Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Interactions récepteur-ligand à membrane médiation de nombreuses fonctions cellulaires. Cinétique de liaison et la signalisation en aval déclenchée par ces interactions moléculaires sont probablement affectés par l'environnement mécanique dans lequel la liaison et de signalisation ont lieu. Une étude récente a montré que la force mécanique peut réguler reconnaissance de l'antigène et par le déclenchement du récepteur des cellules T (TCR). Ceci a été rendu possible grâce à une nouvelle technologie développée et la fluorescence Qualifié de sonde de force de biomembrane (FBFP), qui combine la spectroscopie de force seule molécule avec la microscopie de fluorescence. Utiliser une cellule ultra-doux rouge sang humain comme le capteur de force sensible, une caméra à haute vitesse et en temps réel des techniques de suivi de l'imagerie, l'FBFP est de ~ 1 PN (10 ^-12 N), ~ 3 nm et ~ 0,5 ms en vigueur, la résolution spatiale et temporelle. Avec la FBFP, on peut mesurer précisément la cinétique simples de liaison récepteur-ligand en vertu du règlement de la force et cal intracellulaire simultanément l'image-liaison déclenchécium de signalisation sur une seule cellule vivante. Cette nouvelle technologie peut être utilisée pour étudier une autre interaction et la signalisation du récepteur-ligand membrane dans d'autres cellules sous régulation mécanique.

Cellule à cellule et cellule-matrice extracellulaire à (ECM) est médiée par l'adhérence de liaison entre les récepteurs de surface cellulaire, des protéines de l'ECM, et / ou des lipides ^1. Reliure permet cellules pour former des structures fonctionnelles ^1, ainsi que de reconnaître, de communiquer, et réagissent à l'environnement ^1-3. Contrairement aux protéines solubles (par exemple, cytokines et facteurs de croissance) qui se lient à partir d'un à trois dimensions (3D) en phase liquide sur les récepteurs de surface cellulaire, des récepteurs d'adhésion cellulaire forment des liaisons avec leurs ligands à travers une fente de jonction étroit pour combler deux surfaces opposées qui limitent moléculaire diffusion dans une dimensions (2D) Interface ^7.4 deux. Contrairement à la cinétique 3D qui sont couramment mesurée par des tests de liaison traditionnels (par exemple, la résonance plasmonique de surface ou SPR), la cinétique 2D ont être quantifiés avec des techniques spécialisées telles que la microscopie à force atomique (AFM) ^8-10, chambre ^11,12 couler, ^13,14 micropipette, optiquepincettes ¹⁵ et sonde de force de biomembrane (BFP) ^16-21.

Plus que de simplement fournir liaison physique pour la cohésion cellulaire, des molécules d'adhésion sont une composante majeure de la machinerie de signalisation de la cellule pour communiquer avec son environnement. Il ya eu un intérêt croissant pour comprendre comment l'engagement ligand de molécules d'adhésion initie la signalisation intracellulaire et comment le signal initial est transduit intérieur de la cellule. Intuitivement, propriétés de liaison récepteur-ligand peut influer sur les signaux qu'il induit. Cependant, il est difficile de disséquer les relations mécanistes entre l'interaction extracellulaire et des événements de signalisation intracellulaire utilisant ensemble traditionnel des essais biochimiques en raison de leurs nombreuses limites, par exemple, une résolution temporelle pauvres et l'absence totale de la résolution spatiale. Des méthodes qui permettent à la fois biophysique (2D cinétique liaison récepteur-ligand) et biochimiques (signalisation) des observations sur direct existantcellules comprennent des substrats de rigidité accordable ^22, élastomère tableaux pilier ²³ et dispositifs chambre d'écoulement / microfluidiques intégrés avec une capacité de fluorescence ^24-26. Cependant, des lectures de signalisation et de liaison au récepteur-ligand doivent être obtenus séparément (le plus souvent par des méthodes différentes), ce qui rend difficile de disséquer les relations temporelles et spatiales des caractéristiques d'adhérence avec les événements de signalisation.

BFP classique est une spectroscopie de force à la résolution spatio-temporelle ultrasensible haute ^17. Il utilise une cellule souple rouge sang (RBC) comme un capteur de force, ce qui permet la mesure de la cinétique d'une seule molécule 2D, les propriétés mécaniques et les changements de conformation ^{14,16,19-21,27-29.} Un BFP basée imagerie de fluorescence (FBFP) corrèle la cinétique de liaison récepteur-ligand avec la signalisation cellulaire de liaison déclenché à l'échelle de molécule unique. Avec cette configuration, à des activités de signalisation de cellule in situ dans le cadre de méca de surfacecal stimulation a été observée dans les lymphocytes T ^27. Le FBFP est polyvalent et peut être utilisé pour des études de l'adhésion cellulaire et de la signalisation à médiation par d'autres molécules dans d'autres cellules.

Ce protocole suit les directives de et a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche humaine de l'Institut de technologie de Géorgie.

1. hématies humaines isolement, Biotinylation et osmolarité Ajustement

Note: Etape 1.1 doit être effectuée par un professionnel, comme une infirmière médical qualifié, avec un Institutional Review Board protocole approuvé.

1. Obtenir 8-10 pi (une goutte) de sang du bout du doigt et ajouter à 1 ml de tampon carbonate / bicarbonate (tableau 1 et 2). Vortexer doucement ou d'une pipette le mélange et centrifuger pendant 1 min à 900 x g. Rejeter le surnageant et laver une fois de plus.
2. Dans un petit bêcher peser 3,5 à 4 mg de biotine-NHS-PEG3500 lieur (tableau 1). Dissoudre dans le tampon de carbonate / bicarbonate de rendre la concentration finale de 3 mg / ml.
3. Mélanger 171 pi de tampon carbonate / bicarbonate, 10 pi de paquet RBC et 1049 pi deLa biotine-NHS-PEG3500 solution de liaison et mettre en incubation à température ambiante pendant 30 min. Laver une fois avec le RBC tampon carbonate / bicarbonate et ensuite deux fois avec du tampon N2-5% (Tableau 1 et 2).
4. Pendant ce temps, placer la bouteille de liaison avec bouchon dévissé dans un dessiccateur à vide en verre rempli d'agents desséchants dans le fond et le vide pendant 5 min, et remplissez le dessiccateur avec de l'argon. Serrer le bouchon et de prendre la bouteille. Sceller la bouteille avec un film de paraffine plastique (tableau 1), le placer dans un récipient rempli d'agents desséchants sur le fond et la ranger dans -20 ° C.
   Remarque: Les étapes qui impliquent l'utilisation de biotine-NHS PEG3500-linker, y compris 1.2-1.4 (sauf pour l'incubation et laver à 1.3), doivent être effectuées aussi vite que possible.
5. Diluer nystatine dans le tampon de N2-5% pour obtenir une concentration finale de 40 pg / ml. Mélanger 5 ul de RBC biotinylé avec 71,4 ul de la nystatine (tableau 1) et on incube la solution pendant 1 heure à 0 &# 176; C. Laver deux fois avec N2-5% de tampon et de magasin avec N2-5% de tampon + 0,5% de BSA (tableau 1) dans le réfrigérateur (4 ° C).

2. Glass Bead Silanisation

1. Nettoyage des perles Surface
   1. Peser 50 mg de billes de verre en poudre et remettre en suspension dans 500 ul eux d'eau DI.
   2. Mélanger 0,5 ml de 30% de H ₂ O ₂ (tableau 1) avec 9,5 ml d'eau désionisée dans un bêcher de 50 ml, puis ajouter 2 ml de _NH4OH concentré (tableau 1) et porter cette solution à une chaudière sur une plaque chaude .
   3. Ajouter les perles de verre à la solution bouillante et continuer à faire bouillir pendant encore 5 min. Mélanger doucement la solution tous min.
   4. Après ébullition, transférer ~ 5 ml de cette suspension de billes chaud dans un tube de 15 ml de micro-centrifugeuse et le haut avec de l'eau DI RT. Centrifuger à 3500 g pendant 5 min, retirer et jeter le surnageant.
   5. Transfert encore 5 ml de suspension de billes chaude et ajouter aux billes lavées, Compléter avec plus d'eau DI, bien mélanger et centrifuger à nouveau. Répétez cette procédure jusqu'à environ 50 ml d'eau DI est utilisé, ce qui sera un total de 4 à 5 fois de lavage.
   6. Transférer la suspension de billes dans un flacon de 1 ml. Répéter le lavage des billes avec du methanol (tableau 1) par centrifugation à 17 000 xg pendant 5 min à 3 heures, et enfin remettre en suspension les billes dans 1 ml de methanol à 100%.
2. Perle Surface Thiolation
   1. Pour un tube à centrifuger de 50 ml d'ajouter 45,6 ml de methanol, 0,4 ml d'acide acétique (tableau 1), 1,85 ml d'eau désionisée, 1,15 ml de 3-mercaptopropyltriméthoxysilane (MPTMS) (tableau 1) et 1 ml de perles suspension préparée à 2,1, puis incuber à température ambiante pendant 3 h.
   2. Après la réaction, enlever tous les réactifs en lavant une fois avec du méthanol frais, et remettre en suspension les perles dans 500 ul de méthanol. Répartir cette suspension de billes de verre concentrée en un ensemble de 20 flacons de verre sèches et propres avecles bouchons. Evaporer le méthanol à l'aide d'un jet d'argon sec et faire tourner lentement les flacons de façon à rendre une mince couche de perles sèches sur les côtés de chaque flacon.
   3. Placez les flacons de perles dans un four de séchage préchauffé à 120 ° C pendant 5 min puis sortez et rapidement placer le bouchon (s) lâchement sur. Placer les flacons dans un dessiccateur sous vide en verre rempli d'un dessiccant dans le fond et le dessiccateur sous vide avec une pompe à vide jusqu'à refroidissement.
   4. Purger le dessiccateur aspirateur d'argon sec pour apporter le dessiccateur à la pression atmosphérique normale. Retirez le couvercle du dessiccateur et rapidement re-serrer le bouchon (s) sur le flacon. Sceller les fioles avec un film de paraffine en plastique et de les stocker à température ambiante dans une boîte de stockage sec et sombre.
   5. Lors de l'utilisation immédiate, prendre un flacon de perles sèches et laver une fois avec un tampon phosphate (tableaux 1 et 2), remettre en suspension dans 50 pi de tampon phosphate et conserver à 4 ° C. Cette préparation de perles concentré sera désignécomme des «perles de MPTMS" dans les étapes suivantes.
      Remarque: Avec un stockage, une des perles de MPTMS pourraient rester fonctionnel pour un maximum de trois mois.

3. Perle fonctionnalisation

1. Revêtement de manière covalente protéines sur des billes
   1. Prenez un certain volume (par ex, 2,5 pi) de la protéine stock et mélanger avec un volume égal de tampon carbonate / bicarbonate de faire Solution 1.
      Remarque: le volume dépend de la concentration des stocks et la densité des sites finale souhaitée de la protéine sur la surface des perles.
   2. Dans un petit bêcher peser 2-3 mg de MAL-PEG3500-NHS lieur (tableau 1) et dissoudre avec du tampon carbonate / bicarbonate pour atteindre une concentration finale de 0,231 mg / ml.
   3. Mélanger une solution avec un volume égal de la solution de liant préparé en 3.1.2. Incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes pour faire la solution 2.
   4. Pendant ce temps, placer la bouteille de liaison avec bouchon dévissé dans le vide de verre dessiccateur filled avec desséchants dans le fond et le vide pendant 5 min, et remplissez le dessiccateur avec de l'argon. Serrer le bouchon et de prendre la bouteille. Sceller la bouteille avec un film de paraffine en plastique, placez-le dans un récipient rempli d'agents desséchants sur le fond et la ranger dans -20 ° C.
      Remarque: Les étapes qui impliquent l'utilisation de MAL-PEG3500-NHS linker, y compris 3.1.2-3.1.4 (sauf pour l'incubation en 3.1.3), doivent être accomplis, aussi vite que possible.
   5. Mélanger 5 ul de MPTMS perles avec la solution 2 et ajouter un tampon au phosphate (tableau 1) pour obtenir un volume final de 250 ul.
   6. Incuber les perles nuit à température ambiante, laver 3 fois avec un tampon phosphate, et remettre en suspension dans 100 pi de tampon phosphate et conserver à 4 ° C.
2. Protéines Préparation / Perles streptavidine (SA) revêtus
   1. Suivre le protocole 3.1.1-3.1.4.
   2. Mélanger 5 ul de MPTMS perles avec la solution 2 et 5 ul de 4 mg / ml de streptavidine-maléimide (MAL-SA) (tableau 1) Solution et puis ajouter un tampon phosphate pour obtenir un volume final de 250 pi.
   3. Incuber les perles nuit à température ambiante, laver 3 fois avec un tampon phosphate, et enfin remettre en suspension dans 100 pi de tampon phosphate et conserver à 4 ° C.
3. Revêtement Streptavidin sur Perles de verre
   1. Mélanger 5 ul de billes MPTMS avec 5 pi de 4 mg / ml, solution SA et ajouter 140 pi de tampon phosphate.
   2. Incuber les perles nuit à température ambiante, laver 3 fois avec un tampon phosphate, et remettre en suspension dans 50 pi de tampon phosphate et conserver à 4 ° C.
4. Le revêtement des Perles SA revêtue d'une protéine biotinylée
   1. Mélanger 5 ul de billes revêtues avec la protéine SA (volume en fonction de la densité souhaitée de revêtement) et ajouter un tampon phosphate pour obtenir un volume final à 100 ul soit.
   2. Incuber le mélange pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 3 heures à température ambiante, laver 3 fois avec un tampon phosphate, et re-suspension dans 50 ul phosphate tampon et stocker à 4 ° C.

4. Préparation des cellules

Remarque: Pour purifier les cellules, suivre les protocoles de purification de cellules standards correspondant au type de cellules dans l'utilisation, par exemple les cellules T ²⁷ ou certaines lignées cellulaires ^21,29.

1. Pour les expériences FBFP, une fois que la suspension de cellules est préparé, ajouter Fura2-AM (Tableau 1) dissous dans du DMSO dans la suspension de cellules pour atteindre une concentration finale de 2 uM, incuber pendant 30 min à température ambiante, puis laver une fois. Gardez cette suspension cellulaire par fluorescence chargé dans l'obscurité jusqu'à utilisation.

5. Préparation pour Micropipettes et une Chambre cellulaire

1. Préparation Micropipettes
   1. Tubes Coupe longue capillaires de verre (Tableau 1) avec un coupe-verre en petits morceaux d'environ 3 pouces de longueur. Monter une pièce sur l'extracteur micropipette (tableau 1), cliquez sur le "Pull" maistonne sorte que le milieu du capillaire sera chauffée par la machine et le capillaire sera tiré sur les deux extrémités de faire deux capillaires avec des bouts pointus (micropipettes premières).
      Remarque: En suivant la ligne directrice de produit, la morphologie souhaitée de la pipette brute a 6-8 mm cône et 0,1-0,5 um pointe.
   2. Monter une pipette brut sur ​​le support de pipette de la forge de micropipette (tableau 1). Chaleur pour faire fondre la sphère de verre sur la forge. Insérer la pointe de la pipette cru à l'intérieur de la sphère de verre. Refroidir la sphère de verre et tirez la pipette brute pour casser de l'extérieur et de laisser sa pointe à l'intérieur de la sphère. Répétez cette procédure jusqu'à ce que l'orifice de la buse désirée est obtenue.
      Remarque: Les exemples d'un diamètre intérieur de la pointe de micropipette: 2,0-2,4 um pour un RBC, ~ 1,5 um pour une perle, ~ 2-4 pm pour une cellule T et -7 um pour une cellule d'hybridome.
2. Construire une chambre de la cellule
   Remarque: la chambre de cellule est construit sur la base d'une maison-foue chambre titulaire, qui se compose de deux pièces d'équerres métalliques (cuivre / aluminium) et d'une poignée qui les relie entre eux (figure 1D).
3. Coupez un 40 mm x 22 mm x 0,2 mm lamelle en utilisant un coupe-verre en deux morceaux de 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (lamelle 1 et 2). Colle lamelle couvre-1 par de la graisse sur le côté supérieur de la porte de la chambre dans la façon dont il relie les deux équerres métalliques, et de même lamelle colle 2 à la face inférieure, qui forme une chambre de cellule parallèles lamelle (Figure 1D).
4. Utiliser une pipette pour injecter 200 ul de tampon expérimental entre les deux lamelles. Assurez-vous que le tampon attache à deux lamelles. Tournez doucement et agiter la chambre de laisser le tampon toucher les deux extrémités de la chambre.
5. Injecter délicatement l'huile minérale dans les deux côtés de la chambre flanquant la zone tampon expérimentale scellant ainsi le tampon de l'air. Injecter des suspensions de perles de sonde (par exemple, des perles pMHC-couché), les globules rouges et les cibles(par exemple, des cellules T) dans les régions supérieure, intermédiaire et inférieure de la zone tampon, respectivement.

6. expérience BFP

Figure 1: assemblage FBFP (A) Un aperçu de l'image du système matériel FBFP.. (B) Un dessin schématique du système de matériel FBFP. (C) Le système dual-cam "DC2" (orange) sur lequel la caméra à grande vitesse (bleu) et un appareil photo de fluorescence (blanc) ont été montés. (D) de la platine du microscope qui adapte une chambre d'essai et trois systèmes de manipulation de micropipette. Des micrographies de réglage BFP dans une chambre expérimentale (E et F). (E) Micropipettes montrant l'assemblage de la pipette de la sonde (à gauche), cible pipette (en haut à droite) et aide pipette (r inférieureroite). (F) Sonde placement de perles. Un cordon de sonde a été manipulé par une pipette d'aide et attaché à un sommet RBC pour former une sonde de force. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Allumez le microscope (tableau 1) et la source lumineuse. Placez la chambre sur la scène principale du microscope (figure 1A, D).
2. Installez les trois micropipettes de BFP (figure 1D Gauche:. Sonde, pour prendre un RBC, à droite: cible, pour saisir une cellule ou une perle, en bas à droite: aide, pour saisir une perle).
   1. Utilisation d'un micro-injecteur (tableau 1) pour remblayer une micropipette avec un tampon expérimental. Enlevez le porte-pipette (tableau 1) et maintenez-le à une place inférieure pour permettre de gouttes d'eau à partir de la pointe. Insérer rapidement la micropipette dans la pointe de support et assurez-vous qu'aucune bulle d'air pénètre dans la micropipetteau cours de l'insertion. Serrer la vis du support.
   2. Montez chaque titulaire de la pipette sur son micro-manipulateur correspondant. Pousser la micropipette vers la chambre de sorte que leurs conseils entrent dans la zone tampon de la chambre. Ajustez la position de la micropipette et les trouver sous le champ de vision du microscope.
3. Déplacez-vous dans l'étape de support de chambre pour trouver les colonies de trois éléments (les globules rouges, les objectifs et les perles de sonde) un par un. Ajustez la position de la micropipette correspondante en tournant les boutons des manipulateurs de laisser la pointe de l'approche de micropipette une cellule / perle. Aspirer la cellule / perle en ajustant la pression à l'intérieur de la micropipette correspondant. Tous trois seront micropipettes capturer leurs éléments correspondants.
4. Déplacez-vous dans l'étape de support de chambre pour trouver un espace ouvert loin des colonies des éléments injectés où l'expérience sera effectuée. Mettez le mode visuel de microscope pour visualiser l'image sur l'échantillonprogramme uter sur l'écran de l'ordinateur. Déplacer tous les trois éléments sur les embouts de pipette dans le champ de vision du programme.
5. Alignez le cordon de sonde et RBC, et manœuvrer avec précaution le cordon de la sonde à l'apex de la RBC, empiéter brièvement la perle sur la RBC et doucement se rétracter. Régler la pression de la micropipette d'aide pour souffler doucement le cordon loin, de sorte qu'il sera laissé collé sur le sommet RBC (figure 1F). Eloignez-vous de la micropipette d'aide et aligner la cible et de la sonde talon (figure 2A).

Figure 2:. Régime BFP et son cycle d'essai (A) Vidéo-micrographie illustrant une sonde de force (à gauche) et un T-cellule cible (à droite) aspiré par leur capteur de force stationnaire respective pipettes.The se compose d'un RBC gonflé et un joint ligand portant bourrelet. Le récepteur palier-Des cellules T (cible) est monté sur une face de translation piézo-électrique aligné à la sonde. Le retour sur investissement est indiquée en vert. Le tracker de bord est indiqué dans une ligne bleue. L'insert montre le ligand (pMHC, côté talon) et le récepteur (TCR, côté T-cellules) paire sur les deux surfaces opposées dans la zone marquée en orange. (B) Le profil d'intensité de bord de bourrelet (A). La région de ROI dans la direction- x est tracé comme axe des x (en nombre de pixels) et l'intensité lumineuse (en valeur d'échelle de gris) en moyenne par binning 30 pixels sur l'y direction-. (C) La déviation du RBC et la position de la bille et la cible (cellules T) dans un cycle d'essai de dosage force de serrage. Les lignes pointillées verticales et horizontales indiquent la position de l'apex RBC et le déroulement dans le temps zéro de la force, respectivement. Le tracker de bord de ligne de la déformation RBC est représenté en bleu dans chaque panneau. Les mêmes encore moins d'étapes sont adoptées dans la fréquence d'adhérencetest (qui n'a pas les étapes de "serrage" et "dissocier") et le dosage de fluctuation thermique (qui manque l'étape de "dissocier").

6. Dans le programme, dans la fenêtre de champ de vision en utilisant les outils dans le programme pour mesurer les rayons respectifs de la micropipette de sonde (R _p), le RBC (R _0), la zone de contact circulaire entre la RBC et sonde bourrelet (R _c) , qui permet l'estimation de la constante de ressort de la RBC (k) par l'équation suivante ^17,30,
   
   
   Δ où p est la pression d'aspiration à l'extrémité sonde de pipette.
   
   Remarque: Il résulte de la loi de Hooke ce que la force de liaison, F, peut être quantifiée par le produit de la constante de ressort et le déplacement de la bille de palpage (d), soit, F = d (Figure 2C).
7. Entrez la constante souhaitée de printemps RBC dans le programme (S'il vous plaît se référer au chapitre Protocole 6.6. La constante de ressort est généralement fixé à 0,25 ou 0,3 PN / nm pour le test de fréquence de dosage vigueur pince et l'adhérence et 0,1 PN / nm pour le test de fluctuation thermique) , qui renvoie une pression d'aspiration nécessaire dans l'unité de centimètres d'eau. Ajustez la hauteur du réservoir d'eau qui relie à la pipette de la sonde jusqu'à ce que la pression d'aspiration souhaitée est atteinte.
8. Tracez une ligne horizontale à travers le sommet de RBC, qui donnera une courbe dans la fenêtre adjacente indiquant la luminosité (valeur d'échelle de gris) de chaque pixel le long de cette ligne. Faites glisser la ligne de seuil pour être à peu près la moitié de la profondeur de la courbe (figure 2A, B).
   Remarque: Le point minimum de la courbe de luminosité en dessous de la ligne de seuil indique la position de la limite de perles, ainsi qu'un minimum local est autorisé. Si deux ou plusieurs minima locaux sont à l'heure actuelle, ilindique que l'image est pas optimale (probablement en raison de l'image étant hors du foyer, ou d'un mauvais alignement entre le bourrelet de la sonde et la RBC).
9. Sélectionnez le mode d'expérience souhaitée: test de fluctuation thermique, l'adhérence analyse de fréquence ou de dosage force de serrage. Définissez les paramètres comme désiré (par exemple, la force d'impact = 15 pN, le taux de charge = 1000 PN / s, temps de contact = 1 sec, la force de serrage = 20 PN (pour le dosage de serrage de la force), etc.).
   1. Cliquez sur "Démarrer", qui permet au programme de déplacer la pipette cible et conduire la cible dans et hors de contact avec la sonde (voir la section Les résultats représentatifs pour plus de détails). La collecte des données est effectuée en parallèle, qui enregistre la position du cordon de sonde en temps réel. Arrêtez le programme en cliquant sur le bouton "Stop expérience», date à laquelle une fenêtre va sortir pour permettre la sauvegarde des données acquises.

7. Fluorescence BFP (FBFP) expérience

1. Pour utiliser le Fluorescence fonction du système BFP, allumer la source de lumière d'excitation (tableau 1) et la caméra à fluorescence (tableau 1), qui sont commandés par un programme distinct (tableau 1). Au programme, sélectionnez les paramètres pour l'imagerie de fluorescence, y compris le gain, l'exposition, les canaux d'excitation (dans ce cas, 340 nm et 380 nm lumière), etc. Suivez toutes les préparations dans le protocole expérimental BFP, y compris l'alignement de la sonde et la cible, ce qui permettra pour la visualisation de l'image fluorescente en direct de la cellule cible excité par 340 nm ou 380 nm excitation lumineuse.
2. Utilisez l'outil de découpe à peu près la section la zone dans laquelle la cellule restera au cours de la période d'enregistrement.
   Remarque: En raison de l'utilisation du cycle approche contact-rétraction, la cellule sera en mouvement vers l'avant et vers l'arrière de façon répétitive, ainsi la zone en coupe est beaucoup plus grande que la cellule elle-même.
3. Cliquez sur «Enregistrer» pour permettre à l'un de 340 nmd 380 nm lumière pour exciter alternativement le colorant fluorescent intracellulaire (Fura2), et une paire d'images de fluorescence correspondant sera alternativement enregistré environ une fois par seconde. Simultanément cliquez sur "Démarrer" dans le programme pour commencer l'expérience BFP pour l'interaction moléculaire de l'analyse et de l'expérience de l'imagerie de fluorescence pour surveiller la signalisation du calcium intracellulaire. Le système produira un fichier de données brutes pour la liaison récepteur-ligand (voir la figure 6A ci-dessous) et une série d'images fluorescentes en format .tiff pour les signaux de calcium.

8. Analyse des données

1. Analyse BFP données
   1. L'analyse des données pour l'analyse de la fréquence d'adhérence
      1. Inspecter séquentiellement "force en fonction du temps" le signal de chaque cycle et simplement enregistrer cycles qui contiennent un événement d'adhérence et qui ne le font pas, et résument pour obtenir une fréquence moyenne d'adhérence.
      2. Recueillir la force de rupture de chaque événement d'adhérence, quiest la valeur de crête de la force linéaire rampe avant obligataire rupture. Après avoir recueilli une quantité suffisante de forces de rupture dans une fourchette de taux de rampe, dériver la répartition de la force de rupture à chaque taux de rampe à partir de laquelle est dérivée la force dépendant hors vitesse de dissociation du récepteur-ligand en utilisant la force dynamique analyse par spectroscopie ^18,31.
   2. L'analyse des données pour l'analyse de fluctuation thermique
      1. Inspecter séquentiellement le signal de phase de chaque cycle de serrage, qui contient probablement plusieurs association et de dissociation liaison événements. Utiliser le niveau de fluctuation thermique en phase serrage (l'écart-type moyen d'un intervalle glissant de 70 points temporels séquentiels de la position de la bille) dans la "force en fonction du temps" de signal en tant que guide pour distinguer les événements d'association et de dissociation liaison, depuis une liaison formation correspond à une diminution de la fluctuation thermique.
      2. Désigner l'intervalle entre le moment de la dissociation de la liaison (lorsque le therfluctuation mal reprend au niveau normal) à l'instant de la prochaine formation d'une liaison que le temps d'attente, et de désigner la durée de la liaison de son association à la dissociation que la durée de vie des obligations, qui sont tous deux recueillis lors de l'inspection des données. Calculer le temps moyen d'attente et la durée de vie moyen des obligations, qui reflètent respectivement l'inverse de sur-taux et celle de taux hors sous zéro vigueur ^16,30.
   3. L'analyse des données pour l'analyse force de serrage
      1. paramètres d'enregistrement de tous les événements de vie, y compris la force moyenne et la durée de la liaison avec le numéro de séquence ainsi que l'heure de début et l'heure de fin, ce qui permettra de dessiner une courbe cumulative à vie (par exemple, la figure 6C, la courbe jaune).
      2. Prélever une quantité suffisante d'événements de vie dans une gamme de forces. Regroupez-les dans des bacs différents de force, qui va produire une durée de vie moyenne dans chaque bac de la force, et le rendement tout à fait un «durée de vie moyenne vs. vigueur "courbe (Figure 4).
2. fluorescence de calcium Analyse des données d'imagerie
   1. Réglez le seuil d'intensité jusqu'à ce que les images de fluorescence montrent un contour clair de la cellule dans les deux canaux 340 nm et 380 nm, sans bruit de fond (figure 5A, B). Ensuite, examiner le Ca ²⁺ trame de signal intracellulaire par image avec un pseudo couleur indiquant le niveau d'intensité (figure 6B), qui est dérivée basée sur le rapport d'intensité de 340 nm / 380 nm, pour générer le "Ca ²⁺ intensité normalisée vs . courbe de temps "(Figure 6C). Utilisez les images de fluorescence pseudo-couleur pour produire un film qui affiche le deuxième taux de fluorescence par seconde.

La technique BFP a été mis au point par le laboratoire Evans à 1995 ^17. Cet outil de picoforce a été largement utilisé pour mesurer les interactions de protéines immobilisées sur des surfaces, de manière à analyser la cinétique à deux dimensions de molécules d'adhérence interagissant avec leurs ligands ^{16,19,20, 30,} pour mesurer l'élasticité moléculaire ^21,29, et de déterminer la protéine de conformation change ^21. Pour un FBFP, un ensemble supplémentaire de dispositifs liés à épi-fluorescence avec le système de logiciel correspondant (tableau 1) est ajouté (Figure 1A - C).

Le système se compose d'un FBFP système matériel (composants optiques, mécaniques et électriques) et un système logiciel (tableau 1 et figure 1A, B). Un microscope inversé (Figure 1A, milieu) avec des composants optiques permettant fond clair et par microscopie d'épifluorescence constitue le corps principal dele système FBFP, sur laquelle l'étape de l'expérience et les manipulateurs de pipettes sont montés. Dispositif de commande de source de lumière de fluorescence (figure 1A, un coin supérieur gauche) est utilisé pour délivrer en alternance lumières d'excitation. Un système de double-cam "DC2" divise la lumière en deux et les transmet à une caméra haute vitesse (bleu) et un appareil photo de fluorescence (blanc) (Figure 1A, coin inférieur gauche). Le premier recueille l'image de la sonde pour la détermination de position et celui-ci recueille des images de fluorescence émis à partir de la cellule cible à deux longueurs d'onde. L'expérience est surveillé et contrôlé par deux ordinateurs dont Host PC 1 (figure 1A, coin supérieur droit, les images découpées dans l'image en raison de la limitation de l'espace) est connecté à l'appareil photo à haute vitesse et la caméra de fluorescence et est responsable de l'exécution de l'expérience et l'acquisition de données, et le PC hôte 2 est relié à la caméra de surveillance et la responsabilité de présenter une vue complète de l 'expérience BFPment (figure 1A, B).

Lors d'une expérience, l'expérimentateur utilise trois micropipettes à saisir et manipuler des cellules et des microsphères respectivement (figure 1E, F). Une image d'une expérience typique BFP est constitué d'un capteur de force, qui est assemblée par un cordon de fixation de la sonde sur le sommet d'un RBC aspiré, et une cellule cible / bille (figure 2A). Une région d'intérêt (ROI), qui contient la zone de bord du bourrelet sur le RBC apex, est suivi par une caméra à vitesse rapide (2000 fps) à surveiller la déformation de la RBC en temps réel. Le déplacement suivi de la perle peut ensuite être utilisé pour calculer la force externe exercée sur la sonde de force (voir la note à la section Protocole 6.6), compte tenu de la constante de ressort du BFP (figure 2A, B).

Adhérence test de fréquence, le dosage de fluctuation thermique, et le dosage force de serrage sont les trois modes expérimentaux couramment utilisés sur un système BFP. Par annonceoptant un de ces trois modes, une expérience BFP est composé de cycles d'essais répétés qui sont exécutées séquentiellement.

En essai de la fréquence de l'adhérence, se rapproche de la cible et en contact avec le bourrelet de la sonde à un temps de contact donné (par exemple, 1 s) et se rétracte en arrière directement à la position d'origine et de commencer le cycle suivant. Un événement d'adhésion se traduit par un signal de force de traction pendant la phase de rétraction. Ce cycle approche contact-rétraction est répété 50 fois pendant au moins 3 paires cible-sonde pour calculer une moyenne SEM de la fréquence d'adhérence, P _a.

Test de fluctuation thermique est utilisé pour les mesures de durée de vie sous zéro vigueur. Dans chaque cycle, après avoir touché le cordon de sonde, la cible est rétractée à la position zéro et la force de serrage en contact avec le bourrelet soit sans compression ou de tension pendant 20 secondes, puis retourne à sa position initiale pour démarrer le cycle suivant. association Bond / dissociation sous zéro vigueur estse manifestant par une baisse / augmentation soudaine de fluctuations thermiques du bourrelet ^16,30.

dosage de serrage de force est utilisée pour des mesures de durée de vie de moins de forces. Une force de serrage souhaitée (par exemple, 20 pN) est réglée avant l'expérience. La cible est entraîné de façon répétée pour contacter le bourrelet de la sonde pendant un temps de contact donné (par exemple, 1 seconde) pour permettre la formation d'une liaison récepteur / ligand (figure 2C, les panneaux 2 et 3), puis rétracter (figure 2C, Groupe 4 ). Si aucune liaison est formée, reflétée par l'absence de signal de force de traction sur la RBC, ou si les ruptures d'obligations avant d'atteindre la force de serrage prédéfini, l'objectif sera de retour à la position initiale et commencer le cycle suivant. Dans les événements de liaison qui survivent à la phase de rétraction, la cible est maintenue à la force de serrage avec un allongement correspondant de la RBC par d jusqu'à ce que les dissocie obligataires (figure 2C, panneaux 5 et 6), et retourne ensuite à la posit originaleion pour démarrer le cycle suivant (figure 2C, Groupe 7). Durée de vie est définie comme l'intervalle de temps à partir de l'instant où la force a atteint le niveau désiré pour l'instant de dissociation de la liaison ^20.

Pour toutes ces trois modes expérimentaux BFP, l'expérimentateur devrait être en mesure de voir l'approche-empiètent-contact retract- (pince -) (dissociate-) cycle d'essai de retour (figure 2C), qui sera répété à plusieurs reprises ^{16,20 , 21.}

Les données recueillies à partir de chaque mode expérimental de BFP pourraient être analysées de différentes manières pour obtenir des résultats souhaités. La courbe de durée de vie moyenne est un résultat représentatif à partir du dosage force de serrage (Figure 4). Il reflète les effluents taux réciproques de la dissociation du récepteur-ligand sous des forces. Test de fluctuation thermique permet la caractérisation de 2D sur-vitesse et de débit d'une paire récepteur-ligand sous la force de ¹⁶ zéro; tandis que l'adhérence fréqessai de uency rend la 2D sur taux, hors taux et l'affinité sous zéro vigueur ^13.

Le complément de la fonction d'imagerie de fluorescence permet la surveillance de la concentration intracellulaire de Ca ²⁺ niveau d'une seule cellule, qui est utilisé comme la lecture de la signalisation cellulaire dans ce système. Pour utiliser cette fonction lors d'une expérience FBFP, on a besoin de pré-charger les cellules avec un indicateur de Ca ^2+. Dans le cas de Fura2-AM étant le colorant fluorescent, les images de fluorescence de la même cellule dans 340 nm et 380 canaux d'excitation nm ont été enregistrées en alternance dans l'expérience et inspectés paire par paire dans l'analyse. Un seuil d'intensité a été affecté à l'image fluorescente de chaque canal pour éliminer le bruit de fond et de reconnaître le contour de la cellule (figure 5). La comparaison de chaque paire des images de fluorescence permet de calculer la intracellulaire Ca ²⁺ niveau. Images fluorescentes claires de la cellule de moins de deux 340 nmet 380 canaux nm d'excitation sont nécessaires pour une mesure précise du niveau de Ca ²⁺ (figure 5A, B), tandis que les images pauvres avec le bruit de fond non négligeable se traduira par des résultats biaisés et doivent être évités (Figure 5C).

En introduisant stimulations mécaniques contrôlables sur la cellule de la cellule et enregistrer Ca ²⁺ niveau simultanément, l'FBFP fournit un outil unique molécule puissant pour étudier mécano-transduction sur une cellule vivante. Il est intéressant de noter que, la plate-forme décrite ici est très polyvalent; En principe, on peut concevoir de nombreuses façons d'appliquer une force à la cellule en fonction des usages particuliers et en même temps la surveillance de divers événements de signalisation d'intérêt. Les détails cinétiques forces dépendant sont ensuite analysés dans le contexte de la lecture de signalisation choisi d'extraire des caractéristiques de la cinétique de la force réglementés récepteur-ligand, la signalisation induite, et leur corrélation. Dans l'exemple de TCR signaling, un TCR-pMHC captures liaison spécifique de l'agoniste a été découvert et sa pertinence pour les cellules T flux de Ca2 ⁺ a été étudiée ^27. La stratégie était de prendre la valeur de crête de flux de Ca2 ⁺ que la lecture de signalisation pour chercher son meilleur prédicteur parmi les différents paramètres cinétiques, y compris le nombre d'adhésions, l'amplitude de la liaison de la force, la durée de vie moyenne, la plus longue durée de vie et les effets cumulatifs durée de vie des séquentiellement formée fixations. Représenté sur la figure 6 est un exemple de la durée de vie de liaison individuel enregistrées simultanément (où une force de serrage de 10 pN a été appliqué) d'une des cellules T et leur accumulation avec la courbe du signal Ca2 ⁺ correspondant. Dans ce cas, la durée de vie de quatre événements survenus avant le moment où le niveau de Ca2 ⁺ a commencé à élever à 55 sec, l'accumulation d'une somme de 10 secondes la durée de vie de l'obligation. Ce niveau d'accumulation de la durée de vie a déclenché un signal Ca ²⁺ avec un pic de rapport normalisé Fura2de 1,8 survenu à 65 sec. Une analyse mathématique systématique de ces données recueillies auprès de nombreuses cellules individuelles a révélé que le meilleur corrélat de Ca ²⁺ signalisation force est la durée de vie cumulée dans la 1 ^ère minute de interactions répétées TCR-pMHC (voir référence ²⁷ pour les détails techniques).

Figure 3: le temps de la force exemplaire courbes de données brutes d'un événement non-adhérence (A), un événement de force de rupture (B) et un événement de vie (C). Différentes phases du cycle et les segments de courbe correspondant sont respectivement marqués dans chaque panneau. La force (axe des y) est dérivé de suivi de la variation de position de la bille de palpage, comme représenté sur la Figure 2C. (A) aucune adhérence: la force de compression (négative) dans les retours de la phase de contact to zéro lors de la rétraction. (B) Un événement de force de rupture: une force de traction (positif) tire via la liaison récepteur-ligand pour allonger la RBC, qui se rompt au cours de la phase de rétraction. (C) Un événement de vie: le lien persiste jusqu'à ce que la force de serrage est atteint et se dissocie par la suite. La durée de l'événement de vie est indiquée. L'événement de force de rupture (B) et le début de l'événement de vie (C) sont mis en évidence par un astérisque.

Figure 4:. "Durée de vie moyenne vs vigueur" courbe de OT1 cellules T interagissant avec son agoniste OVA (vert) et antagoniste G4 (bleu) Les données regroupées sont regroupés en différents bacs de force, et la moyenne ± SEM de la durée de vie des obligations est tracé par rapport à la force.

Figure 5:. Représentant Ca ²⁺ images excités à deux longueurs d'onde (A, B) la reconnaissance d'image correcte d'un T-cell (indiqués en rouge) en 340 nm (A) et 380 nm (B) sur la base de canaux à point signaler criblage en utilisant un seuil d'intensité correctement attribué. (C) L'incapacité à reconnaître l'image de fluorescence d'une cellule T (indiquée en rouge) dans le canal d'excitation 340 nm, due à une mauvaise chargement Fura2.

Figure 6: La superposition du "niveau intracellulaire de Ca2 ⁺ (rapport relatif Fura2) en fonction du temps" et la "durée de vie en fonction du temps cumulé" courbes d'une cellule T-OT1, généreren appuyant à plusieurs reprises d la cellule T avec un bourrelet revêtu OVA plus de 300 secondes. (A) Une courbe de force représentant une séquence de non-adhérence, la force de rupture, et de durée de vie événements générés par des contacts répétés avec le temps. (B) des images Epi-fluorescence pseudo-couleur des signaux intracellulaires de Ca ²⁺ dans la cellule T à différents points dans le temps. Le niveau normalisé Ca ²⁺ est indiqué par l'échelle pseudo-couleur sur la droite. (C) Superposition de la courbe Ca ²⁺ de signal (rouge) et la courbe de durée de vie cumulée (jaune) sur le même parcours de temps. La courbe Ca ²⁺ a été tracée sur la base du Ca ²⁺ imagerie. Un flux de Ca2 ⁺ est signifié par une forte élévation du ratio Fura2 normalisée. Le moment où Ca ²⁺ atteint le pic est indiquée par une ligne pointillée. Le temps de déclenchement de chaque événement de vie est marqué sur la courbe de durée de vie cumulée (triangle plein).

Une expérience réussie FBFP implique quelques considérations critiques. Tout d'abord, pour le calcul de la force pour être fiable, la micropipette, la RBC, et le cordon de la sonde doivent être alignées aussi près que possible coaxial. La projection de l'intérieur de la pipette RBC devrait être d'environ une sonde de diamètre de la pipette de sorte que le frottement entre le RBC et la pipette est négligeable. Pour une RBC humain typique, le diamètre de la pipette est optimal de 2,0 à 2,4 um, ce qui donne un meilleur ajustement de l'équation 1 ^17,30. Deuxièmement, pour assurer des mesures dans les tests sur la force de serrage et le dosage de fluctuation thermique sont principalement pour des liaisons simples, une fréquence d'adhérence de moins de 20% doit être maintenue ^10,13,30. Ici, les adhérences non spécifiques doivent être soigneusement contrôlées (généralement <5% par blocage suffisant avec BSA). En outre, les données doivent être collectées que des événements d'adhérence avec une seule force-goutte - caractéristique d'un comportement seule molécule (analogue à une disparition seule étapede la fluorescence dans une seule molécule FRET). En troisième lieu, la concentration de charge du colorant de fluorescence doit être optimisé au cas par cas pour obtenir la meilleure qualité d'image. Quatrièmement, la toxicité de la charge de colorant à cellules T ou d'autres cellules d'intérêt doit être examiné avec soin avant chaque expérience. Par exemple, l'affinité de liaison des interactions récepteur-ligand colorant à chargement besoin d'être mesurée et comparée à celle sans charge de colorant. Si l'affinité de liaison est changer considérablement en raison de charge de colorant, un colorant différent ou une concentration différente de chargement doit être considéré. Cinquièmement, on préfère les protéines terminale biotine marqués pour permettre le couplage pratique, spécifique et forte qui préserve l'orientation native de la protéine.

Une des grandes forces de l'FBFP est qu'il effectue un essai de liaison simple sur une seule cellule. Malgré le faible débit, l'analyse liaison simple découvre souvent des caractéristiques importantes qui sont inaccessibles par ensemble classique moithodes. Par exemple, en examinant la répartition de la durée de vie à chaque bac de vigueur, on peut établir une corrélation entre différentes caractéristiques de liaison avec états conformationnels de protéines, fournissant un aperçu sur la façon dont la force régule la protéine de conformation change ^20,32. Le BFP peut aussi être utilisé pour mesurer la rigidité moléculaire à partir des données de déplacement de force et piézo-traducteur de la phase de rétraction, qui peuvent être utilisés pour enquêter protéines dynamique conformationnelle ^20,21.

De nombreuses méthodes ont été développées pour étudier l'adhérence et la signalisation cellulaire médiée par un récepteur. Cinétique de liaison récepteur-ligand est généralement mesurée avec des protéines recombinantes dans un isolement complet de l'environnement cellulaire. Une telle pratique est potentiellement problématique. Par exemple, il a été montré récemment que la cinétique in situ mesurés sur des cellules vivantes diffère considérablement de celle mesurée en utilisant les protéines recombinantes correspondantes ¹⁴ et révéler de nouvelles perspectives du récepteur & #8217; s fonctions cellulaires. Non seulement le FBFP capable de quantifier la cinétique de récepteur-ligand in situ, mais plus important encore, il peut aussi enregistrer simultanément la signalisation cellulaire induite par la liaison. Comme l'a démontré pour la TCR ^27, les riches informations de caractéristiques de liaison et la signalisation cellulaire obtenue en utilisant FBFP fournit une occasion sans précédent pour analyser leurs relations et la compréhension des mécanismes moléculaires de la mécano-transduction. Il est probable que FBFP trouverez plus d'applications dans d'autres systèmes de récepteur-ligand importants.

The authors have nothing to disclose.

Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.