형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

멤브레인 수용체 - 리간드 상호 작용은 다수의 세포 기능을 매개한다. 바인딩 역학 이러한 분자의 상호 작용에 의해 트리거 다운 스트림 신호는 가능성이 기계적인 환경에서 결합 및 신호 포획 장소에 의해 영향을받습니다. 최근 연구는 기계적인 힘에 의한 항원 인식을 조절하고 T 세포 수용체 (TCR)의 트리거링 할 것을 보여 주었다. 이 형광 현미경으로 단일 분자 힘 분광법을 결합한 새로운 우리가 개발 한 기술이라고 형광 생체막의 힘 프로브 (fBFP)에 의해 가능하게되었다. 민감한 힘 센서로서 고속 카메라와 실시간 영상 추적 기술을 매우 부드러운 인간 적혈구를 사용 fBFP 1 ~ PN ^(10-12 N) ~ 3nm 이상이며 ~ 0.5 밀리의 힘, 공간과 시간 해상도. fBFP으로, 하나는 정확하게 힘 조절에 따라 단일 수용체 - 리간드 결합 동력학과 동시​​에 이미지가 트리거 바인딩 세포 내 칼을 측정 할 수 있습니다cium 하나의 살아있는 세포에 신호. 이 새로운 기술은 기계적인 규제에서 다른 세포에서 다른 막 수용체 - 리간드 상호 작용과 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 간 및 세포 - 대 - 세포 외 기질 (ECM)의 밀착성이 세포 표면 수용체, ECM 단백질, 및 / 또는 지질 ¹ 간의 결합에 의해 매개된다. 바인딩은 세포의 ^기능을 형성 ^한 구조뿐만 아니라, 인식, 통신, 및 환경 ^1-3에 반응 할 수있다. 수용성 단백질 (예 : 사이토킨 및 성장 인자), 3 차원 (3D)에서 결합하는 세포 표면 수용체 상 유체 상 달리 세포 부착 수용체 분자 구속 두 대향면을 연결하는 좁은 접합부 갭에 걸쳐 그들의 리간드 결합을 형성 두 차원 (2D) 인터페이스 ^4-7에 확산. 일반적으로 기존의 결합 분석 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 또는 SPR)에 의해 측정되는 3D 동역학 달리, 챔버 ^{(11, 12)을} 흘러, 예컨대 원 자간 력 현미경 (AFM) ^8-10 같은 전문 기술을 정량 2D 동력학 가지고 마이크로 피펫 ^{13, 14,} 광핀셋 ^(15)과 생체막의 힘 프로브 (BFP) ^16-21.

단지 세포 응집력 물리적 링크를 제공하는 이상은, 부착 분자는 그 주변과 통신하는 셀에 대한 시그널링 장치의 주요 구성 요소이다. 부착 분자의 리간드 결합은 세포 내 신호 전달 및 방법은 초기 신호가 상기 형질 도입 된 세포의 내부를 개시한다 방법 이해에 관심이 증대되고있다. 직관적으로, 수용체 - 리간드의 성질은 그것이 유도 된 신호에 영향을 미칠 수 바​​인딩. 그러나, 그 때문에 예를 들면 많은 한계, 불량한 시간 해상도와 공간 해상도의 완전한 결핍의 생화학 적 분석법 전통적인 앙상블을 사용 세포 상호 작용 및 세포 내 신호 전달 기전 이벤트 간의 관계를 해부하기가 어렵다. 라이브에 모두 생물 물리학 (역학을 결합 2D 수용체 - 리간드)을 허용 방법과 생화학 (신호) 관측을 기존세포는 형광 기능을 ^24-26로 통합 조정 강성 ^(22)의 기판 ⁽²³⁾ 엘라스토머 기둥 배열과 유량 용기 / 미세 유체 장치를 포함한다. 그러나, 신호와 결합 수용체 리간드의 판독이 어려운 신호 이벤트와 결합 특성의 공간적 관계를 해부하고, (다른 방법으로 가장 자주) 개별적으로 얻을 수있다.

기존의 BFP는 높은 시공간 해상도 ^(17)와 고감도 힘 분광법이다. 이는 단일 분자 동력학 2D, 기계적 특성 및 구조적 변화 ^{14,16,19-21,27-29의} 측정을 가능하게 힘 센서로서가요 적혈구 (RBC)를 사용한다. 형광 이미징 기반 BFP (fBFP)는 단일 분자 규모에서 결합 트리거 세포 신호와 수용체 - 리간드 결합 반응 속도의 상관 관계. 표면 mechani의 맥락에서 현장 세포 신호 활동이 설정으로CAL 자극은 ^T-27 세포에서 관찰되었다. fBFP 만능이며 다른 셀들에있는 다른 분자들에 의해 매개되는 세포 부착 및 시그널링의 연구에 사용될 수있다.

이 프로토콜의 지침을 다음과 조지아 공대의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 인간의 적혈구 분리, 바이오 티 닐화 및 삼투압 조절

참고 : 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인 한 단계 1.1, 숙련 된 의료 전문가 등의 간호사가 수행해야합니다.

1. 손가락 찌르기에서 혈액의 8-10 μL (한 방울)를 얻어 탄산염 / 중탄산염 버퍼 1 ㎖에 추가 (표 1, 2). 부드럽게 G 와동 또는 900 X에서 1 분 동안 혼합 원심 분리기를 피펫. 뜨는을 취소하고 한 번 더 씻는다.
2. 작은 비커 비오틴 PEG3500-NHS 링커 (표 1) 3.5-4 mg의 무게. 최종 농도가 3 ㎎ / ㎖ 있도록 카보네이트 / 중탄산염 완충액에 용해시킨다.
3. 탄산염 / 중탄산염 버퍼 171 μL, 적혈구 팩 10 μL와의 1049 μl를 혼합비오틴 링커 PEG3500-NHS 용액을 30 분 동안 RT에서 배양한다. 탄산염 / 중탄산염 버퍼 한 번 적혈구를 세척 한 후 두 번 N2-5 % 버퍼 (표 1, 2)와.
4. 한편, 5 분 동안 바닥 진공 건조제로 채워진 유리 진공 건조기에서 풀 캡으로 링커 병을 배치하고, 아르곤와 건조기를 입력합니다. 뚜껑을 조이고 병을 꺼내. 플라스틱 파라핀 필름 (표 1)와 병을 밀봉, -20 ° C에서 바닥 상점에 건조제로 충전 된 용기에 넣습니다.
   주 : 1.2-1.4 포함 비오틴 PEG3500-NHS 링커의 사용을 포함하는 단계 (부화를 제외하고 1.3 씻어), 가능한 한 빨리 수행 될 필요가있다.
5. 40 μg / ML의 최종 농도를 만들어 N2-5 % 완충액으로 희석 니 스타틴. 니 스타틴의 71.4 μL (표 1) 솔루션 바이오틴 적혈구의 5 μl를 혼합하고 0에서 1 시간 동안 배양 &# 176; C. 냉장고에서 + 0.5 % BSA N2-5 % 완충액 (표 1) (5 ° C)와 N2-5 % 완충액 저장 회 씻는다.

2. 유리 구슬 실란 화

1. 구슬 표면의 청소
   1. 유리 비드 분말 50mg을 달아 DI 물 500 μL에 그들을 재 - 보류.
   2. 50 ㎖ 비이커에 DI 물 9.5 ㎖로 0.5 ㎖의 30 % H ₂ O ₂ (표 1) 혼합 한 후 농축 NH ₄ OH (표 1) 2 ㎖을 추가하고, 핫 플레이트상에서 보일러에이 용액을 가지고 .
   3. 끓는 용액에 유리 구슬을 추가하고 다른 5 분 동안 끓여을 계속합니다. 부드럽게 솔루션마다 분을 소용돌이 친다.
   4. 끓는 후, RT DI 물 15 ㎖의 마이크로 원심 분리기 튜브와 최고 최대로 ~이 뜨거운 구슬 현탁액 5 mL를 전송합니다. 5 분 동안 3,500 XG에 원심 분리기 제거하고 상층 액을 버린다.
   5. 세척 구슬에 뜨거운 구슬 서스펜션의 또 다른 5 mL를 전송하고 추가다시, 더 탈 이온수와 위로 잘 혼합하고 원심 분리기. 탈 이온수의 약 50 ㎖가 사용될 때까지 세척의 4 ~ 5 배의 총이 될 것이다,이 절차를 반복합니다.
   6. 1 ml의 유리 병에 구슬 현탁액을 전송합니다. 마지막으로 3 회 5 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리하여 메탄올 (표 1)과 비드를 세척하고, 반복을 100 % 메탄올 1 ㎖ 중의 비드를 일시 중지 재.
2. 구슬 표면 티올
   1. 50 mL의 원심 관에, 현탁액을 2.1에서 제조 한 1.15 mL의 3- 메르 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란 (MPTMS) (표 1) 및 1 ml의 구슬 아세트산 메탄올 45.6 ㎖, 0.4 ㎖ (표 1), DI 물 1.85 ml에, 추가 다음 3 시간 동안 실온에서 품어.
   2. 반응 후, 신선한 메탄올로 한번 세정하여 모든 반응 물질을 제거하고, 메탄올 500 μL로 비드를 다시 일시. 균등 (20) 건조하고 깨끗한 유리 병의 집합으로이 집중 유리 구슬 서스펜션을 분할스크류 캡. 건조한 아르곤의 제트를 사용하여 메탄올을 증발시키고, 바이알의 양면에 건조 비드 박층가되도록 서서히 바이알을 회전한다.
   3. 느슨하게에 캡 (들)을 배치 빠르게 5 분 동안 120 ° C로 예열 된 오븐에 건조 구슬의 튜브를 배치 한 후 꺼내. 바닥에 건조제를 채운 글래스 진공 데시 케이 터 내에서 튜브를 배치하고 냉각 될 때까지 진공 펌프로 진공 건조기.
   4. 정상 대기압으로 건조기를 가지고 건조 아르곤으로 진공 건조기를 제거. 유리 병의 캡 (들)을 다시 조여 빠르게 데시 케이 터의 뚜껑을 제거하고. 플라스틱 파라핀 필름과 유리 병을 밀봉하고 건조 어두운 저장 상자에 실온에서 보관.
   5. 즉시 사용되면, 건조 구슬 중 하나 유리 병을 가지고 인산 버퍼 (표 1, 2), 4 ℃에서 인산 버퍼 및 저장의 50 μL에 다시 일시 중지 한 번 씻는다. 이 농축 된 비드 제제 부른다다음 단계에서 "MPTMS 비드"로.
      참고 : 적절한 스토리지, MPTMS 구슬 최대 3 개월 동안 기능을 유지 할 수있다.

3. 구슬 기능화

1. 공유 구슬에 단백질을 코팅
   1. 단백질 주식의 특정 볼륨 (예를 들어, 2.5 μL)를 가지고 해결 방법 1 만들 탄산염 / 중탄산염 버퍼의 동량 혼합.
      주 : 볼륨 스톡 농도 및 비드 표면에 단백질의 원하는 최종 사이트 밀도에 의존한다.
   2. 작은 비이커 MAL-PEG3500-NHS 링커 (표 1) 2-3 mg의 무게 및 0.231 mg / ml의 최종 농도에 도달하기 위해 탄산염 / 중탄산염 완충액으로 용해시킨다.
   3. 3.1.2에서 제조 링커 용액의 동량 혼합 용액 1. 2 액을 30 분 동안 실온에서 혼합물을 인큐베이션.
   4. 한편, 유리 진공 건조기의 F에서 풀 캡으로 링커 병 배치5 분 동안 바닥과 진공에 건조제와 함께 illed, 아르곤와 건조기를 입력합니다. 뚜껑을 조이고 병을 꺼내. 플라스틱 파라핀 필름으로 병을 밀봉 -20 ° C에서 바닥 상점에 건조제로 충전 된 용기에 넣습니다.
      주 : (3.1.3에서 인큐베이션 제외) 3.1.2-3.1.4 포함 MAL-PEG3500-NHS 링커의 사용을 포함하는 단계를, 최대한 빨리 수행 될 필요가있다.
   5. 해결 방법 2와 MPTMS 구슬의 5 μl를 혼합하고 250 μL의 최종 부피를 만들기 위해 인산 완충액 (표 1)를 추가합니다.
   6. , 실온에서 밤새 구슬을 품어 인산 버퍼로 3 회 세척하고, 4 ℃에서 인산 버퍼와 저장소의 100 μL에 다시 일시 중지합니다.
2. 준비 단백질 / 스트렙 타비 딘 (SA) 코팅 비즈
   1. 프로토콜 3.1.1-3.1.4을 따르십시오.
   2. 해결 방법 2와 MPTMS 구슬 5 μL 4 ㎎ / ㎖ 스트렙 타비 딘 - 말레이 미드 (SA-MAL) (표 1의 5 μl를 혼합) 용액 후 250 μL의 최종 부피를 위해 인산 완충액을 추가한다.
   3. 4 ° C에서 인산염 버퍼와 저장소의 100 μL에 다시 일시 중지 마지막으로, 실온에서 밤새 구슬을 품어 인산 버퍼로 3 회 반복합니다.
3. 유리 구슬에 스트렙 타비 딘 코팅
   1. 4 ㎎ / ㎖ s 솔루션의 5 μL와 MPTMS 구슬의 5 μl를 혼합하고 인산염 완충액 140 μL를 추가합니다.
   2. , 실온에서 밤새 구슬을 품어 인산 버퍼로 3 회 세척하고, 4 ℃에서 인산 버퍼와 저장소의 50 μL에 다시 일시 중지합니다.
4. 비오틴 단백질과 SA 코팅 비즈 코팅
   1. (볼륨이 원하는 코팅 밀도에 따라 다름) 단백질과 SA 코팅 구슬의 5 μl를 혼합하고 최종 부피는 100 μL 될 수 있도록 인산 버퍼를 추가합니다.
   2. 하룻밤 4 ℃ 또는 실온에서 3 시간 동안 혼합물을 품어 인산 버퍼로 3 회 세척하고, 50 μL의 산도에 다시 일시 중지osphate 버퍼 및 4 ℃에서 저장한다.

4. 셀 준비

참고 : 예를 들어, ^T-27 세포 또는 특정 ^{세포주를 21,29,} 세포를 정화 세포의 사용 형태에 대응하는 표준 셀 정제 프로토콜을 따르.

1. fBFP 실험을 위해, 세포 현탁액이 준비되면, Fura2-AM, 2 μM의 최종 농도에 도달 RT에서 30 분 동안 배양 한 다음 번 씻어 세포 현탁액으로 DMSO에 용해 된 (표 1)을 추가한다. 어두운 곳에서 사용할 때까지이 찬란로드 세포 현탁액을 유지합니다.

5. 마이크로 피펫을위한 준비 및 세포 상공 회의소

1. 마이크로 피펫을 준비
   1. 길이가 약 3 인치 짧은 조각으로 유리 커터로 잘라 긴 모세관 유리관 (표 1). 마이크로 피펫 풀러 (표 1), "당겨"를 클릭 위에 장착 한 조각 만t가되도록 모세관의 중앙이 시스템에 의해 가열되며 모세관 날카로운 팁 (원시 마이크로 피펫)과 함께 두 개의 모세관을 만드는 두 단부에 인출한다.
      참고 : 제품의 가이드 라인에 따라, 원료 피펫의 원하는 형태가 6-8mm 테이퍼 및 0.1 ~ 0.5 μm의 팁이있다.
   2. 마이크로 피펫 단조 (표 1)의 피펫 홀더에 원시 피펫을 마운트합니다. 열은 단조에 유리 구 용융합니다. 유리 구 안에 원시 피펫의 팁을 삽입합니다. 유리 구를 냉각 및 외부에서 휴식과 구 내부의 팁을 떠나 원시 피펫을 잡아 당깁니다. 원하는 팁 구멍을 얻을 때까지이 절차를 반복합니다.
      마이크로 피펫 팁 내경의 예 : 참고 : 적혈구에 대한 2.0-2.4 μm의, 비드 ~ 1.5 μm의, ~ T 세포 2-4 μm의 하이 브리 도마 세포에 대한 -7 μm의.
2. 셀 실 구축
   주 : 셀 챔버가 홈 화에 기초하여 내장두 개의 금속 사각형 조각 (구리 / 알루미늄)와 함께 그들을 연결하는 핸들 (그림 1D)로 구성되어 전자 챔버 홀더.
3. 두 40mm X 11mm X 0.2 mm 조각으로 유리 커터를 이용하여 40mm X 22mm X 0.2 mm의 커버 슬립을 잘라 (커버 슬립을 1, 2). 접착제가 두 개의 금속 사각형을 브릿지하는 방식 챔버 홀더의 상부 측에 그리스에 의해 커버 슬립 (1)과 평행 커버 슬립 셀 챔버 (도 1D)을 형성 할 것이다 하측 마찬가지로 접착제 커버 슬립이.
4. 두 된 커버 사이에 실험 버퍼의 200 μl를 주입 피펫을 사용합니다. 버퍼가 모두 된 커버에 부착되어 있는지 확인합니다. 부드럽게 회전 버퍼 챔버의 양쪽에 접촉하는 챔버를 흔들.
5. 조심하여 야외에서 버퍼 밀봉 실험 버퍼 영역을 플 랭킹 챔버의 양측에 미네랄 오일을 주입. (예를 들면, 코팅 된 비드 pMHC) 프로브 비드 현탁액, 적혈구 및 대상을 주입각각의 버퍼 영역, 상부 중간 및 하부 영역에서 (예를 들면, T 세포).

6. BFP 실험

도 1 : fBFP 조립체 (A) fBFP 하드웨어 시스템의 개요 사진.. (B) fBFP 하드웨어 시스템의 개략도. (C) 고속 카메라 (파란색)와 형광 카메라 (흰색) 상에 장착 된 이중 CAM 시스템 "DC2"(오렌지). (D) 실험 챔버와 세 마이크로 피펫 조작 시스템을 적응 현미경 스테이지. (E 및 F) 실험 챔버 BFP 설정의 현미경 사진. (E) Micropipette과 조립 프로브 피펫 (왼쪽), 대상 피펫 (오른쪽)과 도우미 피펫을 보여주는 (낮은 Right). (F) 프로브 비드 배치. 프로브 비드가 힘 프로브를 형성하는 적혈구 정점에 도우미 피펫에 의해 조작 및 장착했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 현미경 (표 1)과 광원의 전원을 켭니다. 주요 현미경 단계 (그림 1A, D)에 챔버를 놓습니다.
2. (대상 셀 또는 구슬, 오른쪽 잡아 : : : 적혈구, 권리를 잡기 위해, 프로브 구슬을 잡아, 도우미. 그림 1D 왼쪽) BFP의 세 Micropipette과를 설치합니다.
   1. 실험 버퍼 마이크로 피펫을 백필하는 마이크로 인젝터 (표 1)를 사용합니다. 피펫 홀더 (표 1)을 벗고 끝에서 떨어지는 물을 수 있도록 낮은 장소에서 그것을 유지. 신속 홀더 끝으로 마이크로 피펫을 삽입하고 공기 거품이 마이크로 피펫에 들어간 없는지 확인삽입시. 홀더 나사를 조입니다.
   2. 해당 마이크로 매니퓰레이터에 각 피펫 홀더를 탑재합니다. 자신의 팁 챔버 버퍼 영역을 입력하도록 챔버쪽으로 마이크로 피펫을 밀어 넣습니다. 마이크로 피펫의 위치를​​ 조정하고보기의 현미경 필드에서 그들을 찾을 수 있습니다.
3. 하나씩을 세 가지 요소의 식민지 (적혈구, 목표와 프로브 구슬)를 찾기 위해 챔버 홀더 무대 주위로 이동합니다. 마이크로 피펫 접근 한 셀 / 비드의 끝을 수 있도록 조작기의 노브를 돌려 해당 마이크로 피펫의 위치를​​ 조정합니다. 해당 마이크로 피펫 내부의 압력을 조절함으로써 세포 / 비드 대기음. 세 가지 가능한 Micropipette 해당 요소를 캡처합니다.
4. 멀리 실험이 수행 될 주입 된 요소의 식민지에서 열린 공간을 찾기 위해 챔버 홀더 무대 주위로 이동합니다. 완의 이미지를 시각화하기 위해 현미경 영상 모드를 전환컴퓨터 화면 터의 프로그램입니다. 프로그램의 비전 필드에 피펫 팁의 모든 세 가지 요소를 이동합니다.
5. 간단히 철회 부드럽게 적혈구에 비드를 충돌하고, 프로브 비드 및 RBC를 맞추고 조심스럽게 RBC의 정점에 프로브 비드를 기동. 이 RBC 정점 (그림 1 층)에 붙어 남아있을 수 있도록, 부드럽게 떨어져 구슬을 불어 도우미 마이크로 피펫의 압력을 조정합니다. 도우미 마이크로 피펫을 벗어나 대상과 프로브 비드 (그림 2A)를 맞 춥니 다.

그림 2 :. BFP 방식 및 시험주기 (A) 힘 프로브 (왼쪽)와 각각의 pipettes.The 고정 힘 프로브에 의해 흡입 대상 T 세포 (오른쪽)를 묘사하는 비디오 현미경 부어 적혈구 및 부착으로 구성 리간드 베어링 구슬을. 수용체 - 베어링T 세포 (타겟)에 대 향하여 정렬 된 프로브 piezotranslator에 장착된다. 투자 수익 (ROI)은 녹색으로 표시됩니다. 에지 추적은 파란색 선으로 표시됩니다. 인서트는 오렌지색으로 표시 영역의 두 대향 표면에 리간드 (pMHC, 비드 측면)과 수용체 (TCR, T 세포 측) 쌍을 도시한다. (B) (A)에서의 에지 비드의 강도 프로파일. X의 Y 방향에서의 ROI 영역은 X시킴으로써 행한다 (화소 수있는) 및 (계조 값)의 광 강도의 Y Y 방향을 따라 30 픽셀 비닝함으로써 평균으로서 도시된다. (C) RBC의 편향 및 비드의 위치와 힘 클램프 분석의 테스트 사이클에서 타겟 (T 세포). 가로 및 세로 파선은 각각 RBC 에이펙스와 시간 경과의 제로 하중 위치를 나타낸다. 적혈구 변형 라인 에지 추적기는 각 패널에 파란색으로 표시됩니다. 동일한 아직 적은 단계 접착 주파수 채택( "해리"하는 단계를 결여) 및 열적 변동 분석 ( "클램프"및 "해리"의 단계를 결여) 분석.

6. 프로그램, 비전 필드 창 프로브 마이크로 피펫 (R의 _P)의 각각의 반경을 측정하기 위해 프로그램에 도구를 사용하여, RBC (R _1), RBC 및 프로브 비드 (R _온도) 사이의 원형 접촉 영역 다음 수학 식 ^17,30로 RBC (K)의 스프링 정수의 추정을 허용하는,
   
   
   여기서 Δ p를 프로브 피펫 팁에서 흡입 압력이다.
   
   주 : 결합력, F가, 스프링 상수 및 프로브 비드 (d)의 변위, 즉, F = D의이 제품에 의해 정량화 될 수 있음 훅 법칙을 따른다 (그림 2C).
7. (프로토콜 6.6 절을 참조하십시오. 스프링 상수는 일반적으로 힘 클램프 분석 및 접착 주파수 분석을위한 0.25 또는 0.3 PN이 / nm의 열 변동 분석 0.1 PN / nm에서 설정) 프로그램에 원하는 적혈구 스프링 상수를 입력 , 이는 물 센티미터 단위로 필요한 흡인 압력을 반환합니다. 필요한 흡입 압력에 도달 할 때까지 프로브의 피펫에 링크 수조의 높이를 조정한다.
8. 이러한 라인을 따라, 각 화소의 휘도 (계조 값)를 나타내는 창에 인접하는 곡선을 산출한다 RBC 에이펙스 걸쳐 수평 라인을 그린다. 곡선 (그림 2A, B)의 절반 정도 깊이로 임계 선을 끕니다.
   주 : 임계 선 아래 명도 곡선상의 최소 포인트 비드 경계의 위치, 따라서 오직 하나의 로컬 최소 허용을 나타낸다. 두 개 또는 그 이상의 국부 최소값이 존재하는 경우에, 그것을이미지 (때문에 초점이되는 이미지 또는 프로브 비드와 RBC 사이의 가난한 정렬에 가능성이) 최적되지 않음을 나타냅니다.
9. 열 변동 분석, 접착 주파수 분석 또는 힘 클램프 분석 : 원하는 실험 모드를 선택합니다. (힘 클램프 분석을 위해 힘 = 20 PN을 (클램핑 예를 들어, 충돌의 힘 = 15 PN, 로딩 속도 = 1,000 PN / s의, 접촉 시간 = 1 초), 등) 원하는대로 매개 변수를 설정합니다.
   1. 프로브와의 접촉에서 (자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조) 대상 피​​펫을 이동하고 목표를 구동 할 수있는 프로그램을 수 있습니다 "시작"을 클릭합니다. 데이터 수집은 실시간 비드 프로브의 위치를​​ 기록 병렬로 수행 될 것이다. 윈도우가 수집 된 데이터를 저장 할 수 있도록 튀어되는 시간에 버튼을 "중지 실험"을 클릭하여 프로그램을 중지합니다.

7. 형광 BFP (fBFP) 실험

1. fluore을 사용하려면BFP 시스템에서 scence 기능은 별도의 프로그램 (표 1)에 의해 제어되는 여기 광원 (표 1) 및 형광 카메라 (표 1)를 켜. 프로그램 등 이득, 노광, 여진 채널 (이 경우, 340 nm 내지 380 nm의 광)을 포함한 형광 이미징을위한 파라미터를 선택한다. 340 나노 미터 또는 380 nm의 여기 광에 의해 여기 표적 세포 라이브 형광 이미지의 시각화 수 프로브와 목표를 정렬을 포함하여 BFP 실험 프로토콜에 모든 준비를하십시오.
2. 대략 섹션 영역이있는 내 세포가 전체 기록 기간 동안 남아있을 것입니다 위해 단면 도구를 사용합니다.
   참고 : 인해 접근 접촉면 후퇴 사이클의 사용으로, 세포 따라서 단면 영역은 셀 자체보다 훨씬 크다 반복적으로 전후 이동 될 것이다.
3. 340 나노 수 있도록 "기록"을 클릭D 380 nm의 빛을 교대로 번갈아 한 번씩 초마다 기록됩니다 세포 내 형광 염료 (Fura2), 및 형광 이미지를 대응 쌍을 자극합니다. 동시에 분석 분자 상호 작용과 세포 내 칼슘 신호를 모니터링 할 수있는 형광 이미징 실험에 대한 BFP 실험을 시작하기 위해 프로그램에서 "시작"을 클릭합니다. 시스템이 결합 수용체 리간드에 대한 원시 데이터 파일 (아래도 6A 참조)과 칼슘 신호 .TIFF 형식 형광 이미지의 시리즈를 생성한다.

8. 데이터 분석

1. BFP 데이터 분석
   1. 접착 주파수 분석을위한 데이터 분석
      1. 순차적으로 각주기의 '힘 대 시간 "신호를 검사하고 단순히 사이클하지 접착 이벤트를 포함하고있는 어떤 기록하고 평균 접착 주파수를 산출하기 요약.
      2. 각 접착 이벤트의 파열 력을 수집하는본드 파열 전에 경 사진 직선 힘의 피크 값이다. 램프 비율의 범위에서 파단 힘의 충분한 양을 수집 한 후, 강제 의존 오프 레이트 수용체 리간드 해리 동적 힘 스펙트럼 측정 ^18,31을 이용하여 유도되는 각각의 램프 속도에서의 파단 하중 분포를 도출.
   2. 열적 변동에 대한 분석 데이터 분석
      1. 순차적 가능성 다중 결합 협회와 해리 이벤트를 포함하는 각주기의 클램핑 위상 신호를 검사합니다. 결합 이후, 결합 연결 및 분리 이벤트를 구별하기 위해 참조 신호 "대 시간의 힘 '에 클램핑 위상 열적 변동 레벨 (비드 총수의 70 연속 시점의 슬라이딩 구간의 평균, 표준 편차)을 사용하여 형성은 열적 변동의 감소에 대응한다.
      2. THER 때 (결합 해리의 순간에서 간격을 지정말 변동은 대기 시간을 다음과 같은 결합 형성의 순간에) 정상 레벨로 다시 시작하고, 두 데이터 검사 중에 수집 결합 수명 등 해리의 연결에서 결합의 지속 기간을 나타낸다. 각각 제로 힘 ^16,30 하에서 속도의에 속도의 상호 및 그 반영하는 평균 대기 시간과 평균 채권 수명을 계산합니다.
   3. 클램프 력에 대한 분석 데이터 분석
      1. 한 누적 수명 곡선을 그릴 수 있도록 시퀀스 번호뿐만 아니라 시작 시간 및 종료 시간과 평균 힘과 결합 수명을 포함한 모든 수명 이벤트의 기록 파라미터들 (예를 들어,도 6C, 노란색 곡선).
      2. 힘의 범위 하에서 수명 이벤트의 충분한 양을 수집. 각각의 힘 빈의 평균 수명을 생산하고, 모두 "평균 수명 대를 얻을 것입니다 다른 힘 쓰레기통에 그룹을,. 힘 "곡선 (그림 4).
2. 칼슘 형광 이미징 데이터 분석
   1. 형광 이미지는 배경 잡음없이 모두 340 nm 내지 380 nm의 채널에서 셀의 명확한 윤곽을 표시 할 때까지 강도 임계치를 조정한다 (도 5A, B). 그 후 340 ㎚ / 380 nm 인 강도 비에 기초하여 유도되는 강도 레벨 (도 6b)를 나타내는 의사 - 컬러 프레임 의한 세포 내 ^칼슘 신호 프레임을 검토 VS "정규화 ^칼슘 농도를 생성하도록 . 시간 "곡선 (그림 6C). 둘째로 형광 레벨 초 표시 동영상을 생성하기 위해 의사 - 컬러 형광 이미지를 사용한다.

BFP 기술 1995 ¹⁷ 에반스 실험실에 의해 개척되었다.이 picoforce 도구는 ^{광범위하게,} 그들의 리간드 ^16,19,20과 상호 작용하는 부착 분자의 이차원 동력학을 분석하기 위하여, 표면에 고정화 된 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용 된 ^30, 분자 탄성 ^21,29을 측정하고, 단백질의 구조적 ^(21)을 변경 결정합니다. 대한 fBFP, 추가되는 해당 소프트웨어 시스템 (표 1)과 에피 형광 관련 장치 (그림 1A - C)의 추가 세트.

fBFP 시스템은 하드웨어 시스템 (광학 기계 및 전기 부품) 및 소프트웨어 시스템 (표 1 및도 1A, B)로 구성된다. 명 시야 및 에피 형광 현미경을 가능 광학 부품과 거꾸로 현미경 (도 1A, 중간)은 본체를 구성하는실험 스테이지 피펫 조작자가 장착되는 상 fBFP 시스템. 형광 광원 제어부 (도 1a, 좌측 상단)은 교번 여기 광을 전달하는 데 사용된다. 듀얼 CAM 시스템 "DC2"는 두 개로 분할하고 광을 고속 카메라 (파란색)와 형광 카메라 (화이트) (도 1A, 왼쪽 아래)로 전송한다. 전자는 위치 판정과 두 파 길이에서 타겟 셀로부터 방출 후자를 수집 형광 화상 용 프로브 이미지를 수집한다. 실험은 감시되고 고속 카메라와 형광 카메라 모두에 접속된다 (인해 공간 제한으로도 1A, 우측 상단, 그림에서 자른) 호스트 PC (1)는 그 중 두 컴퓨터에 의해 제어되는 실험을 수행 할 책임이있다 데이터 수집 및 호스트 PC (2)는 감시 카메라에 접속 된 BFP experi의 전체 뷰를 제공하기위한 책임, 표준 (그림 1A, B).

실험 기간 동안, 실험자은 잡아 각각 세포와 미세 (그림 1E, F)를 조작하는 세 가지 마이크로 피펫을 사용합니다. BFP 실험의 일반적인 이미지는 흡입 된 RBC의 정점에 프로브 비드를 부착하여 조립 력 프로브와 표적 세포 / 비드 (도 2A)로 구성된다. RBC 정점에 비드의 엣지 영역을 포함 관심 영역 (ROI)이, 실시간으로 RBC의 변형을 모니터링하기 위해 빠른 속도 카메라 (2000 FPS)에 의해 추적된다. 다음 비드 추적 변위 BFP의 스프링 상수 주어진 힘 탐침에 가해진 외력을 계산 (프로토콜 섹션 6.6에서 설명을 보라)하는데 사용될 수있다 (도 2A, B).

접착 주파수 분석, 열 변동 분석 및 힘 클램프 분석법 BFP 시스템에서 일반적으로 사용되는 세 개의 모드 실험이다. 광고에 의해이들 세 가지 모드 중 하나를 탈퇴, BFP 실험 순차 반복 수행되는 테스트 사이클 구성된다.

접착 주파수 분석에서, 타겟은 접근 및 접점 주어진 접촉시 프로브 비드 (예를 들어, 1 초)을 직접 다시 원래의 위치로 후퇴하고, 다음 사이클을 시작한다. 접착 이벤트 수축 단계 동안 장력 신호에 의해 반사된다. 이러한 접근 접촉면 후퇴 사이클 접착 주파수의 평균 SEM, P를 계산하기 위해 적어도 3 개의 타겟 프로브 쌍에 대한 50 회 반복된다.

열 변동 분석 제로 힘 하에서 수명 측정에 사용된다. 각 사이클에서, 프로브 비드를 터치 한 후, 타겟은 제로 하중 위치로 후퇴하고, 압축 또는 20 초 동안 긴장 어느없이 비드에 접촉 고정하고 다음 사이클을 시작하는 초기 위치로 복귀한다. 본드 연결 / 분리 제로 힘에서이다비드 ^16,30의 열 변동의 급격한 감소 / 증가로 나타난다.

포스 클램프 분석은 힘 하에서 수명 측정에 사용된다. (예를 들어, 20 PN) 원하는 체결력이 실험에 앞서 설정된다. 타겟 수용체 / 리간드 결합의 형성을 허용하도록 (예를 들어, 1 초) 주어진 접촉 시간 용 프로브 비드 문의를 반복 구동된다 (도 2C, 패널 (2, 3)), 그리고, 후퇴 (도 2C, 패널 (4) ). 어떤 결합이 형성되지 않는 경우 기 설정된 형체력 도달하기 전에 결합 파열, 타겟이 원래 위치로 복귀하고 다음 사이클을 시작할 경우, RBC에 아무런 장력 신호 반사 또는. 후퇴 위상 생존 결합 이벤트에서, 목표는 결합 해리 (도 2C, 패널 (5, 6)), 다음 원본 포지로 복귀 할 때까지 D 의해 RBC의 대응 연신율 체결력 유지된다이온은 다음 사이클 (그림 2C, 패널 7)를 시작합니다. 힘이 결합 해리 ^(20)의 순간에 원하는 레벨에 도달 할 때 수명 순간 내지 시간 간격으로 정의된다.

이 모든 세 BFP 실험 모드의 경우, 실험자은 접근 - 충돌 - 접촉 retract- (클램프 -)를 참조 할 수 있어야한다 (dissociate-) 여러 번 ^{16, 20를} 반복한다 반환 시험주기 (그림 2C), ^21.

BFP 각 실험 모드로부터 수집 된 데이터는 원하는 결과를 도출하기 위해 다양한 방식으로 분석 될 수있다. 평균 수명 곡선은 힘 클램프 분석 (그림 4)에서 한 대표 결과입니다. 그것은 힘에서 수용체 - 리간드 해리의 상호 오프 비율을 반영한다. 열 변동 분석은 2D의 특성 속도 및 오프 속도 제로 힘 ^{16 세} 미만 수용체 리간드 쌍의 수 있습니다; 접착 주파수 동안uency 분석 오프 속도와 친화력 제로 힘 ⁽¹³⁾ 아래에 속도 2D 렌더링합니다.

형광 이미징 기능의 추가는이 시스템에서 세포 신호의 리드로서 사용되는 단일 세포의 세포 내 Ca2 ⁺ 수준의 모니터링을 허용한다. fBFP 실험 중에이 기능을 사용하기 위해서는, 하나는 ^칼슘 인디케이터 세포를 미리로드 할 필요가있다. Fura2-AM은 형광 염료가되는 경우, 340 nm 내지 380 nm의 여기하에 채널 같은 세포의 형광 이미지는 실험에 교대로 기록하고 분석 쌍별로 쌍을 피검. 강도 임계치는 셀 형상 (도 5) 배경 잡음을 제거하고 인식하는 각 채널의 형광 화상에 할당 하였다. 형광 이미지의 각 쌍의 비교 세포의 계산을 허용 ^칼슘 수준. 모두 340 nm의 아래 셀의 명확한 형광 이미지380 nm의 여기 채널 (그림 5A, B) ^칼슘 수준의 정확한 측정에 필요한, 무시할 수없는 배경 잡음과 가난한 이미지 편향된 결과가 발생합니다 (그림 5C)을 피해야한다.

⁺ 수준 동시에 셀과 기록 세포 칼슘에 제어 기계적인 자극을 도입함으로써, fBFP은 살아있는 세포에 - 기계 전달을 연구 할 수있는 강력한 단일 분자 도구를 제공합니다. 그것은 여기에 설명 된 플랫폼은 매우 다양한하다는 것을 주목할 필요가있다; 원칙적으로, 하나의 특정 목적에 적합하도록 셀에 힘을 가하는 동시에 원하는 다양한 시그널링 이벤트를 모니터링하는 다양한 방법을 설계 할 수있다. 힘 - 의존 정보는 운동 후 힘 조절 수용체 리간드 동력학, 시그널링 유도 및 그들의 상호 관계의 특성을 추출하기 위해 선택 신호 판독의 문맥에서 분석된다. TCR의 SIG의 예에서naling, 효능 별 TCR-pMHC 캐치 채권 먼저 발견 한 후 T 세포의 ^칼슘 이온 플럭스의 관련성은 ^(27)을 조사 하였다. 전략은 신호 판독이 유착의 수, 결합 힘 진폭, 평균 수명, 긴 수명 및 누적 포함한 다양한 운동 변수 중에서 최상의 예측기를 추구로서 ^칼슘 플럭스의 피크 값을 취하도록했다 순차적으로 형성 바인딩의 수명. T 세포들 (10 PN의 클램핑 력이인가)과 대응 ^칼슘 신호 곡선과 함께 자신의 축적을 동시에 기록 개별 본드 수명의 예가도 6에 보여진다. Ca2 ⁺ 수준의 10 초 결합 수명의 합을 축적하는 55 초에서 상승하기 시작하면이 경우, 네 수명 이벤트 시간 이전에 발생 하였다. 수명 축적 수준은 정규화 Fura2 비율의 피크 ^칼슘 신호를 트리거1.8의 65 초에서 발생하는. 많은 개별 셀로부터 수집 이러한 데이터의 체계적인 수학적 분석이 힘을 시그널링 수명 반복 TCR-pMHC 상호 작용의 1 ^{일 분에} 누적되어 ^{2 +} 칼슘의 가장 좋은 상관 관계가 (기술적 인 세부 사항에 대해 ²⁷ 참조 참조) 것으로 나타났다.

도 3 : 아니오 밀착성 이벤트 (A)의 예시적인 시간 - 힘 곡선 원시 데이터, 파열 력 이벤트 (B) 및 수명 이벤트 (C). 사이클의 다양한 단계와 해당 곡선 세그먼트는 각각 각 패널에 표시됩니다. 도 2c에 도시 된 바와 같이 힘 (Y- 축), 프로브 비드의 위치 변화를 추적으로부터 유도된다. () 아니오 접착 : 접촉 단계를 반환 T의 압축 (음)의 힘후진시 오 제로. (B) 파열 력 이벤트 : 인장 (포지티브) 힘이 후퇴 단계 동안 파열 RBC를 길게하는 수용체 - 리간드 결합을 통해 당긴다. (C)의 수명 이벤트 : 클램핑 힘에 도달 한 후, 해리 될 때까지 결합 지속. 수명 이벤트의 지속 기간이 나타난다. 파열 힘 이벤트 (B) 및 수명 이벤트 (C)의 시작은 별표로 강조 표시됩니다.

그림 4 :. "힘 대 평균 수명은"OT1 T 세포의 곡선은 작용제 OVA (녹색) 및 길항제 G4 (파란색)과 상호 작용하는 풀링 된 데이터는 다른 힘 쓰레기통으로 분류, 평균 채권 수명의 SEM은 ± 있습니다 힘 대 꾸몄다.

도 5 :. 두 파장에서 여기되는 대표적인 ^칼슘 이미지 (A는, B) T 세포의 정확한 영상 인식은 포인트 - 투 -에 기초하여 340 nm의 (A)와 380 nm의 (B) 채널에서 (적색으로 표시) 제대로 할당 강도 임계 값을 사용하여 선별 가리 킵니다. 열악한 Fura2 하중, 340 nm의 여기에 채널 (적색 표시) T 세포의 형광 이미지를 인식하는 (C) 무능력.

그림 6 : "세포 내 Ca2 ⁺ 수준의 대 시간 (상대 Fura2 비율)"과 OT1 T 세포의 곡선 "시간 대 누적 수명"의 중첩 영상 생성반복적 삼백초 위에 OVA 코팅 비드로 T 세포를 터치하여 D. (A) 비 접착 파열 력, 및 시간 경과에 반복 접촉에 의해 발생 수명의 이벤트 시퀀스를 나타내는 힘 곡선. (B) 다른 시점에서 T 세포에서 세포 내 ^칼슘 신호의 에피 형광 의사 - 컬러 이미지. Ca2 ⁺ 수준의 정상화가 오른쪽의 의사 - 컬러 스케일로 표시된다. ^칼슘 곡선 신호 (적색)과 같은 시간 경과에 누적 수명 곡선 (노란색)의 (C) 중첩 영상. ^칼슘 곡선은 ^칼슘 이미징을 기반으로 꾸몄다했다. ^칼슘 이온 플럭스는 정규화 Fura2 비율의 급격한 상승에 의해 표시된다. ^칼슘은 피크 도달 시간은 점선으로 표시된다. 각 수명 이벤트의 시작 시간이 누적 수명 곡선 (실선 삼각형)에 표시된다.

성공적인 fBFP 실험은 몇 가지 중요한 고려 사항을 수반한다. 힘의 계산이 신뢰할 수있는 위해 첫째, 마이크로 피펫, RBC, 프로브 비드가 가능한 동축에 가깝게 정렬되어야합니다. RBC 및 피펫 사이의 마찰을 무시할 수 있도록 피펫 내부 RBC의 투영 약 1 프로브 피펫 직경이어야한다. 전형적인 사람 RBC 들어, 최적 피펫 직경 ^17,30 식 1의 최적을 산출 2.0-2.4 ㎛ 인 것이다. 둘째, 힘 클램프 분석 및 열 변동 분석에서 측정이 단일 결합에 대한 대부분입니다 보장하기 위해, 20 %가 아래의 접착 주파수는 ^10,13,30를 유지한다. 여기서, 비 특​​정 유착 신중 (BSA 충분한 차단 통상 <5 %)을 제어한다. 또한, 데이터는 단일의 힘 - 드롭 접착 이벤트 수집한다 - 단일 단계 실종 단일 분자 거동의 특징 (유사한단일 분자에 형광) FRET. 형광 염료의 셋째, 부하 농도가 최상의 영상 품질을 달성하기 위해 경우에 따라 최적화되어야한다. 넷째, T 세포 또는 관심의 다른 세포에 염색로드의 독성은주의 깊게 각 실험 전에 검사 할 필요가있다. 예를 들어, 염료 로딩시 수용체 - 리간드 상호 작용의 결합 친화력은 염료로드하지 않고 그에게 측정하고 비교해야합니다. 결합 친화도가 로딩 염료 극적으로 인해 변경되는 경우, 다른 염료 또는 다른 로딩 농도로 간주되어야한다. 다섯째, 말기 비오틴 - 태그 단백질은 단백질의 기본 방향을 유지, 편리한 특정, 강한 결합을 허용하는 것이 바람직하다.

fBFP의 주요 장점은 그것이 하나의 셀에 단일 결합 분석을 수행한다는 것이다. 낮은 처리량에도 불구하고, 단일 결합 분석은 종종 기존의 앙상블 날에 의해 액세스 할 수없는 중요한 기능을 폭로thods. 예를 들어, 각 빈에서의 힘 수명 분포를 검사함으로써, 하나의 ^힘을 변경 ^20,32 단백질 입체 형태를 조절하는 방법에 대한 통찰력을 제공하는 단백질 구조적 상태와 상이한 결합 특성을 상관있다. BFP도 ^20,21 단백질 구조적 ^역학을 조사하는데 사용될 수있다 후퇴상의 힘과 압전 변환기 변위 데이타, 분자량에서의 강성을 측정하는 데 사용될 수있다.

많은 방법은 수용체 매개 세포 부착 및 신호 전달을 연구하기 위해 개발되었다. 수용체 - 리간드 결합 동력학은 일반적으로 셀룰러 환경으로부터 완전히 격리에서 재조합 단백질로 측정된다. 이러한 관행은 잠재적으로 문제가있다. 예를 들어, 최근 급격히 수용체 #의 새로운 통찰력을 드러내는 대응 재조합 단백질 ^(14)를 사용하여 측정이 다르다 생균 측정하는 인 시츄 반응 속도를 도시 한8217;의 세포 기능. 뿐만 시츄 수용체 리간드 동력학을 정량화 할 fBFP하지만 더 중요한 것은 동시에 결합 - 유도 세포 신호를 기록 할 수있다. TCR ^(27), fBFP 자신의 관계를 분석하고 - 기계 전달의 분자 메커니즘을 이해하기위한 전례없는 기회를 제공하여 얻은 시그널링 풍부한 결합 특성 정보와 셀에 대한 증명으로. 그것은 fBFP 다른 중요한 수용체 리간드 시스템에서 더 많은 응용 프로그램을 찾을 가능성이 높습니다.

The authors have nothing to disclose.

Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.