Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Recettore-ligando membrana mediano molte funzioni cellulari. Cinetica Binding e segnalazione a valle innescato da queste interazioni molecolari sono probabilmente influenzate dall'ambiente meccanico in cui legame e segnalazione avvengono. Uno studio recente ha dimostrato che la forza meccanica può regolare il riconoscimento dell'antigene da e attivazione del recettore delle cellule T (TCR). Ciò è stato reso possibile da una nuova tecnologia che abbiamo sviluppato e fluorescenza Definito sensore di forza biomembrane (fBFP), che combina spettroscopia di forza singola molecola con microscopia a fluorescenza. L'utilizzo di un globulo rosso umano ultra-morbido come il sensore di forza sensibile, una macchina fotografica ad alta velocità e in tempo reale, le tecniche di monitoraggio delle immagini, la fBFP è di ~ 1 PN (10 ^-12 N), ~ 3 nm e ~ 0.5 msec a forza, risoluzione spaziale e temporale. Con il fBFP, si può misurare con precisione singoli cinetica di legame recettore-ligando ai sensi del regolamento vigente e allo stesso tempo l'immagine vincolante-attivato cal intracellularecico segnalazione su una singola cellula dal vivo. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata per studiare altri recettore-ligando di membrana e la segnalazione in altre cellule sotto regolazione meccanica.

Cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare (ECM) adesione è mediata dal legame tra i recettori della superficie cellulare, proteine ​​ECM, e / o lipidi ^1. Binding consente cellule formano strutture funzionali ^1, così come riconoscono, comunicare e reagiscono all'ambiente ^1-3. A differenza di proteine ​​solubili (ad esempio, citochine e fattori di crescita) che si legano da un tridimensionale (3D) fase fluida sui recettori di superficie cellulare, i recettori di adesione cellulare formano legami con i propri ligandi attraverso una stretta spazi di giunzione per colmare due superfici contrapposte che limitano molecolare diffusione in un dimensionale interfaccia due (2D) ^4-7. In contrasto con la cinetica 3D che sono comunemente misurata mediante analisi di legame tradizionali (ad esempio, di risonanza plasmonica di superficie o SPR), cinetica 2D devono essere quantificati con le tecniche specializzate, come microscopia a forza atomica (AFM) ^8-10, flusso camera di ^11,12, micropipetta ^13,14, otticapinzette ¹⁵ e vigore biomembrane sonda (BFP) ^16-21.

Più che semplicemente fornendo linkage fisico per coesione cellulare, molecole di adesione sono un componente importante della macchina di segnalazione per la cella di comunicare con l'ambiente circostante. C'è stato un crescente interesse per comprendere come l'impegno ligando di molecole di adesione avvia segnale intracellulare e come il segnale iniziale viene trasdotto all'interno della cellula. Intuitivamente, proprietà del recettore-ligando può influire i segnali che induce. Tuttavia, è difficile sezionare rapporti meccanicistici tra l'interazione extracellulare ed eventi di segnalazione intracellulare utilizzando insieme tradizionale di saggi biochimici causa delle loro molte limitazioni, ad esempio, una risoluzione temporale povero e la totale assenza di risoluzione spaziale. Metodi che permettono sia biofisica (2D cinetica legame recettore-ligando) e biochimiche osservazioni (segnalazione) su Live esistentele cellule sono substrati di rigidità sintonizzabile ^22, elastomeri array pilastro ²³ e dispositivi camera di flusso / microfluidica incorporato con capacità di fluorescenza ^24-26. Tuttavia, letture di segnalamento e il legame al recettore-ligando devono essere ottenuti separatamente (più spesso con metodi diversi), rendendo difficile sezionare relazioni temporali e spaziali delle caratteristiche dei titoli con eventi di segnalazione.

Convenzionale BFP è una spettroscopia di forza ultrasensibile con alta risoluzione spazio-temporale ^17. Esso utilizza una cella flessibile rossi del sangue (RBC) come un sensore di forza, che consente la misurazione della cinetica 2D singola molecola, le proprietà meccaniche e cambiamenti conformazionali ^{14,16,19-21,27-29.} Un BFP a base di immagini a fluorescenza (fBFP) correla la cinetica di legame recettore-ligando con la segnalazione cellulare vincolante-attivato a scala singola molecola. Con questa impostazione, in attività di segnalazione delle cellule in situ nel contesto meccanicamente superficialistimolazione cal è stata osservata in cellule T ^27. Il fBFP è versatile e può essere utilizzato per studi di adesione e segnalazione cellulare mediata da altre molecole di altre celle.

Questo protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana della Georgia Institute of Technology.

Isolamento 1. globuli rossi umani, biotinilazione e Osmolarità regolazione

Nota: I passi 1.1 deve essere effettuata da un esperto medico professionale come infermiera, con un Institutional Review Board ha approvato il protocollo.

1. Ottenere 8-10 microlitri (una goccia) di sangue dal dito puntura e aggiungere 1 ml di tampone carbonato / bicarbonato (Tabella 1 e 2). Vortice delicatamente o pipetta la miscela e centrifugare per 1 min a 900 x g. Gettare il surnatante e lavare una volta di più.
2. In un piccolo becher pesare 3,5-4 mg di biotina-PEG3500-NHS linker (Tabella 1). Sciogliere nel tampone carbonato / bicarbonato per rendere la concentrazione finale 3 mg / ml.
3. Miscelare 171 ml di tampone carbonato / bicarbonato, 10 ml di RBC confezione e 1049 ml diBiotin-PEG3500-NHS soluzione linker ed incubare a temperatura ambiente per 30 min. Lavare la RBC una volta con tampone carbonato / bicarbonato e quindi due volte con tampone di N2-5% (Tabella 1 e 2).
4. Nel frattempo, posizionare la bottiglia linker con tappo svitato in un essiccatore a vuoto di vetro riempita con essiccanti nella parte inferiore e del vuoto per 5 minuti, e riempire il essiccatore con argon. Serrare il tappo e prendere la bottiglia. Sigillare la bottiglia con una pellicola di plastica di paraffina (Tabella 1), metterlo in un contenitore riempito di diseccanti sul fondo e conservare in -20 ° C.
   Nota: I passi che implicano l'uso di biotina-PEG3500-NHS linker, tra 1,2-1,4 (tranne per l'incubazione e lavare in 1.3), devono essere eseguite più velocemente possibile.
5. Diluire nistatina in tampone N2-5% per fare una concentrazione finale di 40 mg / ml. Mescolare 5 ml di biotinilato RBC con 71,4 ml di nistatina (Tabella 1) soluzione e incubare per 1 ora a 0 &# 176; C. Lavare due volte con N2-5% tampone e negozio con N2-5% tampone + 0,5% di BSA (Tabella 1) in frigorifero (4 ° C).

2. perle di vetro silanizzazione

1. Pulizia di Bead Surface
   1. Pesare 50 mg di perline di vetro in polvere e li ri-sospendere in 500 ml di acqua deionizzata.
   2. Mescolare 0,5 ml di 30% H ₂ O ₂ (Tabella 1) con 9,5 ml di acqua deionizzata in un bicchiere da 50 ml, quindi aggiungere 2 ml di concentrato NH ₄ OH (Tabella 1) e portare la soluzione ad una caldaia su una piastra calda .
   3. Aggiungere le perle di vetro per la soluzione bollente e continuare a bollire per altri 5 minuti. Agitare delicatamente la soluzione ogni min.
   4. Dopo la bollitura, trasferire ~ 5 ml di questa sospensione di sferette caldo in un tubo da 15 ml di micro-centrifuga e riempire con acqua deionizzata RT. Centrifugare a 3.500 g per 5 minuti, rimuovere ed eliminare il surnatante.
   5. Trasferire altri 5 ml di sospensione di sferette caldo e aggiungere ai talloni lavati, Rabboccare con più acqua DI, mescolare bene, e centrifugare di nuovo. Ripetere questa procedura fino a quando viene utilizzato circa 50 ml di acqua deionizzata, che sarà un totale di 4 o 5 volte di lavaggio.
   6. Trasferire la sospensione di sferette in una fiala da 1 ml. Ripetere il lavaggio delle perline con metanolo (Tabella 1) mediante centrifugazione a 17.000 xg per 5 minuti per 3 volte, e, infine, risospendere le sfere in 1 ml di metanolo 100%.
2. Bead superficie Thiolation
   1. Per un tubo da centrifuga da 50 ml aggiungere 45,6 ml di metanolo, 0,4 ml di acido acetico (Tabella 1), 1,85 ml di acqua deionizzata, 1,15 ml di 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (Tabella 1) e 1 ml di perline sospensione preparata in 2.1, poi incubare a temperatura ambiente per 3 ore.
   2. Dopo la reazione, rimuovere tutti i reagenti lavando una volta con metanolo fresco, e risospendere le sfere in 500 ml di metanolo. Divida anche la sospensione delle perle di vetro concentrata in una serie di 20 flaconi di vetro asciutti e puliti contappi a vite. Si evapora il metanolo utilizzando un getto di argon secco e ruotare lentamente i flaconi in modo da rendere un sottile strato di perline secche sui lati di ciascun flacone.
   3. Posizionare le fiale di perle in un forno di essiccazione preriscaldato a 120 ° C per 5 minuti e poi estrarre rapidamente e posizionare il tappo (s) liberamente su. Mettere le fiale in un essiccatore a vuoto di vetro riempito di essiccanti nella parte inferiore e aspirare essiccatore con una pompa a vuoto fino a raffreddamento.
   4. Eliminare l'essiccatore aspirato con argon asciutto per portare essiccatore sino alla normale pressione atmosferica. Togliere il coperchio essiccatore e rapidamente riavvitare il tappo (s) sul flacone. Sigillare le fiale con pellicola paraffina plastica e conservarli a temperatura ambiente in una scatola asciutta conservazione al buio.
   5. Dopo l'uso immediato, prendere una fiala di perline secco e lavare una volta con tampone fosfato (tabelle 1 e 2), risospendere in 50 ml di tampone fosfato e conservare a 4 ° C. Questa preparazione tallone concentrato verrà indicatocome "perle MPTMS" nelle seguenti fasi.
      Nota: Con una corretta conservazione, perline MPTMS potrebbero restare in funzione per un massimo di tre mesi.

3. Bead Funzionalizzazione

1. Covalentemente Rivestimento proteine ​​su Beads
   1. Prendere un certo volume (ad esempio, 2,5 ml) della proteina magazzino e miscelare con un volume uguale di tampone carbonato / bicarbonato di rendere Soluzione 1.
      Nota: Il volume dipende dalla concentrazione magazzino e la densità sito finale desiderato della proteina sulla superficie perline.
   2. In un piccolo becher pesare 2-3 mg di MAL-PEG3500-NHS linker (Tabella 1) e sciogliere con tampone carbonato / bicarbonato di raggiungere una concentrazione finale di 0,231 mg / ml.
   3. Mescolare Soluzione 1 con un volume uguale di soluzione linker preparata in 3.1.2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min a rendere Soluzione 2.
   4. Nel frattempo, posizionare la bottiglia linker con tappo svitato in un vuoto vetro essiccatore filled con essiccanti nella parte inferiore e del vuoto per 5 minuti, e riempire il essiccatore con argon. Serrare il tappo e prendere la bottiglia. Sigillare la bottiglia con una pellicola di plastica di paraffina, metterlo in un contenitore riempito di diseccanti sul fondo e conservare in -20 ° C.
      Nota: I passi che implicano l'uso di MAL-PEG3500-NHS linker, tra 3.1.2-3.1.4 (tranne per l'incubazione in 3.1.3), occorrerà effettuare più velocemente possibile.
   5. Mescolare 5 ml di MPTMS perline con soluzione 2 e aggiungere tampone fosfato (Tabella 1) per rendere un volume finale di 250 microlitri.
   6. Incubare le perline notte a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato, e risospendere in 100 ml di tampone fosfato e conservare a 4 ° C.
2. Preparazione proteine ​​Beads / Streptavidina (SA) rivestiti
   1. Seguire il protocollo 3.1.1-3.1.4.
   2. Mescolare 5 ml di perline MPTMS con Soluzione 2 e 5 ml di 4 mg / ml Streptavidina-Maleimide (SA-MAL) (Tabella 1Soluzione) e quindi aggiungere tampone fosfato per fare un volume finale di 250 microlitri.
   3. Incubare le perline notte a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato, e infine risospendere in 100 ml di tampone fosfato e conservare a 4 ° C.
3. Rivestimento Streptavidin su Branelli di Vetro
   1. Mescolare 5 ml di MPTMS perle con 5 ml di 4 mg / ml soluzione SA e aggiungere 140 ml di tampone fosfato.
   2. Incubare le perline notte a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato, e risospendere in 50 ml di tampone fosfato e conservare a 4 ° C.
4. Rivestimento Beads SA rivestite con una proteina Biotinylated
   1. Mescolare 5 ml di perline SA rivestite con la proteina (volume a seconda della densità di rivestimento desiderato) e aggiungere tampone fosfato per rendere il volume finale sia 100 microlitri.
   2. Incubare la miscela per una notte a 4 ° C o per 3 ore a temperatura ambiente, lavate 3 volte con tampone fosfato e risospendere in 50 microlitri phosphate buffer e conservare a 4 ° C.

4. cellulare Preparazione

Nota: Per purificare le cellule, seguire protocolli di purificazione cella di riferimento corrispondenti al tipo di cellule in uso, per esempio cellule T ²⁷ o certe linee cellulari ^21,29.

1. Per gli esperimenti fBFP, una volta che la sospensione cellulare viene preparato, aggiungere Fura2-AM (Tabella 1) disciolto in DMSO nella sospensione cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e poi lavare una volta. Conservare la sospensione cellulare fluorescente caricata nel buio fino al momento dell'uso.

5. Preparazione per Micropipette e una Camera delle cellule

1. Preparazione Micropipette
   1. Tubi Tagliare lungo capillari di vetro (Tabella 1) con un tagliatore di vetro in brevi pezzi di circa 3 pollici di lunghezza. Montare un pezzo sul estrattore micropipetta (Tabella 1), fare clic su "Pull", maton in modo che la parte centrale del capillare viene riscaldato dalla macchina e il capillare sarà tirato sulle due estremità per fare due capillari con punte acuminate (micropipette prime).
      Nota: Seguendo le linee guida del prodotto, la morfologia desiderata della pipetta prima ha 6-8 mm cono e 0.1-0.5 micron punta.
   2. Montare una pipetta crudo sul supporto pipetta della fucina micropipetta (Tabella 1). Calore per fondere la sfera di vetro sulla fucina. Inserire la punta della pipetta prima all'interno della sfera di vetro. Raffreddare la sfera di vetro e tirare la pipetta prima di rompere dall'esterno e lasciare la punta all'interno della sfera. Ripetere questa procedura fino a ottenere l'orifizio punta desiderata.
      Nota: Esempi di un diametro interno di punta micropipetta: 2.0-2.4 micron di RBC, ~ 1.5 micron per un cordone, ~ 2-4 micron di cellule T e -7 micron per una cella ibridoma.
2. Costruire una Camera cellulare
   Nota: la camera di cella è costruito sulla base di una casa-pazzae portacamera, che consiste di due pezzi di quadrati metalli (rame / alluminio) e ha una maniglia che li unisce (Figura 1D).
3. Tagliare a 40 mm x 22 mm x 0,2 millimetri coprioggetto con un taglierino vetro in due pezzi 40 millimetri x 11 mm x 0,2 mm (coprivetrino 1 e 2). Colla coprioggetto 1 con grasso al lato superiore del supporto della camera in modo che collega i due quadrati di metallo, e similmente coprioggetto colla 2 alla parte inferiore, che formano una camera cellule parallelo coprioggetto (Figura 1D).
4. Utilizzare una pipetta per iniettare 200 ml di tampone sperimentale tra le due lamelle. Assicurarsi che il buffer attribuisce ad entrambi i vetrini. Ruotare delicatamente e scuotere la camera di lasciare che il buffer di toccare entrambi i lati della camera.
5. Iniettare cautela olio minerale in entrambi i lati della camera fiancheggiano la zona cuscinetto sperimentale sigillando il buffer dall'aria aperta. Iniettare sospensioni di perline sonda (per esempio, perle pMHC Perle), globuli rossi e gli obiettivi(per esempio, cellule T) nelle regioni superiori, medie e inferiori della zona cuscinetto rispettivamente.

6. esperimento BFP

Figura 1: montaggio fBFP (A) Un quadro panoramica del sistema hardware fBFP.. (B) Un disegno schematico del sistema hardware fBFP. (C) Il sistema dual-cam "DC2" (arancione) su cui la macchina fotografica ad alta velocità (blu) e una telecamera di fluorescenza (bianco) sono stati montati. (D) La fase di microscopio che si adatta una camera esperimento e tre sistemi di manipolazione micropipetta. Micrografie impostazione BFP in una camera sperimentale (E ed F). (E) Micropipette che mostra il montaggio la pipetta della sonda (a sinistra), l'obiettivo pipetta (in alto a destra) e il suo assistente pipetta (r bassaestra). Posizionamento tallone (F) Sonda. Una goccia sonda è stata manipolata da una pipetta aiuto e attaccato ad un apice RBC per formare un sensore di forza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Accendere il microscopio (Tabella 1) e la sorgente luminosa. Posizionare la camera sul palco principale del microscopio (Figura 1A, D).
2. Installare tutte le tre micropipette di BFP (Figura 1D sinistra:. Sonda, per afferrare un RBC, a destra: bersaglio, per afferrare una cella o tallone, in basso a destra: aiutante, per afferrare un tallone).
   1. Utilizzare un micro-iniettore (Tabella 1) per riempire una micropipetta con tampone sperimentale. Togliere il supporto pipetta (Tabella 1) e tenerlo in un luogo più basso per permettere acqua gocciola dalla punta. Inserire rapidamente il micropipetta nella punta supporto e assicurarsi che nessuna bolla d'aria entra nel micropipettadurante l'inserimento. Stringere la vite del supporto.
   2. Montare ciascun titolare pipetta sul suo corrispondente micro-manipolatore. Spingere la micropipetta verso la camera in modo che le loro punte entrano nell'area di buffer camera. Regolare la posizione della micropipetta e li trova sotto il campo ottico di vista.
3. Spostarsi all'interno dello stadio portacamera di trovare le colonie di tre elementi (globuli rossi, gli obiettivi e le perline sonda) uno per uno. Regolare la posizione del corrispondente micropipetta ruotando le manopole dei manipolatori per far la punta della micropipetta approccio una cella / tallone. Aspirare cella / tallone regolando la pressione all'interno della corrispondente micropipetta. Tutte e tre le micropipette cattureranno i loro elementi corrispondenti.
4. Spostarsi all'interno dello stadio portacamera di trovare uno spazio aperto, lontano da colonie degli elementi iniettate in cui verrà effettuata l'esperimento. Commutare la modalità visiva microscopio per visualizzare l'immagine sul compprogramma uter sullo schermo del computer. Spostare tutti i tre elementi su punte per pipette nel campo visivo del programma.
5. Allineate il tallone sonda e RBC e manovrare con attenzione il tallone sonda al vertice del RBC, incidere brevemente il tallone sul RBC e delicatamente ritrattare. Regolare la pressione della micropipetta aiutante a soffiare delicatamente il tallone via, in modo che possa essere lasciato incollato sul RBC apice (Figura 1F). Allontanare il micropipetta aiutante e allineare il bersaglio e tallone sonda (Figura 2A).

Figura 2:. Schema BFP e il suo ciclo di prova (A) Video-micrografia raffigurante un sensore di forza (a sinistra) e una T-cellula bersaglio (destra) aspirato dal rispettivo sensore di forza stazionaria pipettes.The costituito da un RBC gonfio e una allegata ligando-cuscinetto tallone. Il recettore-cuscinettoT-cell (target) è montato un piezotranslator allineato opposta alla sonda. Il ROI è indicato in verde. L'inseguitore bordo è indicato in una linea blu. L'inserto rappresenta il ligando (pMHC, lato tallone) e del recettore (TCR, lato T-cell) coppia su due superfici opposte nella zona segnata in arancione. (B) Il profilo di intensità del bordo tallone in (A). La regione ROI in x-direzione è tracciata come asse x (in numero di pixel) e l'intensità della luce (in valore scala di grigi) in media da 30 pixel binning lungo la y-direzione. (C) La deformazione del RBC e la posizione del tallone e il bersaglio (cellule T) in un ciclo di prova di dosaggio morsetto forza. Le linee tratteggiate verticali e orizzontali indicano la posizione di zero forza dell'apice RBC e l'andamento nel tempo, rispettivamente. L'inseguitore bordo linea della deformazione RBC è mostrato in blu di ciascun pannello. Le fasi stesse ancora meno sono adottati frequenza adesionetest (che manca i passi di "pinza" e "dissociarsi") e test fluttuazione termica (che manca la fase di "dissociarsi").

6. In programma, nella finestra campo visivo utilizzare gli strumenti nel programma per misurare la rispettivi raggi della micropipetta sonda (R _p), la RBC (R _0), l'area di contatto circolare tra RBC e sonda tallone (R _c) , che consente la stima della costante elastica della RBC (k) mediante la seguente equazione ^17,30,
   
   
   dove Δ p è la pressione di aspirazione a puntale della pipetta.
   
   Nota: Dalle legge di Hooke che la forza vincolante, F, può essere quantificato il prodotto di costante elastica e spostamento del tallone sonda (d), cioè, F = d (Figura 2C).
7. Inserire la costante della molla RBC desiderato nel programma (Si prega di fare riferimento alla sezione relativa al protocollo 6.6. La costante della molla è in genere fissato a 0,25 o 0,3 PN / nm per il morsetto forza dosaggio e l'adesione saggio di frequenza e 0,1 PN / nm per il dosaggio fluttuazione termica) , che restituirà una pressione di aspirazione necessaria nell'unità di centimetro di acqua. Regolare l'altezza del serbatoio dell'acqua che si collega a pipetta della sonda fino a raggiungere la pressione di aspirazione desiderata.
8. Tracciare una linea orizzontale attraverso l'apice RBC, che produrrà una curva nella finestra adiacente indica la luminosità (valore di scala di grigi) di ciascun pixel lungo questa linea. Trascinare la linea di soglia per essere a circa metà della profondità della curva (Figura 2A, B).
   Nota: Il punto di minimo della curva di luminosità al di sotto della linea di soglia indica la posizione del confine tallone, quindi solo un minimo locale è permessa. Se due o più minimi locali sono allo stato attuale,indica che l'immagine non è ottimale (probabilmente dovuto all'immagine essendo fuori fuoco, o un cattivo allineamento tra tallone sonda e la RBC).
9. Selezionare la modalità desiderata esperimento: saggio fluttuazione termica, frequenza adesione test o test morsetto forza. Impostare i parametri come desiderato (ad esempio, la forza d'urto = 15 pN, caricando tasso = 1.000 PN / s, tempo di contatto = 1 sec, forza di serraggio = 20 PN (per forza di serraggio test), ecc).
   1. Istruzioni "Start", che consente al programma di spostare la pipetta bersaglio e guidare il bersaglio in e fuori dal contatto con la sonda (vedere la sezione Risultati rappresentativi per i dettagli). La raccolta dei dati sarà eseguita in parallelo, che registra la posizione del tallone della sonda in tempo reale. Arrestare il programma cliccando sul pulsante "esperimento Stop", momento in cui una finestra pop-out per consentire il salvataggio dei dati acquisiti.

7. fluorescenza BFP (fBFP) esperimento

1. Per utilizzare il fluorescence funzione del sistema BFP, accendere la sorgente di luce di eccitazione (Tabella 1) e la telecamera di fluorescenza (Tabella 1), che sono controllate da un programma separato (Tabella 1). In programma, selezionare i parametri per l'imaging di fluorescenza, compreso il guadagno, l'esposizione, i canali di eccitazione (in questo caso, 340 nm e 380 nm di luce), ecc. Seguite tutti i preparativi nel protocollo dell'esperimento BFP, tra cui l'allineamento della sonda e il bersaglio, che consentirà la visualizzazione delle immagini in diretta a fluorescenza delle cellule bersaglio eccitato da 340 nm o 380 nm luce di eccitazione.
2. Utilizzare lo strumento sezionamento a circa sezione l'area entro cui la cella rimarrà per tutto il periodo di registrazione.
   Nota: Grazie all'uso del ciclo di accostamento contatto-retrazione, la cella sarà muovendo avanti e indietro ripetutamente, così l'area in sezione è molto più grande della cella stessa.
3. Clicca su "Record" per consentire l'una 340 nmd 380 nm luce per eccitare alternativamente la fluorescenza colorante intracellulare (Fura2), ed una coppia di corrispondenti immagini di fluorescenza saranno registrate alternativamente circa una volta ogni secondo. Contemporaneamente cliccare su "Start" in programma per iniziare l'esperimento BFP per l'interazione molecolare analisi e l'esperimento di imaging di fluorescenza per monitorare segnale calcio intracellulare. Il sistema produrrà un file di dati grezzi per il legame recettore-ligando (vedere Figura 6A sotto) e una serie di immagini fluorescenti in formato .tiff per i segnali di calcio.

Analisi 8. Dati

1. Analisi BFP dati
   1. L'analisi dei dati per l'analisi di frequenza adesione
      1. Sequenziale ispezionare il segnale di ogni ciclo di "forza in funzione del tempo" e registrano semplicemente che i cicli contengono un evento di adesione e quali no, e riassumono per produrre una frequenza media di adesione.
      2. Raccogliere la forza di rottura di ogni evento di adesione, cheè il valore di picco della forza lineare rampa prima rottura legame. Dopo aver raccolto una quantità sufficiente di forze di rottura in una gamma di velocità di rampa, derivare la distribuzione della forza di rottura ad ogni velocità di rampa da cui è derivata la forza-dipendente off-rate di dissociazione recettore-ligando con forza dinamica spettroscopia analisi ^18,31.
   2. L'analisi dei dati per l'analisi termica fluttuazione
      1. Sequenziale ispezionare il segnale di fase di chiusura di ciascun ciclo, che probabilmente contiene più eventi di associazione legame e di dissociazione. Utilizzare il livello fluttuazione termica fase di serraggio (la deviazione standard media di un intervallo di scorrimento di 70 punti di tempo sequenziali della posizione tallone) nella "forza vs. tempo" segnale come guida per distinguere gli eventi di associazione e di dissociazione legame, poiché un legame formazione corrisponde ad una diminuzione della fluttuazione termica.
      2. Designare l'intervallo dal momento di dissociazione del legame (quando il thermal fluttuazione riprende al livello normale) all'istante della successiva formazione del legame come tempo di attesa, e designare la durata del legame dalla sua associazione alla dissociazione come vita legame, che sono entrambi raccolte durante l'ispezione dei dati. Calcolare il tempo medio di attesa e la durata media legame, che riflettono, rispettivamente, il reciproco di on-rate e quello di off-rate sotto zero forza ^16,30.
   3. L'analisi dei dati per l'analisi morsetto forza
      1. Parametri record di tutti gli eventi di durata compresa la forza media e la durata legame con il numero di sequenza, così come l'ora di inizio e l'ora di fine, che permetteranno di trarre una curva vita cumulativa (per esempio, la Figura 6C, curva gialla).
      2. Raccogliere una quantità sufficiente di vita gli eventi sotto una gamma di forze. Raggrupparli in contenitori diversi di forza, che produrrà una vita media in ogni bin vigore, e complessivamente produrre una "vita media vs. Curva forza "(Figura 4).
2. Calcio fluorescenza Analisi Imaging dati
   1. Regolare la soglia di intensità fino a che le immagini di fluorescenza mostrano un chiaro contorno della cella in entrambi i canali 340 nm e 380 nm senza rumore di fondo (Figura 5A, B). Poi rivedere il Ca2 ⁺ intracellulare trama di segnale per fotogramma con uno pseudo-colore che indica il livello di intensità (Figura 6B), che è ricavato in base al rapporto di intensità di 340 nm / 380 nm, per generare il "Ca ²⁺ intensità normalizzata vs . Curva tempo "(Figura 6C). Utilizzare le immagini pseudo-colore fluorescenza per produrre un film che mostra il secondo livello di fluorescenza per secondo.

La tecnica BFP è stato lanciato da laboratorio Evans nel 1995 ^17. Questo strumento picoforce è stato ampiamente utilizzato per misurare le interazioni di proteine ​​immobilizzate su superfici, in modo da analizzare la cinetica bidimensionali di molecole di adesione interagire con i loro ligandi ^{16,19,20, 30,} per misurare l'elasticità molecolare ^21,29, e per determinare proteine ​​conformazionale cambia ^21. Per un fBFP, un ulteriore set di dispositivi epi-fluorescenza connesse con il sistema relativo software (Tabella 1) viene aggiunto (Figura 1A - C).

Il sistema fBFP costituito da un sistema hardware (componenti ottici, meccanici ed elettrici) e di un sistema software (Tabella 1 e Figura 1A, B). Un microscopio invertito (Figura 1A, centro) con componenti ottici consentono campo chiaro e microscopia a epifluorescenza costituisce il corpo principale diil sistema fBFP, su cui la fase di sperimentazione e manipolatori pipetta sono montati. Un controller sorgente di luce di fluorescenza (Figura 1A, in alto a sinistra) vengono usati per fornire alternati luci di eccitazione. Un sistema dual-cam "DC2" divide la luce in due e li trasmette a una telecamera ad alta velocità (blu) e una telecamera di fluorescenza (bianco) (Figura 1A, nell'angolo in basso a sinistra). Il primo raccoglie l'immagine sonda per la determinazione della posizione e quest'ultimo immagini di fluorescenza raccoglie i emessi dalla cellula bersaglio a due lunghezze d'onda. L'esperimento è monitorato e controllato da due computer, di cui Host PC 1 (Figura 1A, in alto a destra, ritagliata nella foto a causa di limiti di spazio) è collegato sia alla telecamera ad alta velocità e la macchina fotografica di fluorescenza ed è responsabile per l'esecuzione dell'esperimento e l'acquisizione dei dati, e Host PC 2 è collegato alla telecamera di monitoraggio e responsabile per presentare una vista completa del experi BFPmento (Figura 1A, B).

Durante un esperimento, la sperimentalista utilizza tre micropipette di afferrare e manipolare le cellule e microsfere, rispettivamente (Figura 1E, F). Una tipica immagine di un esperimento BFP costituito da un sensore di forza, che viene assemblato fissando una perlina sonda sul vertice di un RBC aspirato, e una cellula bersaglio / tallone (Figura 2A). Una regione di interesse (ROI), che contiene la zona di bordo del tallone sul RBC all'apice, viene monitorata da una telecamera veloce velocità (2.000 fps) per monitorare la deformazione della RBC in tempo reale. Lo spostamento cingolato del tallone quindi può essere usato per calcolare la forza esterna esercitata sul sensore di forza (vedi nota in sezione 6.6 Protocol), data la costante elastica del BFP (Figura 2A, B).

Adesione saggio di frequenza, test fluttuazione termica, e test morsetto forza sono le tre modalità sperimentali di uso comune in un sistema BFP. By annunciooptando qualsiasi di queste tre modalità, un esperimento BFP è composto di cicli di test ripetuti che vengono eseguite sequenzialmente.

Nel test di frequenza adesione, il bersaglio si avvicina e contatti il ​​tallone probe in un determinato tempo di contatto (per esempio, 1 sec) e si ritrae direttamente alla posizione originale ed avviare il ciclo successivo. Un evento adesione è riflessa da un segnale di forza di trazione nella fase di retrazione. Questo ciclo di accostamento-contatto-retrazione viene ripetuta 50 volte per almeno 3 coppie bersaglio-sonda per calcolare un SEM medio di frequenza adesione, P _a.

Thermal analisi fluttuazione viene utilizzato per le misure a vita sotto zero forza. In ciascun ciclo, dopo aver toccato il tallone della sonda, il bersaglio è retratto nella posizione zero forza e bloccato in contatto con il tallone senza né compressione o tensione per 20 secondi, e quindi ritorna alla posizione iniziale per avviare il ciclo successivo. Legame associazione / dissociazione sotto zero forza èsi manifesta come un improvviso calo / aumento delle fluttuazioni termiche del cordone ^16,30.

Test morsetto forza viene utilizzato per le misurazioni vita sotto le forze. Una forza di serraggio desiderata (ad esempio, 20 pN) è impostato prima dell'esperimento. Il bersaglio è spinto ripetutamente per contattare il tallone sonda per un determinato tempo di contatto (per esempio, 1 sec) per consentire la formazione di un legame recettore / ligando (Figura 2C, pannelli 2 e 3) e poi retrarre (Figura 2C, Panel 4 ). Se si forma nessun legame, riflessa in nessuna segnale di forza di trazione sul RBC, o in caso di rottura dei titoli prima di raggiungere la forza di serraggio preimpostata, il bersaglio ritorneranno alla posizione originale ed avviare il ciclo successivo. Negli eventi di legame che sopravvivono la fase di rientro, il bersaglio è tenuto presso la forza di serraggio con un corrispondente allungamento del RBC da D fino a quando le dissocia obbligazionari (Figura 2C, pannelli 5 e 6), e poi ritorna al posit originaleion per iniziare il ciclo successivo (Figura 2C, Panel 7). Durata è definito come l'intervallo di tempo dal momento in cui la forza raggiunto il livello desiderato per l'istante di dissociazione del legame ^20.

Per tutti questi tre BFP modalità sperimentali, la sperimentatore dovrebbe essere in grado di vedere l'approccio impinge-contatto-retract- (clamp -) (dissociate-) ciclo di prova del ritorno (Figura 2C), che sarà ripetuta per più volte ^{16,20 , 21.}

I dati raccolti da ciascun modo sperimentale BFP potrebbero essere analizzate in vari modi per ottenere i risultati desiderati. La curva di vita media è un risultato rappresentante saggio pinza forza (Figura 4). Essa riflette le off-tassi reciproche della dissociazione recettore ligando sotto forze. Thermal assay fluttuazione consente per la caratterizzazione di 2D-rate e off-rate di una coppia recettore-ligando sotto zero forza ^16; mentre adesione freqtest uency rende il 2D-rate, off-rate e affinità sotto zero forza ^13.

Il componente aggiuntivo della funzione fluorescenza consente il monitoraggio della Ca2 ⁺ intracellulare livello di una singola cella, che è usato come la lettura di segnalazione delle cellule in questo sistema. Per utilizzare questa funzione durante un esperimento fBFP, uno ha bisogno di precaricare le cellule con un indicatore di Ca ^2+. Nel caso di Fura2-AM essendo il colorante fluorescente, le immagini di fluorescenza della stessa cella sotto 340 nm e 380 nm di eccitazione canali sono stati registrati alternativamente nell'esperimento e controllati pair-by-pair nell'analisi. Una soglia di intensità è stata assegnata ad immagine fluorescente di ciascun canale per rimuovere il rumore di fondo e riconoscere il contorno di cellule (Figura 5). Confronto tra ogni coppia delle immagini di fluorescenza permette il calcolo della intracellulare Ca livello ^2+. Immagini fluorescenti chiare della cella sotto entrambi 340 nme 380 nm di eccitazione i canali sono necessari per la misurazione accurata del livello di Ca ²⁺ (Figura 5A, B), mentre le immagini poveri con non trascurabile il rumore di fondo si tradurrà in risultati parziali e dovrebbero essere evitati (Figura 5C).

Con l'introduzione di stimolazioni meccaniche controllabili sul cellulare delle cellule e registrare Ca2 ⁺ livello contemporaneamente, il fBFP fornisce un potente strumento di singola molecola per studiare meccano-trasduzione in una cellula vivente. Vale la pena notare che, la piattaforma qui descritta è molto versatile; in linea di principio, si può progettare numerosi modi di applicare una forza alla cella per soddisfare scopi particolari e contemporaneamente il monitoraggio di diversi eventi di segnalazione di interesse. I dati cinetici forza dipendente vengono poi analizzate nel contesto della lettura segnalazione scelto per estrarre caratteristiche cinetiche forza regolata recettore-ligando, la segnalazione indotta, e la loro correlazione. Nell'esempio di TCR signaling, un TCR-pMHC legame cattura specifici agonisti è stata scoperta e poi la sua rilevanza per cellule T Ca ²⁺ flusso è stato studiato ^27. La strategia era di prendere il valore di picco di Ca ²⁺ flusso come la lettura di segnalazione di cercare il suo miglior predittore tra vari parametri cinetici, compreso il numero di adesioni, l'ampiezza della forza vincolante, la vita media, la durata più lunga e cumulativa durata delle sequenza formata associazioni. In figura 6 è un esempio di vite obbligazioni individuale registrate simultaneamente (dove è stata applicata una forza di chiusura di 10 pN) di una cellula T e il loro accumulo insieme alla curva del segnale Ca ²⁺ corrispondente. In questo caso, quattro vita gli eventi si sono verificati prima del momento in cui Ca ²⁺ livello cominciò a elevare a 55 sec, accumulando una somma di 10 secondi vita legame. Questo livello di accumulo vita innescato una ²⁺ segnale di Ca con un picco di normalizzato rapporto Fura21,8 che si è verificato a 65 sec. Un'analisi matematica sistematica dei dati raccolti da molte singole celle ha rivelato che il miglior correlato di Ca ²⁺ segnalazione forza è durata cumulata nel 1 ^° minuto di interazioni ripetute TCR-pMHC (vedi riferimento ²⁷ per i dettagli tecnici).

Figura 3: esemplare tempo-forza curve di dati grezzi di un evento no-adesione (A), un evento di forza di rottura (B) e un evento di vita (C). Varie fasi del ciclo e dai corrispondenti segmenti di curva sono rispettivamente contrassegnati in ogni pannello. La forza (asse y) è derivato dal monitoraggio della variazione di posizione del tallone della sonda, come mostrato nella Figura 2C. (A) n adesione: la forza di compressione (negativo) nei rendimenti fase contatto to pari a zero su di retrazione. (B) Un evento di forza di rottura: una forza di trazione (positiva) tira via il legame del recettore-ligando per allungare il RBC, che rompe durante la fase di rientro. (C) Un evento di vita: il legame persiste fino a raggiungere la forza di serraggio e dissocia successivamente. Viene indicata la durata dell'evento vita. L'evento forza di rottura (B) e l'inizio della manifestazione vita (C) sono evidenziati da un asterisco.

Figura 4:. "Average vita contro forza" curva di OT1 cellule T che interagisce con i suoi agonisti OVA (verde) e antagonisti G4 (blu) I dati raccolti sono raggruppati in diversi contenitori di forza, e la media ± SEM di vite obbligazionari è tracciare la curva forza.

Figura 5:. Rappresentante di Ca ²⁺ immagini eccitati a due lunghezze d'onda (A, B) il riconoscimento immagine corretta di un T-cell (indicati in rosso) a 340 nm (A) e 380 nm (B) canali sulla base di point-to puntare screening utilizzando una soglia di intensità assegnato correttamente. (C) Impossibilità di riconoscere l'immagine di fluorescenza di una cellula T (indicato in rosso) nel canale di eccitazione 340 nm, a causa della scarsa carico Fura2.

Figura 6: Sovrapposizione del "Ca2 ⁺ intracellulare livello (rapporto relativo Fura2) in funzione del tempo" e la "cumulativa durata vs. tempo" curve di un T-cell OT1, generared toccando ripetutamente il T-cellulare con un tallone OVA rivestite oltre 300 secondi. (A) Una curva di forza che mostra una sequenza di non-adesione, la forza di rottura, e vita gli eventi generati dai ripetuti contatti nel tempo. (B) le immagini Epi-fluorescenza pseudo-colori di intracellulari Ca ²⁺ segnali nel cellule T in diversi momenti. Il normalizzato Ca ²⁺ livello è indicato dalla scala pseudo-colori a destra. (C) sovrapposizione della curva Ca ²⁺ segnale (rosso) e la curva di durata cumulativa (giallo) sullo stesso corso tempo. La curva di Ca ²⁺ è tracciata sulla base del Ca ²⁺ imaging. A Ca ²⁺ flusso è significata da un forte innalzamento del rapporto Fura2 normalizzato. Il tempo in cui Ca ²⁺ raggiunge il picco è indicato da una linea tratteggiata. Il tempo di inizio di ciascun evento di vita è segnata sulla curva durata cumulativa (triangolo solido).

Un esperimento di successo fBFP comporta alcune considerazioni critiche. In primo luogo, per il calcolo forza di essere affidabile, la micropipetta, l'RBC, ed il tallone della sonda devono essere allineati come vicino coassiale possibile. La proiezione del RBC all'interno della pipetta dovrebbe essere circa un diametro della sonda pipetta in modo che l'attrito tra RBC e la pipetta è trascurabile. Per un tipico RBC umana, il diametro ottimale pipetta è 2.0-2.4 micron, che produce un migliore adattamento di Equazione 1 ^17,30. In secondo luogo, al fine di garantire le misure in vigore morsetto saggio e saggio fluttuazioni termiche sono per lo più per le singole obbligazioni, una frequenza di adesione di meno del 20% deve essere mantenuto ^10,13,30. Qui, aderenze non specifici devono essere attentamente controllati (di solito <5% per il blocco sufficiente con BSA). Inoltre, i dati devono essere raccolti solo da eventi di adesione con una sola forza-drop - segno distintivo di un comportamento singola molecola (analoga a una scomparsa passo singolodi fluorescenza singola molecola FRET). Terzo, concentrazione caricamento del colorante fluorescente deve essere ottimizzata caso per caso per ottenere la migliore qualità dell'immagine. In quarto luogo, la tossicità di colorante di caricamento per cellule T o altre cellule di interesse deve essere attentamente esaminata prima di ogni esperimento. Ad esempio, l'affinità di legame del recettore-ligando upon dye loading devono essere misurati e confrontati con che senza colorante di caricamento. Se l'affinità di legame è il cambiamento a causa drammaticamente a tingere di carico, un colorante diverso o una concentrazione di carico diverso deve essere considerato. In quinto luogo, le proteine ​​terminale biotina-tag sono preferiti per consentire l'accoppiamento comodo, preciso e forte che conserva l'orientamento nativo della proteina.

Un punto di forza del fBFP è che esso esegue un test singolo legame in una singola cella. Nonostante la bassa produttività, analisi single-legame spesso scopre caratteristiche importanti che sono inaccessibili per ensemble di convenzionale methods. Ad esempio, esaminando la distribuzione vita a ciascun bin forza, si può correlare differenti caratteristiche di legame con proteine ​​stati conformazionali, fornendo comprensione su come forza regola proteina conformazionale cambia ^20,32. La BFP può anche essere usato per misurare la rigidità molecolare dalla forza e piezo-traduttore di dati di spostamento della fase di retrazione, che possono essere utilizzati per studiare proteine ​​dinamica conformazionale ^20,21.

Molti metodi sono stati sviluppati per studiare recettore mediata adesione e segnalazione cellulare. Recettore-ligando cinetica di legame è generalmente misurati con proteine ​​ricombinanti in completo isolamento dall'ambiente cellulare. Tale pratica è potenzialmente problematico. Per esempio, è stato recentemente dimostrato che in situ cinetiche misurate su cellule vive differisce drasticamente da quello misurato utilizzando le corrispondenti proteine ​​ricombinanti ^14, rivelando nuovi approfondimenti del recettore & #8217; s funzioni cellulari. Non solo è il fBFP in grado di quantificare la cinetica recettore-ligando in situ, ma ancora più importante, può anche registrare simultaneamente la segnalazione cellulare legame-indotta. Come dimostrato per il TCR ^27, il ricco informazioni di caratteristiche di legame e di segnalazione cellulare ottenuti utilizzando fBFP offre un'opportunità senza precedenti per analizzare le loro relazioni e la comprensione dei meccanismi molecolari di meccano-trasduzione. E 'probabile che fBFP troverà più applicazioni in altri importanti sistemi recettore-ligando.

The authors have nothing to disclose.

Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.