גידול לפי תכנון לאורז פונקציונלי עם טכנולוגיות עריכת גנום

הפרוטוקול מתאר גידול זני אורז עמילן עמידים על ידי תכנון באמצעות טכנולוגיות עריכת גנום בצורה מדויקת, יעילה ופשוטה מבחינה טכנית.

הגישות הקונבנציונליות לגידול יבולים, המסתמכות בעיקר על שיטות גוזלות זמן ועבודה אינטנסיביות כגון הכלאה מסורתית וגידול מוטציות, מתמודדות עם אתגרים בהחדרה יעילה של תכונות ממוקדות ויצירת אוכלוסיות צמחים מגוונות. לעומת זאת, הופעתן של טכנולוגיות לעריכת גנום הובילה לשינוי פרדיגמה, המאפשר מניפולציה מדויקת ומזורזת של גנומים צמחיים כדי להציג באופן מכוון את המאפיינים הרצויים. אחד מכלי העריכה הנפוצים ביותר הוא מערכת CRISPR/Cas, אשר שימשה חוקרים לחקר בעיות חשובות הקשורות לביולוגיה. עם זאת, זרימת העבודה המדויקת והיעילה של עריכת גנום לא הוגדרה היטב בגידול יבולים. במחקר זה הדגמנו את כל התהליך של גידול זני אורז מועשרים ברמות גבוהות של עמילן עמיד (RS), תכונה פונקציונלית הממלאת תפקיד מכריע במניעת מחלות כגון סוכרת והשמנת יתר. תהליך העבודה כלל מספר שלבים מרכזיים, כגון בחירת גן SBEIIb פונקציונלי, תכנון הרנ"א המנחה היחיד (sgRNA), בחירת וקטור עריכת גנום מתאים, קביעת שיטת העברת הווקטור, ביצוע תרבית רקמת צמחים, מוטציה גנוטיפית וניתוח פנוטיפי. בנוסף, מסגרת הזמן הנדרשת לכל שלב בתהליך הודגמה בבירור. פרוטוקול זה לא רק מייעל את תהליך הרבייה, אלא גם משפר את הדיוק והיעילות של החדרת תכונות, ובכך מאיץ את הפיתוח של זני אורז פונקציונליים.

גידול מסורתי מסתמך על החדרת תכונות לגידולים או על ייצור אוכלוסיות צמחים עם מספיק שונות, מה שדורש תצפית שדה ארוכת טווח ^1,2. בשל מגבלות הרבייה המסורתית, פותחה טכנולוגיית עריכת גנים, אשר יכולה לשנות במדויק את הגנום של גידולים כדי להשיג תכונות רצויות של אוכלוסיות צמחים³. מערכת עריכת הגנים הנפוצה ביותר בצמחים היא CRISPR/Cas (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), אשר מסתמכת על אנדונוקלאז מונחה רנ"א הניתן לתכנות כדי ליצור שברים דו-גדיליים ממוקדים (DSB) בדנ"א ^4,5. DSB אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנוני תיקון הדנ"א הטבעיים של התא ^6,7, ולעתים קרובות התוצאה היא הכנסת השינויים הגנטיים הרצויים. למרות שטכנולוגיה זו יושמה בגידולים שונים, כולל חיטה⁸, תירס⁹, סויה¹⁰ ואורז¹¹, היא משמשת בעיקר לחשיפת בעיות ביולוגיות. בהשוואה ליישומו הנרחב בהבהרת תפקודי גנים של צמחים, המחקר על יישום טכנולוגיות עריכת גנים להשבחת יבולים נותר נדיר יחסית¹².

תהליך עריכת הגנים בגידולים מתבצע בדרך כלל באמצעות זרימת עבודה מוגדרת היטב הכוללת מספר שלבים מרכזיים:¹³. הצעד הראשון כרוך בזיהוי הגן או האזור הגנטי הספציפי שיש לשנות כדי להשיג את התכונה הרצויה. שנית, מתוכננת אסטרטגיית עריכת גנים, הכוללת בחירה של מערכת עריכת גנים מתאימה (למשל, CRISPR-Cas9 או CRISPR-Cas12) ועיצוב של רנ"א מנחה ספציפי שיכוון את האנדונוקלאז לאתר המטרה. שלישית, מערכת עריכת הגנים משולבת לאחר מכן בווקטור מסירה, המשמש להחדרת מכונות העריכה לתאי הצמח. וקטורים אלה יכולים להיות קומפלקסים של DNA, RNA או ריבונוקלאו פרוטאין (RNP). לאחר מכן, וקטורי עריכת הגנים מועברים לתאי הצמח בשיטות שונות, כולל טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום, הפצצת חלקיקים או אלקטרופורציה. באופן מיידי, תאי הצמח שעברו טרנספורמציה מתורבתים בתנאים מתאימים כדי ליצור יבלות ערוכות גנטית או רקמות עובריות. רקמות אלה מתחדשות לאחר מכן לצמחים שלמים באמצעות טכניקות תרבית רקמות. הצמחים המתחדשים עוברים אפיון מולקולרי קפדני כדי לאשר את קיומם של השינויים הגנטיים הרצויים.

מאמר קודם של Tsakirpaloglou et ^al.14 מספק סקירה רחבה של תהליך עריכת הגנים, מתכנון וקטורי ועד ליצירת שתילים ערוכים, אך הוא אינו מתעמק בניתוח מפורט של תכונות ספציפיות הקשורות לגן היעד ולא בהערכה שלאחר מכן של ביצועים אגרונומיים או אימות פונקציונלי של הגידולים הערוכים. הלכנו מעבר להדגמת ההיתכנות של עריכת גן באורז. עבודתנו מעריכה באופן מקיף את ההשפעה של עריכה זו על התכונות הביוכימיות, המולקולריות והאגרונומיות של קווי האורז הערוכים. זה כולל הערכת הרכב עמילן, גורם קריטי המשפיע על איכות הדגנים וערכם התזונתי, שלא נחקר בהרחבה במחקרים קודמים על עריכת גנים.

עמילן אורז מורכב בדרך כלל ~ 20% עמילוז ו~ 80% עמילופקטין¹⁵. SBEIIb הוא אנזים חיוני לסינתזה של עמילופקטין ומתבטא באנדוספרם¹⁶. הפלת OsSBEIIb על ידי RNA סיכת שיער (RNAi) וביטוי מיקרו-רנ"א הגדילה את תכולת העמילן העמיד^17,18. עמילן עמיד הוא עמילן מצע שאינו יכול להתעכל ולהיספג במעי הדק, אך מסוגל להתפרק לחומצות שומן וגזים קצרי שרשרת על ידי חיידקי עיכול מסוימים במעיים. מכיוון שלא ניתן לפרק אותו במהירות, יש לו אינדקס גליקמי נמוך יותר בהשוואה לעמילנים אחרים ואינו גורם לעלייה מהירה ברמת הסוכר בדם תוך פרק זמן קצר לאחר האכילה, מה שיכול להקל על סוכרת במידה מסוימת בתזונה¹⁹. בנוסף, עמילן עמיד יש פונקציות פיזיולוגיות יותר, כגון הפחתת תגובת אינסולין, ויסות תפקוד המעי, מניעת הצטברות שומן, להקל על בקרת משקל, וקידום ספיגת יונים מינרליים. לכן, הוא נרדף באופן נרחב כמו סוג חדש של סיבים תזונתיים²⁰.

כדי להתגבר על אתגרים אלה ולהשתמש בהצלחה בטכנולוגיות עריכה גנטית לגידול זני אורז פונקציונליים, שיפרנו וביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקולים התפעוליים בתוך האורז. המיקוד שלנו היה לנתח בקפידה את העיצוב של אתר גן המטרה, לבחור בקפידה את כלי עריכת הגנים המתאימים ביותר, ולבצע ניתוח פנוטיפי קפדני לאורך כל תהליך הרבייה. כעדות לעוצמה וליעילות של טכנולוגיות אלה, אנו מציגים מקרה בוחן המציג את ההתפתחות המהירה של זן אורז פונקציונלי המועשר בעמילן עמיד במיוחד. דוגמה זו מדגישה את הפוטנציאל של עריכת גנים בהאצת גידול אורז פונקציונלי, תוך מתן מענה למחסור הנוכחי במחקר בתחום זה.

המחקר נערך בחברת Bellagen Biotechnology Co. Ltd בסין בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי. לפני ההשתתפות, פרוטוקול המחקר הוסבר ביסודיות לנבדקים, שסיפקו הסכמה מדעת.

1. תכנון sgRNA ווקטור בנייה (תזמון 5-7 ימים)

הערה: וקטור בינארי שימש לביטוי מערכת CRISPR/Cas-SF01²¹. אין פחות מ-3 נוקלאוטידים (nt) לא מתאימים לאתר פוטנציאלי מחוץ למטרה עבור sgRNA. מתאם sgRNA צריך להשלים את הקצה הדביק, אשר נוצר על ידי עיכול האנזים Bsa I של וקטור העריכה. בחירת התוכנה התבססה על היעילות הגבוהה והספציפיות המדווחת של התוכנה באורז¹⁴, כמו גם קלות השימוש והנגישות שלה לקבוצת המחקר.

1. נווט אל אתר NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) כדי לאחזר את הגן OsSBEIIb (LOC4329532) בג'פוניקה. הורד את גנום הייחוס וגש אליו בתוכנת SnapGene.
2. נתח את ההחדרות/מחיקות (InDel) ואת פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNP) ברצף האקסון של OsSBEIIb מזן X134, והשווה אותו לגנום הייחוס. השתמש ב- NCBI Primer Blast²² כדי לעצב פריימרים הצמודים לאזורי האקסון (טבלה משלימה 1).
3. כדי לאמת את רצף האקסון של הגן OsSBEIIb ב- X134 על ידי ריצוף Sanger, הכינו את התגובה באופן הבא: 10 μL של חיץ תערובת פולימראז עם 1 μL של פריימר קדמי, 1 μL של פריימר הפוך, 1 μL של gDNA מרקמות X134 ו -7 μL של מים מזוקקים. הפעל תוכנית PCR כדלקמן: 95 °C, 3 דקות; (95°C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) עם 35 מחזורים, ו- 72°C, 5 דקות.
4. תכנן את sgRNA על רצף האקסון OsSBEIIb של X134, תוך הקפדה על פרוטוקול Tsakirpaloglou et ^al.14והבטחת רצף PAM הוא TTN.
5. שנה את רצף sgRNA על ידי הוספת -ACAC- אוליגוס בקצה 5' של הפריימר הקדמי והוספת -GGCC- אוליגוס בקצה 5' של הפריימר ההפוך. סינתזה מסחרית של פריימרים קדימה/אחורה (עבור sgRNA).
6. ממיסים את הפריימרים קדימה ואחורה לריכוז של 10 μmol/L, לוקחים 1 μL מכל אחד, ומוסיפים ל-8 μL של חיץ אנאלי (חיץ Tris-EDTA + 50 mM NaCl) ומערבבים על ידי פיפטינג. הכנס למכונת ה-PCR והפעל את תוכנית החישול באופן הבא במכשיר PCR: תהליך קירור איטי 95°C עד 16°C ב-0.1°C/s.
7. הרכיבו את ה-sgRNA לתוך וקטור עריכת הגנום. הכן את התגובה באופן הבא: 20 μL של חיץ תערובת עם 0.5 μL של T4 DNA ligase, 1 μL של Bsa I, 2 μL של 10x מאגר הגבלה, 2 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 2 μL של פריימרים חישול, 2.5 μL של וקטור (נפח שלה מותאם כדי להתאים את היחס) ו 10 μL של מים מזוקקים. בכל המקרים, השתמש ביחס הוספה לווקטור של 2:1 כדי להשיג יעילות הרכבה. הפעל את תוכנית הרכבת ה- PCR כ- (37 ° C, 2 דקות; 16 ° C, 3 דקות) עם 30 מחזורים, ו- 55 ° C, 30 דקות.
8. הפוך את הווקטור שנוצר לתאי E. coli כמתואר²³.
9. תכננו פריימרים הצמודים לאתר החדרת ה-gRNA בתוך הפלסמיד. באמצעות פריימרים אלה, בצע הגברה PCR על מושבות בודדות כדי לסנן החדרות מוצלחות. בצע ריצוף Sanger של מוצרי PCR כדי לאשר את השיבוט המוצלח ולבודד פלסמיד²⁴.

2. טרנספורמציה של אגרובקטריום (תזמון 4 ימים)

1. הפשיר EHA105 Agrobacterium Competent Cell על קרח. הוסף 1-2 μL של DNA פלסמיד (המכיל ~ 100-200 ng של DNA) לתרחיף התא וערבב בעדינות.
2. בצע טרנספורמציה של הלם חום על ידי הנחת הצינור על קרח במשך 5 דקות, חנקן נוזלי במשך 5 דקות, שוק חום ב 37 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן באמבט הקרח במשך 5 דקות.
3. הוסיפו 700 מיקרוליטר של חומר פפטון תמצית שמרים (YEP), ללא אנטיביוטיקה, לצינור וערבבו בעדינות. לשחזר את התאים באינקובטור רועד ב 28 ° C, 200-250 סל"ד, במשך 2-3 שעות.
4. צנטריפוגה את התרבית ב 2,800 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את רוב הסופרנטנט, השאירו כ-100 מיקרוליטר, והשעו מחדש את התאים. מורחים את התאים על צלחות אגר YEP המכילות אנטיביוטיקה 1% (קנמיצין ורימפפיצין) לבחירת פלסמיד. לדגור על הצלחת ב 28 ° C במשך 24-48 שעות.
5. פזרו את צלחת YEP (עם עמידות לאנטיביוטיקה) עם קצה פיפטה המכיל מושבה אחת של אגרובקטריום המכיל את הקריספר/Cas והעבירו את התאים ל-5 מ"ל של מדיה נוזלית YEP עם אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור את הנוזל ב 28 ° C במשך 3 ימים.
6. אחסנו את זני אגרובקטריום שעברו טרנספורמציה כמאגרי גליצרול בטמפרטורה של -80°C לשימוש נוסף.

3. טרנספורמציה אורז על ידי Agrobacterium (תזמון 3 חודשים)

הערה: דווח על מספר שיטות טרנספורמציה של צמחים להעברה ולביטוי של רצף הדנ"א הזר בתא הצמח²⁵. בהתחשב בשילוב עותק יחיד ותדירות נמוכה של DSB בגנום, טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום היא השיטה המועדפת לשילוב ביטוי מקטע DNA בכרומוזומי אורז.

1. בצע טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של אורז בהתאם לפרוטוקול בשנת²⁵. הקלי הגדל באופן פעיל (לבן צהבהב, יבש יחסית, וקוטר 1-3 מ"מ) הוא נקודת מפתח לשינוי יעיל. השליכו את הזרעים עם התפתחות שתיל או יבלת חומה לפני הדבקת היבלת באגרובקטריום.

4. גנוטיפ צמחים טרנסגניים וקציר זרעים (תזמון 8 חודשים)

הערה: שני דורות של אורז יטופחו כדי להשיג מוטציה הומוזיגוטית וקווים נטולי דנ"א זר.

1. דגימת רקמת שתיל: השתילו את הצמחים הטרנסגניים בעציצים וגידלו אותם במשך חודש בחממה. כדי להעריך את סוג המוטציה, לאסוף 2-3 מ"ג של עלים טריים מכל עיבוד של שתיל יחיד ולשלב אותם לתוך דגימה אחת.
2. מיצוי DNA גנומי: עקוב אחר פרוטוקול מבוסס למיצוי DNA של גנום הצמח²⁶.
3. תכנון פריימרים למוטציה (טבלה משלימה 1): תכנון פריימרים PCR להגברת אזור הגן SBEIIb המקיף את אתר היעד sgRNA¹⁴. אורכו של השבר המוגבר הוא 493 bp.
4. גנוטיפ המוטציה: ריצוף ישיר של מקטעי PCR או שכפול שלהם לווקטור ורצף שיבוט T בשיטת סנגר לזיהוי מוטציות¹⁴.
5. קצירת זרעים: בחרו את קווי E0 המציגים מוטציות הומוזיגוטיות בשינוי מסגרת ושתלו אותם בחממה כדי להשיג זרעים.
6. תכנון הפריימרים לזיהוי T-DNA: תכנון שלושה פריימרים ספציפיים לקלטת היגרומיצין, קלטת UBI וקלטת Cas של המבנה כדי לזהות קווים נטולי דנ"א זרים בין המוטציות (טבלה משלימה 1).
7. אישור קווים נטולי T-DNA זרים: קציר עלים משתילים בני שבועיים והפקת DNA של גנום הצמח כמתואר בשלב 4.2. בצע PCR גנומי עם התוכנית הבאה: 95 °C, 3 דקות; (95°C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) עם 35 מחזורים, ו- 72°C, 5 דקות. זה מאפשר זיהוי של hygromycin, UBI, וקלטת Cas בגנום הצמח.
8. נתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל ובחר קווים שאינם מראים פסים, המציין שהם קווי E1 נטולי טרנסגן. קצרו את הזרעים מהקווים שנבחרו האלה.

5. מדידת תכולת עמילן עמיד (תזמון 4 ימים)

1. קצרו זרעים של צמחים מוטנטיים ו-X134 ואפשרו להם להתייבש באופן טבעי בטמפרטורת החדר, תוך שמירה על תכולת לחות של כ-13%-15%. קבע את תכולת העמילן העמיד באמצעות הליך הלבלב α-עמילוז/עמילוגלוקוזידאז (AMG) המתואר להלן.
2. הפעל את מכונת הפילינג והכנס 10 גרם של גרגרי אורז לתוך מזין כדי להסיר ביעילות את קליפת גלומה, וכתוצאה מכך זרעי אורז מעובדים.
3. מעבירים את זרעי האורז הקלופים לטחנת האורז ומפעילים אותם במשך 60 שניות כדי לחסל את שכבת האלורון, מה שמניב אורז מלוטש.
4. הכניסו את האורז המלוטש למטחנת הרקמות, והתאימו את תדירות הטחינה ל-60 הרץ. הפעילו את המטחנה במשך 15 שניות, חזרו על המחזור 2x כדי לייצר אבקת אורז.
5. מניחים את אבקת האורז הטחון בצלחת פטרי ומכניסים לתנור שחומם מראש. כוונו את הטמפרטורה ל-37°C ואפשרו לה להתייבש במשך 12 שעות.
6. במדויק לשקול 100 מ"ג ± 5 מ"ג של דגימות ויוצקים ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל. הקש בעדינות על הצינורית כדי לוודא שהדגימה שוקעת בתחתית.
7. הוסף 180 μL של מים מטוהרים לצינור והרתיח את הדגימות במשך 20 דקות באמבט מים.
8. אפשר לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הכנס 4 מ"ל של AMG (3 U / mL) המכיל α-עמילאז הלבלב (10 מ"ג / מ"ל) לתוך כל צינור.
9. סגור היטב את הצינורות, ערבב אותם על מתנד מערבולת, ודגר על הצינורות ב 37 ° C במשך 16 שעות עם תסיסה מתמשכת.
10. מוסיפים 4 מ"ל אתנול ומערבבים באמצעות מערבולת. צנטריפוגה את הצינור ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות.
11. מרוקנים את הסופרנטנט, מוסיפים 2 מ"ל של 50% אתנול ואחריו 6 מ"ל של 50% IMS, ומערבבים באמצעות מערבולת וצנטריפוגה.
12. בזהירות לשפוך את supernatant ולהפוך את הצינור כדי לנקז כל נוזל עודף. מניחים את הצינורות באמבט קרח, מוסיפים 2 מ"ל של 2 M KOH לכל צינור, ומערבבים את הדגימות במשך 20 דקות כדי להשהות מחדש את floc ולהמיס עמילן עמיד.
13. יש להוסיף 8 מ"ל של 1.2 מ"ל סודיום אצטט (pH 3.8) לכל מבחנה ולערבב באמצעות מערבל מגנטי.
14. יש להכניס מיד 0.1 מ"ל AMG (3300 U/mL), לערבב היטב ולדגור במשך 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 50°C עם ערבוב לסירוגין באמצעות מערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגו את הצינור ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות.
15. מעבירים 0.1 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור זכוכית, מוסיפים 3 מ"ל של מגיב גלוקוז אוקסידאז/פרוקסידאז (GOPOD) ודגורים ב-50°C למשך 20 דקות. הכינו ריאגנט ריק על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של 100 mM נתרן אצטט חיץ ו 3 מ"ל של מגיב GOPOD. הכן תקנים על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של D-גלוקוז עם 3 מ"ל של מגיב GOPOD.
16. בזהירות פיפטה 200 μL של כל פתרון ריק, הפתרון להיבדק, ואת הפתרון הסטנדרטי לתוך צלחת 96 באר.
17. מדוד את הספיגה של כל דגימה ב- 510 ננומטר כנגד התמיסה הריקה וחשב את תכולת העמילן העמיד באמצעות הנוסחה שסופקה.
    עמילן עמיד (גרם/100 גרם) = ΔA × F/W ×9.27
    כאשר ΔA = ספיגה לקרוא כנגד הריאגנט ריק; F = המרה מספיגה למיקרוגרמים (הספיגה המתקבלת עבור 100 מיקרוגרם של גלוקוז D בתגובת GOPOD נקבעת); W = משקל יבש של הדגימה שנותחה.

6. תגובת גלוקוז בדם לאחר הלידה (תזמון 5 ימים)

1. השתמש בקריטריוני ההכללה הבאים עבור המשתתפים: מבוגרים סינים אסיאתיים בריאים בגילאי 18 עד 60 שנים, לא מעשנים, מדד מסת גוף (BMI) בין 18.5 ל -25 ק"ג / מ"ר², ולחץ דם תקין (< 140/90 מ"מ כספית). השתמש בקריטריוני ההחרגה הבאים: מחלות מטבוליות (כגון סוכרת, יתר לחץ דם וכו '), הפרעות במערכת העיכול, הפרעות במערכת האנדוקרינית או מחלות נפש. בסך הכל נבדקו וגויסו 10 משתתפים.
2. הליך הבחינה (נמשך יומיים רצופים)
   1. יום 0 (יום הכנה): בקשו מהמשתתפים לשמור על דפוסי שינה קבועים ועל תזונה תקינה במשך 3 הימים הראשונים שקדמו לבחינה. בערב שלפני הבחינה (לאחר השעה 20:00) בקשו מהמשתתפים להימנע מארוחות עתירות סיבים וסוכר. פעילות גופנית נמרצת אינה מומלצת בבוקר היום הראשון.
   2. יום 1 (יום המבחן): מכינים אורז לבן על ידי טחינת זרעי האורז, ואז שוטפים את האורז הלבן פי 2. ממלאים סיר ב-1.5 חלקים מים עד 1 חלק אורז לבן. מרתיחים את האורז עד שהמים נספגים במלואם. מכבים את האש, מכסים את הסיר ונותנים לו לנוח 10 דקות.
   3. הקצו באופן אקראי את 10 המשתתפים לשתי קבוצות שוות: קבוצת בדיקה אחת שתוזן באורז לבן עמילן עמיד וקבוצת ביקורת אחת שתוזן באורז לבן X134. בקשו מהמשתתפים לנוח במשך 10 דקות לפני תחילת הבדיקה.
   4. יש לעקר את קצות האצבעות עם 75% אלכוהול רפואי. לחץ בעדינות על מכשיר lancet כנגד קצה האצבע ושחרר את הקפיץ כדי לדקור את העור. לחץ בעדינות את האצבע כדי לייצר טיפת דם קטנה וגע בטיפה זו בקצה סופג הדם של רצועת הבדיקה במטר. המונה שואב באופן אוטומטי את הדם ומתחיל את תהליך הבדיקה. המתן להצגת קריאת רמת הסוכר בדם.
   5. צריכת אורז ודגימת דם: הציגו למשתתפים 50 גרם מהאורז המוכן עם 200 מ"ל מים ובקשו מהם לאכול זאת בקצב נוח תוך 5-10 דקות. לאחר הארוחה, אספו דגימות דם ורידי בנקודות הזמן הבאות: 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות ו-120 דקות מתחילת הארוחה. בצע ניתוח גלוקוז בדם כמו בשלב 6.2.4.

במחקר הנוכחי, כל ההליכים של גידול אורז פונקציונלי הודגמו על ידי עריכת גנום כדי להשיג זני אורז עמילן עמיד יציב. שילבנו sgRNA המכוון ל-SBEIIb ב-CRISPR/Cas-SF01 (איור משלים 1), החדרנו לאורז באמצעות טרנספורמציית אגרובקטריום, וקיבלנו צמחים מדור E0 לאחר שלבי סינון והשתרשות. צמחים עם אובדן תפקוד גנים נבדקו, ותכולת העמילן העמיד שלהם נקבעה לאחר קציר הזרעים (איור 1). מוטציות הומוזיגוטיות (20.8%) נמצאו בצמחי E0 על ידי ריצוף Sanger, ו-sbeIIb-1 (-2bp, CC), sbeIIb-2 (-4bp, AGCC) ו-sbeIIb -3 (-4bp, GTGC) ברצף המטרה שיצר שינוי מסגרת באזור הקידוד ויצר חלבונים לא פונקציונליים (איור 2, איור משלים 2 ואיור משלים 3).

תהליך מיון קפדני בוצע כדי לזהות צמחי E1 המכילים את המוטציות sbeIIb-1, sbeIIb-2 ו-sbeIIb-3 בגן SBEIIb, תוך התמקדות ספציפית בקווים שאושרו כנקיים מהחדרות T-DNA ולא הציגו עדות למוטציות מחוץ למטרה. צמחים אלה נבחרו לאחר מכן לניתוח פנוטיפי נוסף. כל הצמחים גודלו בתנאי שדה טבעיים ונקטפו זרעים לאחר ההבשלה (איור 3A). מחקרים קודמים הצביעו על כך שתכולת העמילן העמיד של אנדוספרם אורז קובעת את מידת השקיפות המוצגת על ידי אורז טחון²⁷. גרגרי צמחים שעברו מוטציה ב-sbeIIb היו בעלי מראה שעווה, בהיותם לבנים ואטומים לחלוטין, בניגוד למראה השקוף האופייני של זרעי X134 (איור 3B). לא ניתן היה להבחין בין הצמחים שעברו מוטציה לבין בקרת X134 בגובה הצמח (איור משלים 4A,C), בקצב קיבוע הזרעים (איור 3C), במספר הגרגרים לפאניקה (איור 3D) וביבול לצמח (איור 3E), בניכוי אורך הפאניקה ירד ב-11.9% במוטנטים (איור משלים 4B,D).

תכולת ה-RS של ה-sbeIIb היא 5.2% בהשוואה ל-0.6% ב-X134 (איור 4A). כדי להמשיך לחקור את ההשלכות התפקודיות, הערכנו את תגובת הגלוקוז בדם לאחר צריכת אורז RS. התוצאות שלנו הצביעו על כך שצריכת אורז RS הביאה לירידה של 9.7% ו-3.7% בתגובת הגלוקוז לאחר 15 דקות ו-30 דקות לאחר צריכת האורז, בהתאמה (איור 4B). חשוב לציין שרמות הגלוקוז בדמם של אנשים שצרכו אורז מוטנטי עלו לאט יותר בהשוואה לאלה שצרכו אורז X134, מה שמרמז על היישומים האפשריים של אורז RS בשליטה גליקמית (איור 4B).

איור 1: מודל של גידול אורז עמילן עמיד באמצעות טכנולוגיית עריכת גנום. מודל זה ממחיש את השלבים העיקריים: העברת הווקטור לתוך תא אגרובקטריום, זיהום של יבלת אורז על ידי אגרובקטריום, התחדשות של נצרי אורז, קציר של גרגרי אורז, וניתוח של עמילן עמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: גנוטיפ ורצף חלבוני חיזוי של מוטציות sbeIIb . סנגר רצף כרומטוגרמות של sbellb-1, sbellb-2 ו-sbellb-3. שחור מציין רצפים נורמליים של חומצות אמינו. קווים מקווקוים שחורים מציינים מוטציות בחומצות אמינו, ואדום מציין את קודון העצירה. מיקום היעד מוצג בחץ אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מאפיין אגרונומי ואיכות דגנים של מוטציית sbeIIb . (A) פנוטיפ צמחי של sbeIIb. (B) השוואות של המראה של מוטציות X134 ו-sbeIIb-1 של אורז חום. (ג-ה) קצב קביעת זרעים, דגנים לכל פאניקה ותשואה לצמח של X134 ו - sbeIIb. הנתונים הם ממוצע ± SDs; NS פירושו שאין הבדל משמעותי על פי מבחן t של התלמיד, n = 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תכולת עמילן עמיד בדגנים בוגרים וברמות גלוקוז בדם. (A) מדידות של תכולת עמילן עמיד בגרגר sbeIIb , n=3. (B) עקומת הגלוקוז בדם לאחר צריכת אורז sbeIIb . הנתונים הם ממוצע ± SDs; **, p < 0.01 לפי מבחן t של התלמיד, n=5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: וקטור של CRISPR/Cas-SF01. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: רצף חלבוני החיזוי של OsSBEIIb והמוטנטים sbeIIb . רצפי הסטת המסגרות מסומנים בצבע אדום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: ניתוח תכונות צמחיות של מוטציה sbeIIb-1. (A) פנוטיפ גדילה של מוטציה sbeIIb-1 . (B) דפוסי ספייק של מוטציית sbeIIb-1 . (C) גובה הצמח של מוטציית sbeIIb-1 . (D) אורך פאניקה של מוטנט sbeIIb-1 . הנתונים הם האמצעים ± SDs; NS פירושו שאין הבדל משמעותי; **, עמ' < 0.01 לפי מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1. רשימת פריימרים ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

בתהליך הבנייה של וקטורים מבוססי CRISPR/Cas-SF01, בחירה קפדנית של רנ"א חד-מנחה (sgRNA) היא חיונית. זה מחייב אימוץ של רצפים המציגים יעילות עריכה גבוהה עם מינימום אפקטים מחוץ למטרה. בנוסף, הסינתזה של פריימרים ממוקדים משלבת אוליגוס מתאם קצר התואם לאתרי splice של הווקטור, ומבטיח אינטגרציה חלקה. יש לציין כי בניגוד למתודולוגיות קודמות שדרשו עיכול אנזימטי רציף, טיהור ג'ל וקשירה, המחקר שלנו מייעל את התהליך על ידי שילוב חיתוך אנזימים וקשירה במערכת All-in-One. שיפור זה משפר את היעילות התפעולית ומקצר את ציר הזמן של הניסוי.

כאשר משווים את Cas-SF01 לנוקלאז Cas 9 הקנוני, מתגלים יתרונות ברורים, המדגישים את הפוטנציאל שלו בהשבחת צמחים מולקולריים. יתרונות אלה יחד מציבים את Cas-SF01 ככלי מבטיח בביוטכנולוגיה חקלאית. ראשית, גודל החלבון הקטן יותר של Cas-SF01 עשוי לשפר את יעילות העברת התאים בצמח. שנית, רצפי ה-crRNA הקצרים יותר שלו מאפשרים תכנון של אסטרטגיות מיקוד מרובות, ובכך מאפשרים שינויים גנטיים מורכבים יותר²⁸. שלישית, Cas-SF01 בדרך כלל גורם למוטציות בקנה מידה גדול בהשוואה לאינדלים טיפוסיים של 1-bp של Cas9, מה שמצביע על הפוטנציאל שלו לשינויים גנטיים משמעותיים יותר²⁹.

בתחום עריכת גנים של יבולים, מספר גורמים ממלאים תפקיד מרכזי בהבטחת תוצאות מוצלחות. ראשית, אישור רצף הגנים בזנים ערוכים הוא הכרחי כדי למנוע החדרות פוטנציאליות, מחיקות, או פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) שעלולים לעכב את זיהוי sgRNA, ובכך להשפיע על יעילות תהליך העריכה. שנית, בחירת זן האגרובקטריום המתאים לשינוי משתנה בהתאם לזן האורז איתו עובדים, ומדגישה את חשיבות בחירת הזן להשגת עריכה גנטית מוצלחת בזני אורז שונים. בנוסף, גנוטיפ של שתילים ערוכים מדור E0 הוא חיוני כדי להבטיח עקביות בסוגי מוטציות. גנוטיפ זה צריך להתבצע לאחר חודש אחד של גידול, תוך שימוש בדנ"א המופק מהעלים העליונים ביותר של כל טילר. הודות ליעילות העריכה יוצאת הדופן של Cas-SF01, ניתן להבטיח קווים ערוכים הומוזיגוטיים בדור E0, מה שמקל על בחירת חומרים נטולי T-DNA בדור E1 ולאחר מכן מזרז את תהליך הרבייה. לפני הערכת תכונות אגרונומיות, חיוני לקבוע את הפנוטיפ הערוך, שכן זה מסייע בהבנת השפעתו על תכונות אחרות ובקביעת המאפיינים הרצויים של הזן החדש.

ישנם שינויים ופתרון בעיות של הליך זה. כאשר מתמודדים עם מיני יבול שונים, הכרחי להשוות את יעילות העריכה של Cas9, Cpf1 ו- Cas-SF01 כדי לוודא את הכלי המתאים ביותר לשינויים הגנטיים המיועדים. יתר על כן, אם לא ניתן לזהות קווים ערוכים הומוזיגוטיים בדור E0, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את גודל דגימת הסינון או להציג דור נוסף של שתילה וסינון כדי לרכוש צמחים הומוזיגוטיים נטולי T-DNA.

הבחירה במקדם U6 למחקר זה התבססה על השימוש הנרחב בו ויעילותו המוכחת בעריכת גנום צמחים, כפי שמעידה העבודה האחרונה של Lv et ^al.29ביצירה יעילה של זני אורז פונקציונליים. מקדם זה אומת ביסודיות ועבר אופטימיזציה באורז, ובחרנו ללכת בדרך מבוססת זו כדי להבטיח את האמינות והשחזור של התוצאות שלנו. תוך הכרה ביתרונות הפוטנציאליים של מקדם CmYLCV, כפי שהוצע על ידי Čermák et ^al.30, אנו מכירים בכך שחקירות נוספות המשווים את הביצועים של מקדמים שונים במערכת הניסוי הספציפית שלנו יספקו תובנות חשובות.

השימוש בטכנולוגיות עריכת גנים לשינוי מדויק של אתרים גנומיים פונקציונליים בצמחים מדגיש את החשיבות של העברה וקטורית יעילה וזיהוי מוטציות גנטיות. כדי לקדם קווי צמחים ערוכים לזני יבול חדשים, הכרחי לברר את המצב ההומוזיגוטי של גן המטרה ולבחור פרטים נקיים ממקטעי T-DNA אקסוגניים. פרוטוקול זה, שפותח עבור זן אורז מועשר בעמילן עמיד במיוחד, מדגיש את הפוטנציאל של טכנולוגיית עריכת גנים בזירוז הגידול של אורז פונקציונלי.

כתב היד נועד לתרום לתחום על ידי הצגת גישה מקיפה ושיטתית ליצירת זני אורז פונקציונליים באמצעות עריכה גנטית. המחקר חורג מעבר לתיאור פשוט של יישום כלי לעריכת גנים; במקום זאת, הוא מתמקד בשילוב של היבטים מרובים, החל מבחירת גנים ואופטימיזציה של כלי עריכה ועד ניתוח תכונות פנוטיפי ואגרונומי מפורט. לסיכום, בעוד שהעבודה אולי לא מציגה טכנולוגיות או גנים חדשים לחלוטין, היא תורמת לתחום על ידי הדגמת גישה מקיפה וקפדנית ליצירת זני אורז פונקציונליים באמצעות עריכת גנים.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מימון של פרויקטים ביולוגיים עיקריים (2023ZD04074).