Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Interacções ligando-receptor de membrana medeiam muitas funções celulares. Encadernação cinética e sinalização a jusante desencadeada por essas interações moleculares são provavelmente afectado pelo ambiente em que a ligação mecânica e sinalização ocorrem. Um estudo recente demonstrou que a força mecânica pode regular o reconhecimento do antigénio pelo desencadeamento e do receptor de células T (TCR). Isso foi possível graças a uma nova tecnologia que nós desenvolvemos e fluorescência denominadas sonda vigor biomembrana (fBFP), que combina força espectroscopia única molécula com microscopia de fluorescência. Usando um glóbulo vermelho humano ultra-suave como o sensor de força sensível, uma câmera de alta velocidade e em tempo real técnicas de rastreamento de imagens, o fBFP é de ~ 1 pN (10 -12 N), a 3 nm e ~ 0,5 ms em vigor, a resolução espacial e temporal. Com o fBFP, pode-se medir com precisão cinética de ligação ligando-receptor individuais no âmbito da regulamentação vigente e cal intracelular simultaneamente imagem ligação desencadeadaCium sinalização sobre uma única célula viva. Esta nova tecnologia pode ser utilizada para estudar a interacção receptor-ligando outra membrana e sinalização em outras células sob regulação mecânica.
Célula-a-célula e célula-matriz extracelular de (ECM) adesão é mediada pela ligação entre os receptores da superfície celular, proteínas de ECM, e / ou lípidos 1. A ligação permite que as células de modo a formar uma estrutura funcional, bem como reconhecer, comunicar, e reagir ao ambiente 1-3. Ao contrário de proteínas solúveis (por exemplo, citoquinas e factores de crescimento) que se ligam de uma imagem tridimensional (3D) de fase fluida para os receptores da superfície celular, os receptores de adesão de células formar ligações com os seus ligandos através de uma das junções de hiato estreita para unir duas superfícies opostas que limitam molecular difusão numa dimensional (2D) de interface dois 4-7. Em contraste com a cinética de 3D que são vulgarmente medidos por ensaios de ligação tradicionais (por exemplo, de ressonância de plasmon de superfície ou SPR), a cinética 2D têm de ser quantificado com técnicas especializadas, tais como microscopia de força atómica (AFM), 8-10, câmara de fluxo 11,12, micropipeta 13,14, ópticopinças 15 e sonda vigor biomembrana (BFP) 16-21.
Mais do que simplesmente fornecendo ligação física para a coesão celular, moléculas de adesão são um dos principais componentes da maquinaria de sinalização para a célula comunique com o espaço envolvente. Tem havido um interesse crescente na compreensão de como ligando acoplamento de moléculas de adesão inicia a sinalização intracelular e como o sinal inicial é transduzida no interior da célula. Intuitivamente, propriedades de receptor-ligando de ligação pode ter um impacto que induz os sinais. No entanto, é difícil para dissecar as relações mecanicistas entre a interação extracelular e eventos de sinalização intracelular utilizando conjunto tradicional de ensaios bioquímicos por causa de suas muitas limitações, por exemplo, uma resolução temporal pobres e completa falta de resolução espacial. Métodos que permitem tanto biofísico (cinética de ligação ao receptor do ligando 2D) e (sinalização) observações bioquímicas em directo existentecélulas incluem substratos de rigidez ajustável 22, elastômero pilar matrizes 23 e dispositivos de câmara de fluxo / microfluídicos incorporados com capacidade de fluorescência 24-26. No entanto, as leituras de sinalização e de ligação ao receptor do ligando tem que ser obtido separadamente (na maioria das vezes através de métodos diferentes), o que torna difícil para dissecar as relações temporais e espaciais das características de títulos com eventos de sinalização.
BFP convencional é uma espectroscopia de força ultra-sensível de alta resolução espaço-temporal 17. Ele usa uma célula de sangue vermelho flexível (RBC) na forma de um sensor de força, permitindo a medição da cinética de 2D única molécula, propriedades mecânicas e alterações conformacionais 14,16,19-21,27-29. A BFP baseado imagens fluorescentes (fBFP) correlaciona-se a cinética de ligação ligando-receptor com a sinalização celular desencadeada obrigatório-a escala única molécula. Com esta configuração, em atividades de sinalização celular situ no contexto de mechani superfíciecal estimulação foi observada em células T-27. O fBFP é versátil e pode ser utilizado para estudos de adesão celular e de sinalização mediadas por outras moléculas em outras células.
Este protocolo segue as diretrizes da e foi aprovado pelo comitê de ética de pesquisa em humanos de Georgia Institute of Technology.
1. hemácias Humano Isolamento, Biotinilação e Ajuste osmolaridade
Nota: Passo 1.1 deve ser realizada por um profissional médico, como uma enfermeira treinada, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado.
2. Glass Bead Silanização
3. Bead funcionalização
4. Preparação celular
Nota: Para a purificação das células, seguir os protocolos de purificação de células normais correspondentes ao tipo de células, em utilização, por exemplo T-27 ou células de determinadas linhagens de células 21,29.
5. Preparação para Micropipetas e uma câmara de celular
6. BFP experimento
Figura 1: montagem fBFP (A) Uma imagem de visão geral do sistema de hardware fBFP.. (B) Um desenho esquemático do sistema de hardware fBFP. (C) O sistema dual-cam "DC2" (laranja) na qual a câmera de alta velocidade (azul) e uma câmera de fluorescência (branco) foram montados. (D) O estágio do microscópio que se adapta uma câmara de experiência e três sistemas de manipulação de micropipeta. Micrografias de configuração BFP em uma câmara experimental (E e F). (E) Micropipetas montagem mostrando a pipeta sonda (à esquerda), pipeta alvo (canto superior direito) e ajudante pipeta (inferior rireita). Talões (F) Probe. Uma gota sonda foi manipulado por uma pipeta ajudante e anexado a um ápice RBC para formar uma sonda de força. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Regime de PBF e o seu ciclo de teste (A) Vídeo-micrografia que descreve uma sonda de força (esquerda) e um T para a célula alvo (direita) aspirada pela respectiva sonda força estacionária pipettes.The consiste de um RBC inchado e um ligado grânulo de rolamento ligando. O receptor-bearingDe células T (alvo) está montado a uma piezotranslator alinhado oposto ao da sonda. O ROI é indicada em verde. O rastreador de borda é indicado em uma linha azul. A inserção mostra o ligando (pMHC, lado talão) e receptor (TCR, lado a célula T) par, nas duas faces opostas na área marcada em cor de laranja. (B) O perfil de intensidade do bordo do grânulo em (A). A região ROI no x -Direção é plotado como eixo x (em número de pixels) ea intensidade da luz (no valor de escala de cinza) em média por binning 30 pixels ao longo do y -Direção. (C) A deformação dos RBC e a posição do grânulo e o alvo (células T) num ciclo de teste de ensaio de força da braçadeira. As linhas tracejadas verticais e horizontais indicam a posição-zero da força do ápice de RBC e a evolução no tempo, respectivamente. O rastreador borda linha da deformação RBC é mostrado em azul em cada painel. Os passos mesmos ainda menos são adoptadas de freqüência de adesãoensaio (a que falta os passos de "grampo" e "dissociar") e o ensaio de flutuação térmica (que não possui o passo de "dissociar").
7. Fluorescência BFP (fBFP) experimento
Análise 8. Dados
A técnica BFP foi iniciada pelo laboratório Evans em 1995 17. Esta ferramenta picoforce tem sido extensivamente utilizado para medir as interacções de proteínas imobilizadas em superfícies, de modo a analisar a cinética bidimensionais de moléculas de adesão que interage com os seus ligandos 16,19,20, 30, para medir a elasticidade molecular 21,29, e para determinar conformacional proteína muda 21. Para uma fBFP, um conjunto adicional de dispositivos relacionados-epi-fluorescência com o sistema de software correspondente (Tabela 1) é adicionado (Figura 1A - C).
O sistema fBFP consiste de um sistema de hardware (componentes ópticos, eléctricos e mecânicos) e um sistema de software (Tabela 1 e Figura 1A, B). Um microscópio invertido (Figura 1A, no meio) com os componentes ópticos que permitem de campo brilhante e microscopia de epi-fluorescência constitui o corpo principal doo sistema fBFP, no qual a fase de experiência e manipuladores de pipetas são montados. Um controlador da fonte de luz de fluorescência (Figura 1A, canto superior esquerdo) é usada para fornecer as luzes de excitação alternando. Um sistema dual-cam "DC2" divide a luz em dois e os transmite para uma câmera de alta velocidade (azul) e uma câmera de fluorescência (branco) (Figura 1A, canto inferior esquerdo). O primeiro recolhe a imagem sonda para determinação de posição, e este último recolhe imagens de fluorescência emitida a partir da célula alvo a dois comprimentos de onda. O experimento é monitorado e controlado por dois computadores dos quais Anfitrião PC 1 (Figura 1A, canto superior direito, colhido na imagem devido à limitação de espaço) é conectado à câmera de alta velocidade ea câmera de fluorescência e é responsável pela execução experimento e aquisição de dados, e do PC host 2 é conectado à câmera de monitoramento e responsável por apresentar uma visão completa da experi BFPvo (Figura 1A, B).
Durante um experimento, o experimentalista usa três micropipetas para agarrar e manipular as células e microesferas respectivamente (Figura 1E, F). Uma imagem de uma experiência típica BFP consiste de uma sonda de força, a qual é montada por fixação de um grânulo sonda para o ápice de um RBC aspirado, e uma célula alvo / talão (Figura 2A). Uma região de interesse (ROI), que contém a área da borda do rebordo formado no vértice de RBC, é controlado por uma câmara rápida velocidade (2000 fps) para monitorizar a deformação do RBC em tempo real. A deslocação controlada do talão, em seguida, pode ser usado para calcular a força externa exercida sobre a sonda de força (ver a nota no protocolo secção 6.6), dado a constante de mola do PBF (Figura 2A, B).
Ensaio de adesão de freqüência, teste de flutuação térmica, e ensaio de força de fechamento são os três modos experimentais comumente utilizados em um sistema de BFP. Por anúnciooptando qualquer um destes três modos, um experimento BFP é composto por ciclos repetidos de teste que são executadas sequencialmente.
No ensaio de adesão de frequência, o alvo se aproxima e contacta com o rebordo sonda num determinado tempo de contacto (por exemplo, 1 segundo) e retrai-se directamente para trás para a posição inicial e começar o próximo ciclo. Um evento de aderência é reflectido por um sinal de força de tracção, durante a fase de retracção. Este ciclo de abordagem para contato com retração é repetido 50 vezes durante pelo menos 3 pares de sonda alvo para calcular uma média de freqüência SEM adesão, um P.
Ensaio de flutuação térmica é usada para medições de vida sub-força zero. Em cada ciclo, depois de tocar o grânulo sonda, o alvo é retraído para a posição de força zero e fixada em contacto com o talão sem compressão ou tensão durante 20 segundos, e, em seguida, retorna para a posição inicial para começar o próximo ciclo. Associação Bond / dissociação sob força de zero émanifesta-se como uma gota / aumento repentino nos flutuações térmicas do talão 16,30.
Ensaio braçadeira força é usada para medições de vida sob forças. Uma força de aperto desejada (por exemplo, 20 pN) é definida antes da experiência. O alvo é conduzido várias vezes em contactar o talão de sonda para um dado tempo de contacto (por exemplo, 1 segundo) para permitir a formação de uma ligação receptor / ligando (Figura 2C, os painéis 2 e 3) e, em seguida, retrai (Figura 2C, painel 4 ). Se nenhuma ligação é formada, que se reflecte por nenhum sinal de força de tracção no RBC, ou se as rupturas de títulos antes de atingir a força de aperto pré-definido, o alvo irá retornar à sua posição original e começar o próximo ciclo. Nos eventos de ligação que sobrevivem a fase de retração, o alvo é realizada na força de aperto com um alongamento correspondente da RBC por d até que as dissocia de obrigações (Figura 2C, Painéis 5 e 6), e, em seguida, retorna ao postulado inicialião para iniciar o ciclo seguinte (Figura 2C, painel 7). Vida útil é definido como o intervalo de tempo desde o instante em que a força atingiu o nível desejado para o instante de ligação 20 de dissociação.
Por todas estas três modos experimentais do PBF, o experimentador deve ser capaz de ver a abordagem impinge-contact-retrátil (clamp -) (dissociate-) ciclo de teste de retorno (Figura 2C), que será repetido por várias vezes 16,20 , 21.
Os dados recolhidos a partir de cada modo experimental de BFP poderia ser analisados de várias maneiras para obter resultados desejados. A curva média de vida é um resultado representativo do ensaio de força de fechamento (Figura 4). Ele reflete as taxas de off-recíprocos de a dissociação ligando-receptor sob forças. Ensaio de flutuação térmica permite a caracterização de 2D sobre a taxa e a taxa de dissociação de um par receptor-ligando sujeito ao zero força 16; enquanto freq adesãoensaio uency torna o 2D em linha, off-rate e afinidade abaixo de zero-vigor 13.
O suplemento da função permite imagens de fluorescência para a monitorização do nível intracelular de Ca2 + de uma única célula, que é usado como a leitura de sinalização celular neste sistema. Para utilizar esta função durante uma experiência fBFP, é necessário para pré-carregar as células com um indicador de Ca2 +. No caso de Fura2-AM sendo o corante fluorescente, as imagens de fluorescência da mesma célula sob 340 nm e 380 nm de excitação canais foram registados alternadamente na experiência e inspeccionados par-a-par da análise. Um limiar de intensidade para a imagem foi designado fluorescente de cada canal para remover o ruído de fundo e reconhecem o contorno celular (Figura 5). A comparação de cada par de as imagens de fluorescência permite o cálculo do intracelular Ca 2+ nível. Limpar imagens fluorescentes da célula, tanto ao abrigo 340 nme canais 380 nm de excitação são necessárias para a medição precisa do nível de Ca2 + (Figura 5A, B), enquanto que imagens de baixa com não negligenciável ruído de fundo vai resultar em resultados enviesados e deve ser evitada (Figura 5C).
Com a introdução de estímulos mecânicos controláveis para a célula e célula ficha Ca 2+ nível simultaneamente, o fBFP fornece uma poderosa ferramenta única molécula para estudar mecano-transdução de uma célula viva. Vale a pena notar que, a plataforma descrito aqui é bastante versátil; em princípio, pode-se projetar inúmeras maneiras de aplicar a força para a célula para atender fins particulares e ao mesmo tempo monitorando vários eventos de sinalização de interesse. Os detalhes cinéticas dependentes da força são então analisados no contexto da leitura de sinalização escolhidos para extrair as características da cinética de força regulada por receptor de ligando, a sinalização induzida, e a sua correlação. No exemplo de TCR signaling, um TCR-pMHC vínculo captura específicas do agonista foi descoberto pela primeira vez e, em seguida, a sua relevância para célula T fluxo de Ca2 + foi investigada 27. A estratégia era levar o valor de pico do fluxo de Ca2 +, como a leitura de sinalização para buscar o seu melhor preditor entre vários parâmetros cinéticos, incluindo o número de adesões, a amplitude da força da ligação, o tempo médio de vida, a vida útil mais longa ea cumulativo tempo de vida das sequencialmente formado ligações. Mostrado na Figura 6 é um exemplo de gravados simultaneamente vidas de títulos individuais (em que se aplicou uma força de aperto de 10 pN) de uma célula T e a sua acumulação em conjunto com o sinal de Ca2 + curva correspondente. Neste caso, quatro eventos da vida ocorreu antes do momento em que Ca 2+ nível começou a elevar a 55 seg, acumulando um montante de 10 segundos vida vínculo. Este nível de acumulação de vida desencadeado um sinal de Ca2 +, com um pico de rácio normalizado Fura2de 1,8, que ocorreu a 65 seg. A análise matemática sistemática desses dados coletados de muitas células individuais revelou que a melhor correlação de Ca 2+ sinalização força é vidas acumulado no 1º minuto de repetidas interações TCR-pMHC (consulte a Referência 27 para mais informações técnicas).
Figura 3: Tempo de-força Exemplar curvas de dados brutos de um evento não-adesão (A), um evento de força de ruptura (B) e um evento da vida (C). Várias fases do ciclo e os correspondentes segmentos de curva são marcados, respectivamente, em cada painel. A força (eixo y) é derivado de acompanhamento a mudança de posição do cordão da sonda, tal como mostrado na Figura 2C. (A) Nenhuma adesão: a compressão vigor (negativo) nos retornos de fase contato to zero na retração. (B) Um evento de força de ruptura: a força de tracção (positivo) puxa através da ligação ligando-receptor para alongar o RBC, a qual se rompe durante a fase de retracção. (C) Um evento da vida: a ligação persiste até que a força de aperto é atingido e dissocia-se em seguida. A duração da vida evento está indicada. O evento de força de ruptura (B) e o início do evento da vida (C) são realçadas por um asterisco.
Figura 4: ". Tempo médio de vida vs. força" curva de células T OT1 interagindo com seu agonista OVA (verde) e antagonista do G4 (azul) Os dados agrupados são agrupados em diferentes caixas de força, ea média ± SEM de vidas de títulos é plotados em função da força.
Figura 5:. Representativas de Ca 2+ imagens excitados em dois comprimentos de onda (A, B) de reconhecimento de imagem correcta de uma célula T (indicados a vermelho) em 340 nm (A) e 380 nm canais (B) com base no ponto-a- ponto de rastreio usando um limiar de intensidade atribuído adequadamente. (C) A incapacidade de reconhecer a imagem de fluorescência de uma célula T (indicados a vermelho) no canal de excitação 340 nm, devido a uma má carga Fura2.
Figura 6: A superposição do "nível intracelular de Ca2 + (proporção relativa Fura2) vs. tempo" eo "tempo de vida acumulada em função do tempo" curvas de uma célula T OT1, gerard tocando repetidamente a célula T com um grânulo revestido-OVA mais de 300 segundos. (A) A curva da força que mostra uma sequência de não-aderência, a força de ruptura, ao longo da vida e acontecimentos gerados por contactos repetidos ao longo do tempo. (B) imagens de epi-fluorescência pseudo-coloridas de sinais intracelulares de Ca2 + na célula-T em diferentes pontos de tempo. O nível normalizado de Ca2 + é indicado pela escala de pseudo-cor à direita. (C) A sobreposição da curva de sinal de Ca2 + (vermelho) e a curva cumulativo (amarelo) sobre o mesmo curso de tempo. A curva de Ca2 + foi representada graficamente com base na imagem de Ca 2+. Um fluxo de Ca2 + é representada por uma elevação acentuada do rácio Fura2 normalizado. O momento em que Ca 2+ atinge o pico é indicada por uma linha tracejada. O tempo de início de cada vida evento é marcado no tempo de vida curva cumulativa (triângulo sólido).
A experiência bem sucedida fBFP implica algumas considerações críticas. Em primeiro lugar, para o cálculo de força para ser confiável, micropipeta, a RBC, eo talão sonda deve ser alinhado como perto de coaxial possível. A projecção do RBC dentro da pipeta deve ser de cerca de um diâmetro de sonda de pipeta de modo que o atrito entre a RBC e a pipeta é negligenciável. Para um RBC humano típico, o diâmetro ideal pipeta é 2,0-2,4 mm, que produz um melhor ajuste da Equação 1 17,30. Em segundo lugar, para garantir medições em ensaio de força de fechamento e ensaio de flutuação térmica são principalmente para ligações simples, uma freqüência de adesão de menos de 20% tem de ser mantido 10,13,30. Aqui, as aderências não específicas deve ser cuidadosamente controlada (normalmente <5% por bloqueio suficiente com BSA). Além disso, os dados devem ser recolhidos apenas a partir de eventos de adesão com uma única força-drop - marca registrada de um comportamento única molécula (análogo a um desaparecimento de etapa únicade fluorescência em uma única molécula FRET). Em terceiro lugar, a concentração de carregamento do corante fluorescente deve ser optimizada numa base de caso-a-caso para obter a melhor qualidade de imagem. Em quarto lugar, a toxicidade do corante de carregamento de células T ou outras células de interesse tem de ser cuidadosamente examinados antes de cada experiência. Por exemplo, a afinidade de ligação de interacções receptor-ligando de corante de carga em cima precisa ser medido e comparado com o sem corante de carga. Se a afinidade de ligação é mudar radicalmente devido à corante de carga, um corante ou uma concentração diferente de carga diferente tem que ser considerada. Em quinto lugar, as proteínas marcadas com biotina terminalmente são preferidos para permitir o acoplamento conveniente, específica e forte que preserva orientação nativa da proteína.
Uma grande força da fBFP é que ele realiza um ensaio de ligação simples em uma única célula. Apesar do baixo rendimento, a análise em ligação simples, muitas vezes revela características importantes que são inacessíveis por conjunto convencional methods. Por exemplo, examinando a distribuição de vida em cada força bin, pode-se correlacionar diferentes características de ligação com proteínas estados conformacionais, proporcionando uma visão sobre como força regula conformacional proteína muda 20,32. O PBF também pode ser utilizado para medir a rigidez molecular a partir dos dados de deslocamento de força e piezo-tradutor da fase de retracção, os quais podem ser utilizados para investigar proteína dinâmica conformacional 20,21.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para estudar a adesão celular mediada por receptor e sinalização. Cinética de ligação receptor-ligando é geralmente medido com proteínas recombinantes em completo isolamento do ambiente celular. Tal prática é potencialmente problemático. Por exemplo, foi recentemente mostrado que a cinética in situ medidos em células vivas difere drasticamente daquela medida utilizando as proteínas recombinantes correspondentes 14, revelando novos conhecimentos do receptor & #8217; s funções celulares. Não só é o fBFP capaz de quantificar a cinética ligando-receptor in situ, mas, mais importante, que também pode registar simultaneamente a sinalização celular induzida pela ligação às. Como demonstrado pelo TCR 27, o rico de informações características de ligação e sinalização celular obtidos utilizando fBFP oferece uma oportunidade sem precedentes para analisar suas relações e compreensão dos mecanismos moleculares de transdução mecano-. É provável que fBFP encontrará mais aplicações em outros sistemas de receptor-ligando importantes.
The authors have nothing to disclose.
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
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