2 및 sbeIIb-3 돌연변이가 있는 E1 식물을 식별하기 위해 세심한 선별 과정이 수행되었으며, 특히 T-DNA 삽입이 없는 것으로 확인되고 off-target 돌연변이의 증거를 보이지 않는 계통을 표적으로 삼았습니다. 그런 다음 이러한 식물을 추가 표현형 분석을 위해 선택했습니다. 모든 식물은 자연 현장 조건에서 성장했으며 성숙 후 씨앗을 수확했습니다(그림 3A). 이전 연구에 따르면 쌀 배유의 저항성 전분 함량은 도정된 쌀에 의해 나타나는 투명도의 정도를 결정한다²⁷. sbeIIb 돌연변이 식물의 알갱이는 X134 씨앗의 전형적인 반투명 모양과 대조적으로 흰색이고 완전히 불투명한 왁스 모양을 가지고 있었습니다(그림 3B). 돌연변이된 식물은 식물 높이(보충 그림 4A, C), 종자 경화율(그림 3C), 원추당 입자 수(그림 3D) 및 식물당 수확량(그림 3E)에서 X134 대조군과 구별할 수 없었으며, 돌연변이체에서 원추 길이가 11.9% 감소한 것을 제외하고는 돌연변이 식물(보충 그림 4B, D)이 감소했습니다.

sbeIIb의 RS 함량은 5.2%인데 비해 X134 야생형은 0.6%입니다(그림 4A). 기능적 영향을 더 자세히 조사하기 위해 RS 쌀 섭취 후 혈당 반응을 평가했습니다. 그 결과, RS 쌀을 섭취하면 쌀 섭취 후 15분과 30분에 포도당 반응이 각각 9.7%와 3.7% 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 4B). 중요한 것은 돌연변이 쌀을 섭취하는 개인의 혈당 수치가 X134 쌀을 섭취하는 사람에 비해 더 느리게 상승했다는 것인데, 이는 RS 쌀이 혈당 조절에 잠재적으로 적용될 수 있음을 시사합니다(그림 4B).

그림 1: 게놈 편집 기술에 의한 저항성 전분 쌀 육종 모델. 이 모델은 벡터를 Agrobacterium 세포로 전달, Agrobacterium에 의한 쌀 굳은살 감염, 벼 싹 재생, 쌀 곡물 수확 및 저항성 전분 분석과 같은 주요 단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: sbeIIb 돌연변이의 유전자형 및 예측 단백질 염기서열. Sanger sbellb-1, sbellb-2 및 sbellb-3의 크로마토그램 염기서열분석. 검은색은 정상적인 아미노산 서열을 나타냅니다. 검은색 점선은 아미노산의 프레임시프트 돌연변이를 나타내고, 빨간색은 정지 코돈을 나타냅니다. 대상 위치는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: sbeIIb 돌연변이의 농업 경제학적 특성 및 입자 품질. (A) sbeIIb 의 식물 표현형. (B) 현미의 X134 및 sbeIIb-1 돌연변이의 출현 비교. (C-E) 종자 설정 속도, 원추 당 곡물, X134 및 sbeIIb의 식물 당 수확량. 데이터는 SD± 평균입니다. NS는 스튜던트 t-검정(Student's t-test, n=20)에 따르면 유의한 차이가 없음을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 성숙한 곡물의 저항성 전분 함량과 혈당 수치. (A) sbeIIb 입자의 저항성 전분 함량 측정, n=3. (B) sbeIIb 쌀 섭취 후 혈당 곡선. 데이터는 SD± 평균입니다. ** , p 는 학생의 t-검정에 따라 0.01< n=5입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: CRISPR/Cas-SF01의 벡터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: OsSBEIIb 및 sbeIIb 돌연변이의 예측 단백질 서열. 프레임시프트 시퀀스는 빨간색으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: sbeIIb-1 돌연변이의 식물 형질 분석. (A) sbeIIb-1 돌연변이의 성장 표현형. (B) sbeIIb-1 돌연변이의 스파이크 패턴. (C) sbeIIb-1 돌연변이의 식물 높이. (D) sbeIIb-1 돌연변이의 원추 길이. 데이터는 SD± 수단입니다. NS는 유의미한 차이가 없음을 의미합니다. **, p 는 Student's t-test에 따라 0.01<. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충표 1. 이 연구에 사용된 프라이머 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

CRISPR/Cas-SF01 기반 knockdown 벡터를 구성하는 과정에서 single-guide RNA(sgRNA)의 세심한 선택이 중요합니다. 이를 위해서는 타겟 이탈 효과를 최소화하면서 높은 편집 효율성을 나타내는 시퀀스를 채택해야 합니다. 또한, 표적 프라이머의 synthesis는 벡터의 splice site와 일치하는 short adapter oligo를 통합하여 원활한 통합을 보장합니다. 특히, 순차적 효소 분해, 겔 정제 및 결찰이 필요했던 이전 방법론과 달리, 본 연구는 효소 절단 및 접합을 올인원 시스템에 통합하여 프로세스를 간소화했습니다. 이 향상된 기능은 운영 효율성을 개선하고 실험 일정을 단축합니다.

Cas-SF01을 표준 Cas 9 뉴클레아제와 비교할 때 뚜렷한 장점이 나타나 분자 식물 육종에서의 잠재력을 강조합니다. 이러한 장점으로 인해 Cas-SF01은 농업 생명 공학 분야에서 유망한 도구로 자리매김하고 있습니다. 첫째, Cas-SF01의 더 작은 단백질 크기는 planta의 세포 전달 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 둘째, crRNA 염기서열이 짧아 다중화된 표적화 전략의 설계를 용이하게 하여 더 복잡한 유전자 변형을 가능하게 한다²⁸. 셋째, Cas-SF01은 전형적으로 Cas9의 전형적인 1 -bp indels에 비해 대규모 돌연변이를 유발하며, 이는 보다 실질적인 유전적 변형의 가능성을 시사한다²⁹.

작물 유전자 편집 분야에서는 몇 가지 요인이 성공적인 결과를 보장하는 데 중추적인 역할을 합니다. 첫째, sgRNA 인식을 방해하여 편집 과정의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 삽입, 결실 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 방지하기 위해 편집된 품종에서 유전자 염기서열을 확인하는 것이 필수적입니다. 둘째, 형질전환을 위한 적절한 아그로박테리움 균주의 선택은 작업하는 벼 품종에 따라 다르며, 이는 다양한 쌀 품종에서 성공적인 유전자 편집을 달성하기 위한 균주 선택의 중요성을 강조합니다. 또한 E0 세대 편집 묘목의 유전형 분석은 돌연변이 유형의 일관성을 보장하는 데 중요합니다. 이 유전형 분석은 각 경운기의 맨 위 잎에서 추출한 DNA를 사용하여 성장 1개월 후에 수행해야 합니다. Cas-SF01의 뛰어난 편집 효율성 덕분에 E0 세대에서 동형접합 편집 라인을 확보할 수 있어 E1 세대에서 T-DNA가 없는 물질을 쉽게 선택하고 번식 과정을 가속화할 수 있습니다. 농업 형질을 평가하기 전에 편집된 표현형을 설정하는 것이 중요한데, 이는 다른 형질에 대한 영향을 이해하고 새로운 품종의 원하는 특성을 결정하는 데 도움이 되기 때문입니다.

이 절차에는 수정 사항 및 문제 해결이 있습니다. 다양한 작물 종을 다룰 때 의도된 유전자 변형에 가장 적합한 도구를 확인하기 위해 Cas9, Cpf1 및 Cas-SF01의 편집 효율성을 비교하는 것이 필수적입니다. 또한, E0 세대에서 동형접합 편집된 라인을 식별할 수 없는 경우, 동형접합 T-DNA가 없는 식물을 획득하기 위해 스크리닝 샘플 크기를 늘리거나 추가 세대의 심기 및 스크리닝을 도입해야 할 수 있습니다.

이 연구를 위한 U6 프로모터의 선택은 기능성 쌀 품종을 효율적으로 만드는 데 있어 Lv et ^al.29의 최근 작업에 의해 입증된 바와 같이 식물 게놈 편집에서 널리 사용되고 확립된 효능을 기반으로 했습니다. 이 프로모터는 쌀에서 철저하게 검증되고 최적화되었으며, 우리는 결과의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 이 잘 정립된 경로를 따르기로 결정했습니다. Čermák et ^al.30이 제안한 바와 같이 CmYLCV 프로모터의 잠재적 이점을 인정하면서도, 당사의 특정 실험 시스템에서 서로 다른 프로모터의 성능을 비교하는 추가 조사가 귀중한 통찰력을 제공할 것임을 인식하고 있습니다.

식물의 기능적 게놈 위치를 정밀하게 수정하기 위한 유전자 편집 기술의 사용은 효율적인 벡터 전달과 유전자 돌연변이 검출의 중요성을 강조합니다. 편집된 식물 계통을 새로운 작물 품종으로 발전시키려면 표적 유전자의 동형접합 상태를 확인하고 외인성 T-DNA 단편이 없는 개체를 선택하는 것이 필수적입니다. 고저항성 전분으로 강화된 쌀 품종을 위해 개발된 이 프로토콜은 기능성 쌀의 육종을 촉진하는 유전자 편집 기술의 잠재력을 강조합니다.

이 논문은 유전자 편집을 통해 기능성 벼 품종을 만드는 포괄적이고 체계적인 접근 방식을 제시함으로써 이 분야에 기여하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 단순히 유전자 편집 도구의 적용을 설명하는 것 이상입니다. 오히려, 유전자 선택 및 편집 도구 최적화에서 상세한 표현형 및 농업 형질 분석에 이르기까지 여러 측면의 통합에 중점을 둡니다. 요약하자면, 이 연구가 완전히 새로운 기술이나 유전자를 도입하지는 않을지 모르지만, 유전자 편집을 통해 기능성 벼 품종을 만드는 포괄적이고 엄격한 접근 방식을 보여줌으로써 이 분야에 기여하고 있습니다.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 Biological Breeding-Major Projects(2023ZD04074)의 자금 지원을 받았습니다.