Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN). Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Ligases E3 e proteínas alvo de degradação podem ser induzidos a formar complexos por moléculas heterobifuncionais em um processo de várias etapas. A cinética e termodinâmica das interações envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína. Técnicas biofísicas como ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC) fornecem informações valiosas que podem ser usadas na otimização dessas interações. Usando dois sistemas modelo, um kit de ferramentas de ensaio biofísico para entender a cooperatividade da formação de complexos ternários e o impacto do 'efeito gancho' na cinética de ligação foi estabelecido. Em um caso, uma proteólise visando quimera (PROTAC) molécula que induziu a formação de complexo ternário entre Brd4^BD2 e VHL foi avaliada. A molécula heterobifuncional, MZ1, tem afinidades nM tanto para a proteína Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) quanto para o complexo VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Para esse sistema, foram desenvolvidos ensaios robustos de SPR, BLI e ITC que reproduzem resultados publicados demonstrando a cooperatividade da formação ternária de complexos. No outro caso, foi estudada uma molécula que induziu complexos ternários entre uma proteína de 46,0 kDa, PPM1D, e o cereblon [CRBN (319-442)]. A molécula heterobifuncional, BRD-5110, tem um SPR K D = 1 nM para PPM1D, mas uma ligação muito mais fraca contra o complexo CRBN truncado (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). Nesse caso, a vinculação para CRBN em SPR não foi saturável, resultando em um "efeito gancho". Os requisitos de rendimento e reagente para SPR, BLI e ITC foram avaliados, e recomendações gerais para sua aplicação em projetos PROTAC foram fornecidas.

A poliubiquitinação de proteínas na célula é um processo fortemente regulado que envolve enzimas da família Ubiquitina Ligase ^1,2. As enzimas terminais na via são as ligases de ubiquitina E3 que ligam covalentemente moléculas de ubiquitina aos seus parceiros de ligação às proteínas³. A poliubiquitinação desses parceiros ligantes de proteínas os direciona para degradação proteolítica pelo proteassoma⁴. Esse sistema faz parte do processo de homeostase proteica que tem sido aproveitado terapeuticamente para induzir a degradação de proteínas envolvidas na doença⁵. Pequenas moléculas que induzem a interação entre as ligases de ubiquitina E3, como a ligase E3 de Von Hippel-Lindau (BVS) ou o cereblon (CRBN), são tipicamente compostas por uma ogiva de ligação à ligase E3 conectada por um ligante flexível a uma ogiva que se liga à proteína alvo de degradação. Essas moléculas heterobifuncionais são comumente referidas como proteólise visando quimeras ou PROTACS⁶.

O desenvolvimento do PROTACS envolve a avaliação da capacidade das moléculas de induzir a degradação de proteínas nas células. Muitos sistemas de ensaios celulares foram desenvolvidos para monitorar a interação induzida entre a proteína-alvo e os componentes da ligase E3, como VHL ou CRBN, após o tratamento das células com uma molécula de PROTAC. Um desses ensaios celulares, o sistema nanoluc-Halotag⁷, envolve uma ligase E3 fundida ao aceitador Halotag e uma proteína-alvo marcada com um doador nanoluc. A formação do complexo ternário aproxima o doador nanoluc e o aceitador Halotag, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor, resultando na emissão de luz. Variações desse sistema podem ser usadas para avaliar a permeabilidade celular de moléculas de PROTACS⁸ ou mudanças no nível relativo de ubiquitinação de proteínas-alvo⁹. Enquanto esses sistemas celulares são essenciais para impulsionar a otimização do PROTACS, a formação de complexos entre os ligases E3 e as proteínas alvo de degradação é um processo de várias etapas^10,11. A cinética e termodinâmica das interações binárias e ternárias envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína^12,13,14.

São descritos protocolos que podem ser adaptados para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTACS utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os protocolos SPR e ITC para a molécula MZ1 PROTAC que induz a formação de complexos ternários entre Brd4^BD2 e BVS, derivados de relatos da literatura^13,15 e aqui descritos, foram capazes de recapitular os resultados relatados com algumas modificações dos procedimentos relatados^, que serão discutidos. Uma descrição de um ensaio de BLI usado para avaliar a formação de complexos ternários entre MZI, Brd4^BD2 e BVS está incluída neste relatório. As medidas de afinidade do IPC foram consistentes com as observadas na RP e na CIT. Um protocolo publicado anteriormente no qual um ensaio de SPR foi desenvolvido para avaliar a formação de complexo ternário induzido por PROTAC entre PPM1D, uma proteína fosfatase Ser/Thr cuja expressão é induzida de forma p53-dependente¹⁶, e CRBN também é descrito. Neste caso, a molécula PROTAC tem uma afinidade nanomolar para PPM1D, mas apenas uma afinidade micromolar para CRBN. Neste caso, a ligação da molécula de PROTAC ao CRBN não é saturável, resultando no comumente observado "efeito gancho". O efeito gancho é uma propriedade de três sistemas corporais em que existem duas espécies que podem formar um complexo heterotrimérico quando ambas estão ligadas a uma molécula em ponte (Figura 1)¹⁷. O efeito gancho é observado quando a espécie em ponte está em concentração excessiva em relação às outras duas espécies. O estado resultante é aquele em que as interações binárias superam as interações ternárias. Os sistemas onde o efeito gancho é observado requerem considerações específicas de planejamento experimental discutidas neste relatório. Conceitos gerais e requisitos de reagentes para avaliar a utilização de ensaios biofísicos para a avaliação da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTAC são fornecidos.

Todas as proteínas foram superexpressas em E.coli com bom rendimento e pureza (>80%), seguindo os protocolos da^literatura18. A biotinilação foi realizada utilizando-se reação catalisada por BirA¹⁸. Todas as moléculas pequenas foram preparadas em soluções estoque de 1 mM em DMSO 100%. Os procedimentos aqui descritos não requerem equipamentos ou precauções laboratoriais especializadas de segurança. Equipamentos de proteção individual (EPIs) padrão de laboratório devem ser usados (por exemplo, jaleco, óculos de segurança e luvas).

As proteínas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo:
BVS: complexo biotinilado BVS(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) com Avi-tag no terminal C de ElonginB.
Brd4^BD2: Não marcado Brd4^BD2(333-460)
CRBN: CRBN biotinilado (319-442) com Avi-tag no terminal N
PPM1D: PPM1D(1-420) não marcado ou duplo His8-tagged no terminal N

Pequenas moléculas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC que se liga à BVS e Brd4^BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K_D ~3 μM, não se liga ao PPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D K_D = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): não se liga ao CRBN, PPM1D K_D = 1-2 nM

1. Método 1: ITC (calorimetria de titulação isotérmica)

OBS: As titulações são realizadas utilizando-se um microcalorímetro com auto-injeção.

1. Preparação tampão: Preparar 3 L de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
2. Diálise: Dialyze BVS e Brd4^BD2 (~ 500 μL a 150 μM cada) contra 1 L do tampão preparado na etapa 1.1, 3 vezes a 4 °C, por 4 h, 2 h e aproximadamente 16 h, respectivamente. Salve o buffer após a última diálise para uso nas etapas subsequentes.
3. Prepare amostras em uma placa de 96 poços com uma tampa plástica.
   1. Para cada titulação, preparar 400 μL de solução para a célula, 125 μL para a seringa e 400 μL de tampão para limpeza. Adicione amostras a três poços consecutivos na placa. Uma vez que o estoque composto é preparado a 1 mM em 100% DMSO, adicione a mesma porcentagem de DMSO às soluções proteicas para garantir o tampão correspondente na célula e na seringa. Adicionar 2% de DMSO às soluções finais.
      1. Amostra para titulação de BVS em MZ1: Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 4 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 10 μM) e 4 μL de DMSO a 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, 2,5 μL de DMSO 100% (concentração final de 84 μM).
      2. Amostras para titulação da BVS no tampão (os dados serão utilizados para subtração de fundo dos dados gerados a partir da amostra 1.3.1.1): Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 8 μL de 100% de DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, (concentração final de 84 μM) e adicionar 2,5 μL de DMSO a 100%.
      3. Amostras para titulação de BVS em MZ1 e Brd4 BD2: Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4^BD2 (concentração final de 16,8 μM), 3,36 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 8,4 μM) e 4,64 μL de DMSO 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.
      4. Amostras para titulação de BVS em Brd4 BD2 (fundo de 1.3.1.3): Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4^BD2 (concentração final de 16,8 μM) e 8 μL de 100% DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.
4. Execute as quatro titulações no microcalorímetro. Cada uma consiste em 19 injeções de solução de seringa de 2 μL a uma taxa de 2 μL/s em intervalos de tempo de 120 s. Fazer uma injeção inicial de proteína (0,4 μL) e descartá-la durante a análise dos dados. Realizar todos os experimentos a 25 °C, agitando a 600 rpm.
5. Análise dos dados: Ajustar os dados a um modelo de sítio de ligação única para obter a estequiometria (n), a constante de dissociação (K_D) e a entalpia de ligação (ΔH) usando o software de análise fornecido pelo fabricante (Figura 2).

2. Método 2: BLI (interferometria da biocamada)

1. Realizar experimentos de BLI usando sensores revestidos com estreptavidina (SA) à temperatura ambiente (TR) com uma taxa de aquisição de 5 Hz. Durante o experimento automatizado BLI, certifique-se de que os sensores estejam estacionários dentro de uma única coluna e se movam entre diferentes colunas de uma placa preta de fundo plano de 96 poços com um volume máximo de poço de 392 μL. Encher cada poço da placa usada no experimento com 200 μL de solução.
   NOTA: BLI só é útil para detectar interações proteína-proteína (ou seja, formação de complexo ternário). Não é sensível o suficiente para detectar interações entre proteínas e pequenas moléculas.
   1. Preparação tampão: Preparar 100 mL de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
   2. Otimização para a etapa de imobilização: Carregar o sensor de teste para 1-3 nm, conforme recomendado pelo fabricante. Um carregamento de ~1,0 nm é usado para os procedimentos descritos aqui. Para isso, mergulhe o sensor em uma solução contendo BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.
   3. Realizar medições cinéticas BLI aplicando sete sensores SA usando a seguinte sequência:
      1. Para a primeira fase basal, mergulhe em buffer por 60 s.
      2. Para a fase de imobilização, mergulhar em uma solução de BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.
      3. Para a segunda fase basal, mergulhe em tampão por 60 s.
      4. Para a fase de associação, mergulhar em solução de uma concentração fixa de Brd4^BD2 a 2 μM, concentração fixa de DMSO a 2% e concentrações variáveis de MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM e 0 nM (sensor de referência) por 300 s.
      5. Para a fase de dissociação, mergulhe em tampão por 600 s.
   4. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante. k _on, k_off e K_D são relatados para ajuste dos dados (Figura 3).

3. Método 3: SPR (ressonância plasmônica de superfície)

NOTA: Todos os experimentos de SPR são realizados usando chips de sensor revestidos com estreptavidina (SA) no RT. Embora o chip NTA seja usado para a detecção entre proteína e pequenas moléculas, ele deve ser usado com cautela quando aplicado ao complexo ternário, pois um fundo muito mais alto do que o chip SA é observado, possivelmente devido a interações eletrostáticas entre a superfície do chip carregado e a proteína no analito.

1. SPR para interação BVS-MZ1
   1. Preparação do tampão.
      1. Prepare um tampão de 1 L contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7,5 e passe por uma unidade de filtro de 0,2 μm.
      2. Retirar 20 ml de tampão para utilização futura (tampão sem DMSO) e encher novamente com 20 ml de DMSO (DMSO a 2% no tampão de execução final). Manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.1 e 3.2)
   2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS a ~2000 RU (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Prepare MZ1 em uma diluição seriada de 3 vezes e 8 pontos com a concentração superior a 10 μM em uma placa de polipropileno translúcida de fundo cônico de 384 poços com um volume máximo de 130 μL. Cubra a placa com folhas plásticas transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de polipropileno.
      1. Prepare a concentração máxima com o tampão livre de DMSO para garantir o DMSO a 2% na concentração final. Para 147 μL de tampão livre de DMSO, adicionar 1,5 μL de estoque de MZ1 a 1 mM e 1,5 μL de DMSO 100%.
      2. Prepare a diluição em série de 3 vezes com o tampão de corrida contendo DMSO a 2%. A 100 μL do tampão de corrida, adicionar 50 μL de solução na concentração máxima preparada no passo 3.1.3.1 e misturar bem para preparar a^2.ª concentração mais elevada.
      3. Em seguida, transfira 50 μL da solução preparada na etapa 3.1.3.2 para os próximos 100 μL de tampão de corrida, misture bem para preparar a^3ª maior concentração e assim por diante.
   4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 120 s; tempo de dissociação: 300 s; vazão: 50 μL/min.
   5. Realizar a análise dos dados utilizando o software de avaliação fornecido pelo fabricante do instrumento. A análise de estado estacionário indicou K_D = 26 (± 3) nM e Rmax de ~91% (± 5%) de ligação alcançada (Figura 4A)
2. SPR para BVS: MZ1: Complexo ternário Brd4^BD2
   1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.1.1.
   2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS para ~100 RU. Injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL VHL a uma taxa de fluxo de 5 μL/min e tempo de contato entre 1-5 min até atingir uma densidade de superfície de ~100 RU.
   3. Preparar amostras para duas injecções de ciclo único de 5 vezes e 5 pontos numa placa de fundo redondo de poliestireno transparente de 96 poços com um volume máximo de 323 μL e cobri-la com folhas de plástico transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de poliestireno, conforme descrito nos passos 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Controlo negativo: a substância a analisar contém apenas Brd4^BD2 .
         1. Preparar concentração máxima a 25 μM em tampão de corrida com um volume de 200 μL (#A5)
         2. Adicionar 160 μL cada de Brd4^BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#A1-A4)
         3. Transferir 40 μL de A5 para A4. Misture bem.
         4. Transferir 40 μL de A4 para A3. Misture bem. Continue fazendo isso até A1.
      2. Formação do complexo ternário: o analito contém MZ1 e Brd4^BD2.
         1. Preparar a concentração máxima adicionando 4 μL de MZ1 a 20 μM em solução de DMSO a 100% para 196 μL contendo 25,5 μM Brd4^BD2 em tampão livre de DMSO (#B5). As concentrações finais são 25 μM Brd4^BD2, 100 nM MZ1 e 2% DMSO.
         2. Adicionar 160 μL cada de Brd4^BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#B1-B4)
         3. Transferir 40 μL de B5 para B4. Misture bem.
         4. Transferir 40 μL de B4 para B3. Misture bem. Continue fazendo isso até B1.
   4. Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Tempo de contato: 100 s; tempo de dissociação: 720 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada amostra para garantir um fundo estável.
   5. Análise dos dados: Aplicar a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, quando MZ1 não está presente, a resposta SPR entre BVS e Brd4^BD2 é desprezível. Quando MZ1 está presente, o ajuste cinético indica que a interação entre BVS e o complexo^BD2 MZ1-Brd4 tem k _on = 7,9 (± 1,5) *10⁷ /M/s, k_off = 0,014 ^s-1 e K_D = 1 nM. (Figura 4B)
3. SPR para interações CRBN e pequenas moléculas
   1. Preparação do tampão.
      1. Prepare um tampão de 1 L contendo 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, e passe por uma unidade de filtro de_0,2 μm.
      2. Retirar 20 ml de tampão e reabastecer 20 ml de DMSO a 100% (DMSO a 2% no tampão de execução final). É importante manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.3, 3.4 e 3.5).
   2. Ative o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilize o CRBN para ~800 RU.
   3. Preparar compostos em diluição em série de 3 vezes e 6 pt numa placa de 384 poços com uma concentração máxima de 30 μM, conforme descrito no ponto 3.1.3.
   4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho, tempo de contato: 60 s, tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min. Para este sistema, três injeções de buffer são suficientes para obter um fundo estável. Para outros sistemas de ensaio, pode ser necessário realizar injeções de tampão adicionais.
   5. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante.
      NOTA: A análise de estado estacionário indica que K_D de BRD-2512 e BRD-5110 estão ambos em torno de 3 μM. No entanto, a ligação só atingiu ~ 70% R_max ligação na concentração superior. Tanto a fraca afinidade quanto a forma do sensorgrama indicam que a insolubilidade do composto em altas concentrações é provável de acontecer. Assim, a K_D real pode ser maior que 3 μM. O BRD-4761, que não se liga ao CRBN, foi incluído como controle negativo.
4. SPR para interações PPM1D e pequenas moléculas
   1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1. Use um chip sensor de ácido nitriloacético (NTA).
   2. Aplique um único ciclo porque a ogiva PPM1D tem um k _ligado e k_desligado lento. Gere novamente o chip NTA usando a configuração padrão do fabricante e imobilize PPM1D para ~ 1000 RU após cada injeção de composto (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparar os compostos em diluição em série de 3 vezes e 5 pontos com a concentração máxima a 400 nm, conforme descrito no ponto 3.1.3.
   4. Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Modo: alto desempenho; tempo de contato: 90 s; tempo de dissociação: 600 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada composto para garantir um fundo estável.
   5. Análise de dados. Aplique a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, o BRD-2512 não apresenta ligação ao PPM1D. Para BRD-4761 e BRD-5110, o ajuste cinético indicou que o KD para ambos era de 1-2 nM.
5. SPR para CRBN:PROTAC: complexo ternário PPM1D
   1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1.
   2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar CRBN para ~35 RU (injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparar três compostos em diluição seriada de 3 vezes e 6 pontos com uma concentração máxima de 30 μM, mantendo [PPM1D] a 1 μM em todas as amostras, incluindo os espaços em branco, utilizando o método descrito no passo 3.2.3.
   4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 60 s; tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min.
   5. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante.
      NOTA: Enquanto o BRD-2512 e o BRD-4761 mostram resposta não/desprezível, o BRD-5110 mostra claramente o "efeito gancho" no estado estacionário com cinética liga/desliga rápida (Figura 5A-C). A resposta de ligação experimental do BRD-5110 (Figura 5C) está entre a resposta prevista da simulação ao assumir que K D (CRBN, cpd) é de 3 ou 10 μM (Figura 5E), sugerindo que o ternário K D e o binário K _D são muito semelhantes. Não há cooperatividade aparente do PPM1D: BRD-5110: formação do complexo CRBN.

A caracterização da BVS: complexo binário MZ1 e BVS: MZ1: complexo ternário^{Brd4 BD2} pode ser encontrada na Figura 2 (ITC), Figura 3 (BLI) e Figura 4 (SPR) usando um buffer muito semelhante. O K_D extraído dos ensaios ortogonais é consistente. A cooperatividade pode ser calculada por K D (binário) / K_D (ternário), o que é altamente positivo (15 do ITC ou 26 do SPR).

A caracterização do sistema CRBN:PROTAC: PPM1D foi realizada por SPR (Figura 5A-D). O CRBN foi imobilizado a ~35 RU's para facilitar a observação da formação do complexo ternário. A ligação do PROTAC sozinha resultou em um sinal de <2 RU's que está abaixo do ruído. PPM1D no analito dá um alto sinal de fundo na superfície do chip SA, e a maior concentração que pode ser aplicada é de cerca de 1 μM. Este valor é menor que o K_D entre CRBN e sua ogiva ≥3 μM), portanto, o "efeito gancho" é esperado. A RPS é sensível o suficiente para detectá-la, o que tem boa concordância com a simulação (Figura 5E). A simulação foi feita utilizando os equilíbrios não cooperativos da literatura¹⁹ combinados com o cálculo clássico da RPS [Response_max = (Response Ligand × Mass_{Immobilization})/_{Mass Ligand}]. Como a K_D entre CRBN e composto não é determinada com precisão devido à insolubilidade do composto em alta concentração, a simulação foi feita usando quatro KD's assumptivos: 1 μM, 3 μM, 10 μM ou 30 μM. Os resultados experimentais situaram-se entre as curvas simuladas de 3 μM e 10 μM, que é quase idêntica à K_D no sistema binário, sugerindo que não há cooperatividade.

Figura 1: Ilustração de três cenários de vinculação e definição de diferentes K_D's. (A) Sistemas clássicos de dois componentes. (B) Sistema de três componentes em que uma extremidade do PROTAC pode ser saturada, portanto, pode ser avaliado como um sistema de dois componentes. (C) Sistema tricomponente em que se observa o "efeito gancho". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados da TIC. Titulação da BVS em MZ1 (esquerda) ou complexo MZ1:Brd4^BD2 (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados do IPV. MZ1 medeia a formação da BVS: MZ1: Brd4^BD2 complexo ternário. (A) Dados brutos. (B) Subtração de sinais de fundo onde [MZ1] = 0. (C) Encaixe cinético de B para extrair k _on, k_off e K_D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados da RPS . (A) Ligação do MZ1 à BVS. (B) Ligação do complexo binário MZ1:Brd4^BD2 à BVS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados da SPR mostrando o "efeito gancho" de um PPM1D-PROTAC representativo. CRBN foi imobilizado na superfície do chip SA enquanto [PPM1D] foi mantido em 1 μM no analito para todos os casos. (A) O BRD-2512, composto que só se liga ao CRBN, quase não dá resposta. (B) O BRD-4761, composto que só se liga ao PPM1D, também não dá resposta. (C,D) BRD-5110, um PROTAC com a ogiva de CRBN em BRD-2512 e a ogiva de PPM1D em BRD-4761, induziu a formação do complexo ternário. (E) Uma simulação dos resultados da RPS assumindo que o K_D entre CRBN e composto é de 1 μM (preto), 3 μM (azul), 10 μM (vermelho) ou 30 μM (verde). A curva BRD-2512 está entre 3 μM e 10 μM, muito próxima da binária K_D medida, sugerindo ausência de cooperatividade (cooperatividade = 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A caracterização biofísica das interações binárias e ternárias entre moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode fornecer informações únicas e complementares relativas a sistemas celulares amplamente utilizados. Compreender a afinidade entre cada ogiva de uma molécula PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode ajudar a orientar os esforços de química medicinal para a otimização dessas interações. Estruturas cristalinas de complexos ternários PROTAC previamente publicadas revelaram que átomos na região do ligante podem formar interações com um ou ambos os parceiros de ligação às proteínas^16,20. A determinação experimental da cooperatividade da formação ternária de complexos pode apoiar a otimização de ligantes.

Descreve-se neste relato a utilização de três diferentes técnicas biofísicas que podem fornecer informações sobre as afinidades de ligação entre as moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação às proteínas. O método 1 detalha o arranjo experimental da calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para a molécula PROTAC, MZ1, o complexo ligase VHL E3 e o bromodomínio Brd4^BD2. Os resultados do ITC mostraram K_D's de 59 nM para a interação binária entre MZ1 e BVS e 4 nM para a interação ternária entre BVS e pré-misturas MZ1 e Brd4^BD2. As afinidades foram consistentes com as observadas em SPR (ligação da BVS imobilizada a MZ1 K_D = 26 nM, ligação da BVS imobilizada a MZ1 e Brd4^BD2 K D=1 nM) e BLI (K_D= 2,8 nM). Enquanto os resultados do ITC K_D para a ligação da BVS à MZ1 são consistentes com os valores relatados¹⁶, a estequiometria obtida é diferente. Uma possível explicação para esse resultado é a baixa solubilidade de MZ1 no tampão baseado em HEPES utilizado no protocolo aqui descrito, enquanto os resultados da literatura foram gerados usando um tampão à base de Bis-tris. Os autores preferiram usar os mesmos componentes de buffer em SPR, ITC e BLI.

O método 2 descreve o arranjo experimental para a análise de BLI da interação de BVS imobilizada, uma concentração fixa de Brd4^BD2 e concentrações variáveis de MZ1. Devido às limitações de sensibilidade da técnica, valores de K_{D, k on} e k_off para a formação de complexos ternários poderiam ser gerados, mas não para a interação binária entre MZ1 e as proteínas.

O método 3 descreve vários ensaios de RPS. A RPS é mais sensível que a BLI e pode ser aplicada para observar as interações proteína-molécula pequena (binária) e proteína-proteína (ternária). Neste último caso, os sinais de fundo devem ser cuidadosamente monitorizados, uma vez que a proteína contida na substância a analisar pode dar sinais elevados e instáveis. A RPS é muito sensível a reagentes com alto índice de refração, incluindo DMSO, glicerol e detergentes. Se a proteína for armazenada no tampão que contém glicerol ou detergente, o tampão de corrida deve conter concentrações correspondentes desses componentes. Alternativamente, a aplicação de cromatografia de exclusão de tamanho os remove completamente antes de qualquer experimento de SPR. Deve-se tomar cuidado para combinar as concentrações de DMSO entre as amostras de tampão e analito. As correções do solvente DMSO são realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

O método na etapa 3.1 descreve o ensaio SPR para a interação binária BVS-MZ1. O método 3.2 descreve o ensaio SPR para a BVS: MZ1: complexo ternário Brd4 BD2 onde a BVS é imobilizada, e o analito é Brd4 BD2 sozinho ou o complexo MZ1:Brd4^BD2. Nesse sistema, a interação entre Brd4^BD2 e BVS é desprezível. A formação do complexo ternário é altamente cooperativa (ɑ = 26). A taxa de off-rate para a formação de complexos ternários é de 0,014 ^s-1, o que requer o uso de cinética de ciclo único. Os resultados do ITC também mostram uma formação de complexo ternário altamente cooperativa (ɑ=15). Os métodos de SPR nas etapas 3.3, 3.4 e 3.5 descrevem ensaios para avaliar a formação de um complexo entre CRBN e PPM1D induzido pela presença de uma molécula de PROTAC, BRD-5110. A molécula PROTAC tem uma fraca afinidade por CRBN (K D ~3 μM) e uma forte afinidade por PPM1D (K_D = 1-2 nM). Como resultado, a fraca ligação ao CRBN não está saturada e resulta em um "efeito gancho" observado. Embora seja possível aumentar a solubilidade do ligante aumentando a concentração de DMSO usada no experimento, é importante, nesses casos, monitorar cuidadosamente a estabilidade da proteína, que pode ser negativamente impactada por altas concentrações de DMSO. Além disso, o DMSO tem um alto calor de dissolução que pode obscurecer o calor de ligação dos ligantes à proteína. Deve-se tomar cuidado para combinar as concentrações de DMSO da solução na seringa e da solução na célula. Os autores recomendam diálise das duas soluções contra a mesma preparação tampão.

Recomendações e orientações gerais são fornecidas com base nos experimentos realizados e relatados aqui. Quando as afinidades de interações binárias entre moléculas PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas são fortes (K_D <1 μM), SPR fornece afinidades confiáveis e reprodutíveis, juntamente com informações valiosas sobre a cooperatividade da formação ternária de complexos. Quando as afinidades da interação binária entre um dos parceiros de ligação à proteína e a molécula PROTAC são fracas (K_D >1 μM), a configuração do ensaio precisará ser modificada. Nesses casos, o uso de simulações moleculares onde as constantes de ligação são fixas, e as concentrações do ligante e do analito são variadas, pode ser valioso para orientar o planejamento do ensaio e interpretar os resultados experimentais. Os ensaios ITC fornecem informações importantes sobre a estequiometria de ligação, mas requerem significativamente mais reagentes proteicos e compostos em relação a SPR e BLI. Além disso, a solubilidade da molécula de PROTAC pode ser limitante para experimentos de ITC. O BLI tem maior rendimento do que o ITC e requer menos proteínas e reagentes compostos. No entanto, devido a limitações de sensibilidade, o BLI só pode ser usado para avaliar a formação de complexos ternários e não interações binárias entre moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas. Recomenda-se que a RPS seja usada para testes de rotina de ensaios binários e ternários de ligação ao PROTAC e ensaios de BLI e ITC usados para validação ortogonal dos resultados da RPS.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado por um prêmio de Inovação e Desenvolvimento de Tecnologia do Centro para o Desenvolvimento de Terapêuticas do Broad Institute of MIT e Harvard. Os autores agradecem aos membros da equipe de liderança sênior e ao comitê de revisão pelo apoio a este trabalho.