Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Interacciones ligando-receptor de membrana median muchas funciones celulares. Cinética de unión y señalización corriente abajo provocada por estas interacciones moleculares son probablemente afectadas por el entorno mecánico en el que la unión y la señalización tienen lugar. Un estudio reciente demostró que la fuerza mecánica puede regular el reconocimiento del antígeno por y activación del receptor de células T (TCR). Esto fue posible gracias a una nueva tecnología que desarrollamos y fluorescencia denominado sonda de fuerza biomembrana (fBFP), que combina la espectroscopia de fuerza de una sola molécula con microscopía de fluorescencia. El uso de un glóbulo rojo humano ultra-suave como el sensor de fuerza sensible, una cámara de alta velocidad y en tiempo real técnicas de seguimiento de formación de imágenes, la fBFP es de ~ 1 pN (10 ^-12 N), ~ 3 nm y ~ 0,5 mseg en la fuerza, la resolución espacial y temporal. Con la fBFP, se puede medir con precisión la cinética individuales receptor-ligando vinculantes conforme al reglamento vigente y cal intracelular simultáneamente imagen desencadenó unión-CIUM señalización en una sola célula viva. Esta nueva tecnología puede ser utilizada para estudiar otras interacciones receptor-ligando de la membrana y de señalización en otras células bajo regulación mecánica.

-Célula a célula y célula-matriz extracelular-a (ECM) adhesión está mediada por la unión entre receptores de la superficie celular, las proteínas ECM, y / o lípidos ^1. La unión permite que las células para formar estructuras funcionales ^1, así como reconocen, se comunican, y reaccionan con el medio ambiente ^3.1. A diferencia de las proteínas solubles (por ejemplo, citoquinas y factores de crecimiento) que se unen a partir de una de tres dimensiones (3D) fase de fluido sobre los receptores de la superficie celular, receptores de adhesión celular forman enlaces con sus ligandos través de un hueco de la unión estrecha para puente de dos superficies opuestas que limitan molecular difusión en una dimensión (2D) de interfaz de dos ^4-7. En contraste con la cinética de 3D ​​que se mide comúnmente por ensayos de unión tradicionales (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial o SPR), la cinética 2D han de ser cuantificados con técnicas especializadas tales como microscopía de fuerza atómica (AFM) ^{8-10, 11,12} cámara de flujo, micropipeta ^13,14, ópticopinzas ¹⁵ y sonda de fuerza biomembrana (BFP) ^16-21.

Más que simplemente proporcionar vinculación física para la cohesión celular, moléculas de adhesión son un componente importante de la maquinaria de señalización para la célula para comunicarse con sus alrededores. No ha habido un creciente interés en la comprensión de cómo el compromiso ligando de moléculas de adhesión inicia la señalización intracelular y cómo la señal inicial se transduce dentro de la célula. Intuitivamente, propiedades de unión receptor-ligando puede afectar las señales que induce. Sin embargo, es difícil de diseccionar las relaciones mecánicas entre la interacción extracelular y eventos de señalización intracelular usando conjunto tradicional de ensayos bioquímicos debido a sus muchas limitaciones, por ejemplo, una resolución temporal pobres y la completa falta de resolución espacial. Métodos que permiten tanto biofísico (2D cinética de unión al receptor-ligando) y (señalización) observaciones bioquímicas en vivo existentecélulas incluyen sustratos de rigidez sintonizable ^22, matrices pilar de elastómero ²³ y dispositivos de cámara de flujo / microfluidos incorporados con capacidad de fluorescencia ^24-26. Sin embargo, las lecturas de la señalización y de unión al receptor-ligando tienen que obtener por separado (con mayor frecuencia por diferentes métodos), por lo que es difícil de diseccionar las relaciones temporales y espaciales de las características de los bonos con eventos de señalización.

BFP convencional es una fuerza de la espectroscopia ultrasensible con alta resolución espacio-temporal ^17. Se utiliza una célula flexible de color rojo sangre (RBC) como un sensor de fuerza, lo que permite la medición de la cinética de 2D de una sola molécula, propiedades mecánicas y los cambios conformacionales ^{14,16,19-21,27-29.} A BFP basado imágenes fluorescentes (fBFP) se correlaciona la cinética de unión al receptor-ligando con la señalización de las células activadas por la unión a escala de una sola molécula. Con esta configuración, en las actividades de señalización celular situ en el contexto de mechani superficialescal estimulación se observó en las células T ^27. El fBFP es versátil y se puede utilizar para estudios de adhesión celular y la señalización mediada por otras moléculas en otras células.

Este protocolo sigue las directrices de y ha sido aprobado por el comité de ética de la investigación humana del Instituto de Tecnología de Georgia.

1. glóbulos rojos humano Aislamiento, biotinilación y la osmolaridad de Ajuste

Nota: Paso 1.1 debe ser realizado por un médico profesional entrenado como una enfermera, con una Junta de Revisión Institucional aprobado protocolo.

1. Obtener 8-10 l (una gota) de sangre de pinchazo en el dedo y añadir a 1 ml de la tampón carbonato / bicarbonato (Tabla 1 y 2). Vórtice suavemente o pipetear la mezcla y centrifugar durante 1 min a 900 x g. Desechar el sobrenadante y lavar una vez más.
2. En un pequeño vaso de precipitados pesar 3,5-4 mg de biotina-PEG3500-NHS enlazador (Tabla 1). Disolver en el tampón carbonato / bicarbonato para que la concentración final de 3 mg / ml.
3. Mezclar 171 l de tampón carbonato / bicarbonato, 10 l de paquete de RBC y 1.049 l deLa biotina-PEG3500-NHS solución enlazador e incubar a TA durante 30 min. Lavar el RBC una vez con tampón de carbonato / bicarbonato y luego dos veces con N2-5% de tampón (Tabla 1 y 2).
4. Mientras tanto, colocar la botella con el casquillo de engarce aflojado en un desecador de vacío de vidrio lleno de desecantes en la parte inferior y el vacío durante 5 min, y llenar el desecador con argón. Apriete la tapa y tomar la botella. Selle la botella con una película de plástico de parafina (Tabla 1), colóquelo en un recipiente lleno de desecantes en la parte inferior y guárdela en -20 ° C.
   Nota: Los pasos que implican el uso de biotina-PEG3500-NHS enlazador, incluyendo 1.2 a 1.4 (excepto para la incubación y lavado en 1,3), necesario llevar a cabo lo más rápido posible.
5. Diluir la nistatina en N2-5 tampón% para hacer una concentración final de 40 mg / ml. Mezclar 5 l de biotina RBC con 71,4 l de nistatina (Tabla 1) solución e incubar durante 1 hora a 0 Y# 176; C. Lavar dos veces con tampón N2-5% y tienda con N2-5% de tampón + 0,5% de BSA (Tabla 1) en el refrigerador (4 ° C).

2. abalorios Silanización

1. La limpieza de la superficie del grano
   1. Pesar 50 mg de perlas de vidrio en polvo y volver a suspender en 500 l de agua DI.
   2. Mezclar 0,5 ml de 30% H ₂ O ₂ (Tabla 1) con 9,5 ml de agua DI en un vaso de precipitados de 50 ml, a continuación, añadir 2 ml de _NH4OH concentrado (Tabla 1) y llevar esta solución a una caldera en una placa caliente .
   3. Añadir las perlas de vidrio a la solución en ebullición y mantener la ebullición durante otros 5 min. Agite suavemente la solución cada min.
   4. Después de hervir, transferir ~ 5 ml de esta suspensión de perlas caliente en un tubo de 15 ml micro-centrífuga y rellene con agua RT DI. Centrifugar a 3500 xg durante 5 minutos, retirar y desechar el sobrenadante.
   5. Traslado otros 5 ml de suspensión de perlas caliente y añadir a las perlas lavadas, Recargar con más agua DI, mezclar bien y centrifugar de nuevo. Repita este procedimiento hasta que se utiliza alrededor de 50 ml de agua DI, que será un total de 4 a 5 veces de lavado.
   6. Transferir la suspensión de perlas en un vial de 1 ml. Repetir el lavado de las perlas con metanol (Tabla 1) por centrifugación a 17.000 xg durante 5 min para 3 veces, y finalmente volver a suspender las perlas en 1 ml de metanol al 100%.
2. Bead Superficie Tiolación
   1. Para un tubo de centrífuga de 50 ml añadir 45,6 ml de metanol, 0,4 ml de ácido acético (Tabla 1), 1,85 ml de agua DI, 1,15 ml de 3-mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS) (Tabla 1) y 1 ml de perlas en suspensión preparado en 2.1, luego incubar a temperatura ambiente durante 3 hr.
   2. Después de la reacción, eliminar todos los reactivos por lavado una vez con metanol fresco, y volver a suspender las perlas en 500 l de metanol. Divida esta suspensión de perlas de vidrio concentrado en un conjunto de 20 viales de vidrio limpios y secos contapones de rosca. Se evapora el metanol mediante el uso de un chorro de argón seco y gire lentamente los viales a fin de hacer una capa delgada de perlas secas en los lados de cada vial.
   3. Coloque los viales de perlas en un horno de secado precalentado a 120 ° C durante 5 minutos y luego sacar y rápidamente colocar la tapa (s) libremente en. Colocar los viales en un desecador de vacío de vidrio lleno de desecantes en la parte inferior y aspire el desecador con una bomba de vacío hasta que se enfríe.
   4. Purgar el desecador aspiradora con argón seco para llevar el desecador a presión atmosférica normal. Retire la tapa del desecador y rápidamente volver a apretar la tapa (s) en el vial. Selle los viales con la película de parafina plástico y almacenarlos a temperatura ambiente en una caja seca de almacenamiento oscuro.
   5. Tras su uso inmediato, tomar un vial de granos secos y lavar una vez con tampón fosfato (Tablas 1 y 2), vuelva a suspender en 50 l de tampón fosfato y se almacena a 4 ° C. Esta preparación concentrada del grano se hará referencia acomo "talones MPTMS" en los siguientes pasos.
      Nota: Con el almacenamiento adecuado, cuentas MPTMS podrían seguir funcionando durante un máximo de tres meses.

3. Bead funcionalización

1. Recubrimiento covalentemente proteínas en los granos
   1. Tome un cierto volumen (por ejemplo, 2,5 l) de las acciones de proteínas y mezclar con un volumen igual de tampón carbonato / bicarbonato para hacer Solución 1.
      Nota: El volumen depende de la población de la concentración y la densidad de sitio final deseado de la proteína en la superficie de los granos.
   2. En un pequeño vaso de precipitados de sopesar 2-3 mg de MAL-PEG3500-NHS enlazador (Tabla 1) y disolver con tampón carbonato / bicarbonato para llegar a una concentración final de 0,231 mg / ml.
   3. Mezcla de solución 1 con un volumen igual de la solución enlazador preparado en 3.1.2. Incubar la mezcla a TA durante 30 min para hacer la solución 2.
   4. Mientras tanto, colocar la botella con el casquillo de engarce aflojado en un desecador de vacío de vidrio filled con desecantes en la parte inferior y de vacío durante 5 min, y llenar el desecador con argón. Apriete la tapa y tomar la botella. Selle la botella con una película de parafina plástico, colóquelo en un recipiente lleno de desecantes en la parte inferior y guárdela en -20 ° C.
      Nota: Los pasos que implican el uso de MAL-PEG3500-NHS enlazador, incluyendo 3.1.2-3.1.4 (a excepción de la incubación en 3.1.3), deberán realizarse lo más rápido posible.
   5. Mezclar 5 l de perlas de MPTMS con la solución 2 y añadir tampón de fosfato (Tabla 1) para hacer un volumen final de 250 microlitros.
   6. Se incuban las perlas de la noche a TA, lavar 3 veces con tampón de fosfato, y volver a suspender en 100 l de tampón fosfato y se almacena a 4 ° C.
2. Preparación de proteína / perlas de estreptavidina (SA) Revestidos
   1. Siga el protocolo 3.1.1-3.1.4.
   2. Mezclar 5 l de perlas de MPTMS con una solución de 2 y 5 l de 4 mg / ml de estreptavidina-maleimida (SA-MAL) (Tabla 1) Solución y luego añadir tampón de fosfato para hacer un volumen final de 250 microlitros.
   3. Incubar las perlas durante la noche a RT, lavar 3 veces con tampón de fosfato, y finalmente volver a suspender en 100 l de tampón de fosfato y se almacenan a 4 ° C.
3. El recubrimiento de estreptavidina en los granos de cristal
   1. Mezclar 5 l de perlas de MPTMS con 5 l de 4 mg / ml solución SA y añadir 140 l de tampón de fosfato.
   2. Se incuban las perlas de la noche a TA, lavar 3 veces con tampón de fosfato, y volver a suspender en 50 l de tampón fosfato y se almacena a 4 ° C.
4. Recubrir las perlas SA recubiertas con una proteína biotinilada
   1. Mezclar 5 l de perlas SA recubiertas con la proteína (volumen dependiendo de la densidad de revestimiento deseado) y se añade tampón fosfato para hacer que el volumen final sea 100 l.
   2. Incubar la mezcla durante la noche a 4 ° C o durante 3 horas a RT, lavar 3 veces con tampón de fosfato, y re-suspender en 50 l phosphate tampón y almacenar a 4 ° C.

4. Preparación de la célula

Nota: Para purificar las células, seguir los protocolos de purificación de células estándar correspondientes al tipo de células en uso, por ejemplo las células T ²⁷ o ciertas líneas celulares ^21,29.

1. Para los experimentos de fBFP, una vez que se prepara la suspensión de células, añadir Fura2-AM (Tabla 1) disuelto en DMSO en la suspensión de células para alcanzar una concentración final de 2 mM, incubar durante 30 min a RT y luego lavar una vez. Mantenga esta suspensión celular cargado fluorescente en la oscuridad hasta su uso.

5. Preparación para Micropipetas y una Cámara de la célula

1. Preparación Micropipetas
   1. Cortar tubos capilares de vidrio largo (Tabla 1) con un cortador de vidrio en piezas cortas de alrededor de 3 pulgadas de largo. Monte una pieza en el extractor micropipeta (Tabla 1), haga clic en el "Pull", perotonelada de modo que el centro del capilar se calienta por la máquina y el capilar se tiró de los dos extremos para hacer dos capilares con puntas afiladas (micropipetas primas).
      Nota: Siguiendo la pauta de productos, la morfología deseada de la pipeta prima tiene 8.6 mm de la forma cónica y 0,1 a 0,5 micras punta.
   2. Montar una pipeta prima en el soporte de la pipeta de la forja micropipeta (Tabla 1). El calor para fundir la esfera de cristal en la fragua. Inserte la punta de la pipeta en bruto dentro de la esfera de cristal. Enfriar la esfera de cristal y tirar la pipeta prima para romperlo desde fuera y dejar la punta dentro de la esfera. Repita este procedimiento hasta que se obtiene el orificio de la punta deseada.
      Nota: Los ejemplos de un diámetro interior punta de la micropipeta: 2,0-2,4 micras para un RBC, ~ 1,5 m para una perla, ~ 2-4 micras para una célula T y -7 m para una célula de hibridoma.
2. La construcción de una Sala de la célula
   Nota: la cámara de la celda está construida sobre la base de una casa-madsoporte de la cámara e, que consta de dos piezas de cuadrados de metal (cobre / aluminio) y un mango que los une (Figura 1D).
3. Cortar un 40 mm x 22 mm x 0,2 mm cubreobjetos utilizando un cortador de vidrio en dos piezas 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (cubreobjetos 1 y 2). Glue cubreobjetos 1 por la grasa hacia el lado superior del soporte de cámara en la forma en que puentea los dos cuadrados de metal, y de manera similar cubreobjetos pegamento 2 para el lado inferior, que formará una cámara de la celda paralelo-cubreobjetos (Figura 1D).
4. Utilizar una pipeta para inyectar 200 l de tampón experimental entre las dos cubreobjetos. Asegúrese de que la memoria intermedia se une a ambos cubreobjetos. Gire suavemente y agitar la cámara para que el búfer tocar ambos extremos de la cámara.
5. Inyectar cuidadosamente aceite mineral en ambos lados de la cámara de flanqueando la sellando de este modo la memoria intermedia desde el aire abierto experimental zona de amortiguación. Inyectar suspensiones de cuentas de la sonda (por ejemplo, perlas recubiertas con pMHC), glóbulos rojos y blancos(por ejemplo, células T) en las regiones superior, media e inferior de la zona de amortiguamiento, respectivamente.

6. BFP experimento

Figura 1: Montaje fBFP (A) Un cuadro visión general del sistema de hardware fBFP.. (B) Un dibujo esquemático del sistema de hardware fBFP. (C) El sistema de doble leva "DC2" (naranja) sobre el que se montan la cámara de alta velocidad (azul) y una cámara de fluorescencia (blanco). (D) La platina del microscopio que se adapta una cámara de experimentación y tres sistemas de manipulación de micropipeta. Micrografías de ajuste de BFP en una cámara experimental (E y F). (E) Micropipetas que muestra el montaje de la pipeta sonda (izquierda), una pipeta de destino (arriba a la derecha) y de la pipeta helper (menor rderecho). La colocación del talón (F) de la sonda. Un cordón de la sonda fue manipulado por una pipeta ayudante y adjunto a un ápice de RBC para formar una sonda de fuerza. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Encienda el microscopio (Tabla 1) y fuente de luz. Coloque la cámara en la platina del microscopio principal (Figura 1 A, D).
2. Instale los tres micropipetas de BFP (Figura 1D Izquierda:. Sonda, para tomar un RBC, a la derecha: blanco, para tomar un celular o perla, abajo a la derecha: ayudante, para tomar un grano).
   1. Use un micro-inyector (Tabla 1) para rellenar una micropipeta con tampón experimental. Quítese el soporte de pipetas (Tabla 1) y manténgalo en un lugar más bajo para permitir que el agua que gotea de la punta. Inserte rápidamente la micropipeta en la punta titular y asegurarse de que nadie la burbuja de aire se mete en la micropipetadurante la inserción. Apriete el tornillo del soporte.
   2. Montar cada titular de la pipeta en su correspondiente micro-manipulador. Empuje la micropipeta hacia la cámara de manera que sus puntas entran en la zona de amortiguamiento de cámara. Ajuste la posición de la micropipeta y encontrarlos bajo el microscopio de campo de visión.
3. Mover todo el escenario soporte de la cámara para encontrar las colonias de tres elementos (los glóbulos rojos, los objetivos y las cuentas de la sonda) uno por uno. Ajuste la posición de la micropipeta correspondiente girando las perillas de los manipuladores de dejar la punta del enfoque micropipeta una célula / perla. Aspirar el de células / perlas mediante el ajuste de la presión dentro de la micropipeta correspondiente. Los tres micropipetas capturarán sus correspondientes elementos.
4. Mover todo el escenario soporte de la cámara para encontrar un espacio abierto lejos de las colonias de los elementos inyectados en la que se realiza el experimento. Cambie el modo visual microscopio para visualizar la imagen en el borradoruter programa en la pantalla de ordenador. Mueva los tres elementos de puntas de pipeta en el campo de visión del programa.
5. Alinear la perla de la sonda y RBC, y maniobrar cuidadosamente el cordón de la sonda hasta el ápice de la RBC, incidir brevemente la gota sobre el RBC y suavemente retraer. Ajuste la presión de la micropipeta ayudante para soplar suavemente el cordón de distancia, por lo que se dejará pegado a la RBC ápice (Figura 1F). Aléjese la micropipeta ayudante y alinear el objetivo y cordón de la sonda (Figura 2).

Figura 2:. Esquema de BFP y su ciclo de ensayo (A) Video-micrografía que representa una sonda de fuerza (izquierda) y un objetivo de células T (derecha) aspirado por su respectiva sonda de fuerza estacionaria pipettes.The consta de un RBC hinchado y una unida ligando de soporte de talón. El receptor-cojineteDe células T (target) está montado en un piezotranslator alineado opuesto a la sonda. El retorno de la inversión se indica en verde. El seguidor de borde se indica en una línea azul. El inserto representa el ligando (pMHC, con el lado del talón) y el receptor (TCR, lado de células T) par sobre las dos superficies opuestas en la zona marcada en naranja. (B) El perfil de intensidad del borde del talón en (A). La región de retorno de la inversión en el x -dirección se traza como eje x (en número de píxeles) y la intensidad de la luz (en valor de escala de grises) de media por hurgar en la basura 30 píxeles a lo largo de la dirección x y. (C) La deflexión de la RBC y la posición de la perla y la diana (células T) en un ciclo de prueba de ensayo de fuerza de sujeción. Las líneas de trazos verticales y horizontales indican la posición de fuerza cero del ápice RBC y el curso del tiempo, respectivamente. El seguidor borde de la línea de la deformación de RBC se muestra en azul en cada panel. Las mismas aún menos pasos que se adopten en la frecuencia de la adhesiónensayo (que carece de los pasos de "pinza" y "disociar") y ensayo de fluctuación térmica (que carece de la etapa de "disociar").

6. En el programa, en la ventana de campo de visión utilizar las herramientas en el programa para medir el radios respectivos de la micropipeta sonda (R _p), el RBC (R _0), el área de contacto circular entre el RBC y el talón de la sonda (R _c) , que permite la estimación de la constante de muelle del RBC (k) por la siguiente ecuación ^17.30,
   
   
   donde Δ p es la presión de aspiración en la punta de la pipeta de la sonda.
   
   Nota: Se desprende de la ley de Hooke la que la fuerza de unión, F, puede ser cuantificada por el producto de la constante de muelle y el desplazamiento de la perla de la sonda (d), es decir, F = d (Figura 2C).
7. Introduzca la constante del resorte RBC deseada en el programa (Por favor refiérase a la sección Protocolo 6.6. La constante del resorte se ajusta normalmente a 0.25 o 0.3 pN / nm para el ensayo de la frecuencia de ensayo fuerza de sujeción y la adherencia y 0,1 pN / nm para el ensayo de fluctuación térmica) , que devolverá una presión de aspiración requerida en la unidad de centímetro de agua. Ajuste la altura del depósito de agua que se vincula a la pipeta de la sonda hasta que se alcance la presión de aspiración requerida.
8. Dibuja una línea horizontal a través del ápice de RBC, que dará lugar a una curva en la ventana adyacente indica el brillo (valor de escala de grises) de cada píxel a lo largo de esta línea. Arrastre la línea límite de estar en torno a la mitad de la profundidad de la curva (Figura 2A, B).
   Nota: El punto mínimo de la curva de brillo por debajo de la línea de umbral indica la posición del límite del grano, por lo tanto sólo se permite un mínimo local. Si dos o más mínimos locales son en la actualidad,indica que la imagen no es óptima (probablemente debido a la imagen quede fuera de foco, o una mala alineación entre el talón de la sonda y el RBC).
9. Seleccione el modo de experimento deseada: ensayo de fluctuación térmica, ensayo de adherencia de frecuencia o ensayo fuerza de sujeción. Establezca los parámetros como desee (por ejemplo, la fuerza de choque = 15 pN, tasa de carga = 1000 PN / s, tiempo de contacto = 1 seg, la fuerza de sujeción = 20 pN (para el ensayo de sujeción de fuerza), etc).
   1. Haga clic en "Inicio", que permite que el programa para mover la pipeta objetivo y conducir el destino dentro y fuera de contacto con la sonda (véase la sección Resultados representante para más detalles). La recolección de datos se realiza en paralelo, que registra la posición de la perla de la sonda en tiempo real. Detenga el programa haciendo clic en el botón "experimento Stop", momento en el cual se abrirá una ventana a cabo para permitir guardar los datos adquiridos.

7. Fluorescencia BFP (fBFP) experimento

1. Para utilizar el fluoréscence función del sistema de BFP, encender la fuente de luz de excitación (Tabla 1) y la cámara de fluorescencia (Tabla 1), que son controlados por un programa separado (Tabla 1). En el programa, seleccionar los parámetros de la fluorescencia de imagen, incluyendo la ganancia, la exposición, los canales de excitación (en este caso, 340 nm y 380 nm de luz), etc. Siga todas las preparaciones en el protocolo experimento BFP, incluyendo la alineación de la sonda y el objetivo, lo que permitirá la visualización de la imagen fluorescente en vivo de células diana excitado por 340 nm o 380 nm luz de excitación.
2. Utilice la herramienta de corte a más o menos la sección de la zona dentro de la cual la célula se mantendrá durante todo el período de registro.
   Nota: Debido a la utilización del ciclo de aproximación-contact-retracción, la célula estará moviendo hacia adelante y hacia atrás repetidamente, por lo tanto el área de sección es mucho más grande que la propia célula.
3. Haga clic en "Grabar" para permitir que el un 340 nmd 380 nm de luz para excitar alternativamente el colorante de fluorescencia intracelular (Fura2), y un par de imágenes de fluorescencia correspondiente se grabará alternativamente alrededor de una vez cada segundo. Al mismo tiempo, haga clic en "Inicio" en el programa para comenzar el experimento BFP para el análisis de la interacción molecular y el experimento de imágenes de fluorescencia para controlar la señalización de calcio intracelular. El sistema producirá un archivo de datos brutos para la unión receptor-ligando (véase la Figura 6A abajo) y una serie de imágenes fluorescentes en formato .tiff para las señales de calcio.

Análisis 8. Datos

1. Análisis de Datos BFP
   1. Análisis de los datos para el ensayo de adherencia de frecuencia
      1. Secuencialmente inspeccionar la señal de cada ciclo de "fuerza en función del tiempo" y simplemente grabar el que los ciclos contienen un evento adhesión y cuáles no, y resumir para producir una frecuencia media de adherencia.
      2. Recoger la fuerza de ruptura de cada evento de la adhesión, quees el valor de pico de la fuerza linealmente en rampa antes de la rotura de bonos. Después de recoger una cantidad suficiente de las fuerzas de ruptura en una gama de velocidades de rampa, derivar la distribución de la fuerza de ruptura en cada velocidad de rampa del que se deriva la fuerza dependiente de fuera de velocidad de disociación receptor-ligando usando análisis de espectroscopia de fuerza dinámica ^18,31.
   2. Análisis de los datos para el ensayo de fluctuación térmica
      1. Secuencialmente inspeccionar la señal de fase de cierre de cada ciclo, lo que probablemente contiene múltiples eventos de la asociación y disociación de bonos. Utilice el nivel de fluctuación térmica fase de sujeción (la desviación estándar promedio de un intervalo de deslizamiento de 70 puntos de tiempo secuenciales de la posición del talón) en la "fuerza en función del tiempo" señal como una guía para distinguir los eventos de la asociación y disociación de bonos, ya que un vínculo formación corresponde a una disminución en la fluctuación térmica.
      2. Designar el intervalo desde el instante de disociación del enlace (cuando el Thermal fluctuación reanuda al nivel normal) para el instante de la próxima formación de un enlace con el tiempo de espera, y designar la duración de la unión de su asociación a la disociación como vínculo de por vida, que tanto se recogen durante la inspección de datos. Calcular el tiempo medio de espera y el promedio de vida útil de bonos, que, respectivamente, reflejan el recíproco de sobre-tasa y la de fuera de la tasa de bajo cero fuerza de ^16,30.
   3. Análisis de los datos de ensayo de fuerza de sujeción
      1. Parámetros de registro de todos los eventos de toda la vida, incluyendo la fuerza media y la duración vínculo con el número de secuencia, así como la hora de inicio y la hora de finalización, lo que permitirá una para dibujar una curva de vida acumulada (por ejemplo, la figura 6C, curva amarilla).
      2. Se recoge una cantidad suficiente de eventos de toda la vida bajo una gama de fuerzas. Grupo de ellos en diferentes contenedores de fuerza, que producirá una vida media en cada bin fuerza, y el rendimiento en conjunto una "vida media vs. curva de fuerza "(Figura 4).
2. Análisis de fluorescencia de calcio Imaging Datos
   1. Ajustar el umbral de intensidad hasta que las imágenes de fluorescencia muestran un contorno claro de la célula en ambos canales 340 nm y 380 nm y sin ruido de fondo (Figura 5A, B). A continuación, revise el Ca ²⁺ trama de señal intracelular por marco con un pseudo-color que indica el nivel de intensidad (Figura 6B), que se deriva basa en la relación de intensidad de 340 nm / 380 nm, para generar la "intensidad normalizada Ca ²⁺ vs . curva de tiempo "(Figura 6C). Utilice las imágenes de fluorescencia pseudo-color para producir una película que muestra el segundo nivel de fluorescencia por segundo.

La técnica BFP fue iniciado por el laboratorio de Evans en 1995 ^17. Esta herramienta picoforce se ha utilizado ampliamente para medir las interacciones de proteínas inmovilizadas sobre superficies, a fin de analizar la cinética de dos dimensiones de las moléculas de adhesión interacción con sus ligandos ^{16,19,20, 30,} para medir la elasticidad molecular ^21,29, y para determinar conformacional proteína cambia ^21. Para una fBFP, un conjunto adicional de dispositivos relacionados con epi-fluorescencia con el sistema de software correspondiente (Tabla 1) se añade (Figura 1A - C).

El sistema fBFP consiste en un sistema de hardware (componentes ópticos, mecánicos y eléctricos) y un sistema de software (Tabla 1 y Figura 1A, B). Un microscopio invertido (Figura 1A, medio) con componentes ópticos que permiten de campo brillante y microscopía de epi-fluorescencia constituye el cuerpo principal deel sistema fBFP, sobre la que se montan la etapa de experimento y manipuladores de pipeta. Un controlador de fuente de luz de fluorescencia (Figura 1A, en la esquina superior izquierda) se utiliza para entregar alternando luces de excitación. Un sistema de doble leva "DC2" divide la luz en dos y las transmite a una cámara de alta velocidad (azul) y una cámara de fluorescencia (blanco) (Figura 1A, en la esquina inferior izquierda). El primero recoge la imagen de la sonda para la determinación de posición y las últimas imágenes de fluorescencia recopila emitidos desde la célula diana a dos longitudes de onda. El experimento se supervisa y controla con dos computadoras de las cuales Host PC 1 (Figura 1, en ​​la esquina superior derecha, cosechado en la imagen debido a la limitación de espacio) está conectado tanto a la cámara de alta velocidad y la cámara de fluorescencia y es responsable de la ejecución experimento y adquisición de datos, y Host 2 PC está conectado a la cámara de vigilancia y los encargados de presentar una visión completa de la expe BFPción (Figura 1 A, B).

Durante un experimento, el experimentador utiliza tres micropipetas para agarrar y manipular células y microesferas, respectivamente (Figura 1E, F). Una imagen típica de un experimento de BFP consiste en una sonda de fuerza, que se monta uniendo un cordón sonda en el vértice de un RBC aspirado, y una célula diana / perlas (Figura 2A). Una región de interés (ROI), que contiene la zona del borde del talón en el RBC ápice, es seguido por una cámara rápida velocidad (2.000 fps) para controlar la deformación de la RBC en tiempo real. El desplazamiento seguido de la perla puede utilizarse entonces para calcular la fuerza externa ejercida sobre la sonda de fuerza (véase la nota en la sección 6.6 Protocolo), dada la constante de muelle del BFP (Figura 2A, B).

La adhesión de ensayo frecuencia, ensayo de fluctuación térmica, y el ensayo de fuerza de sujeción son los tres modos experimentales de uso común en un sistema de BFP. Por adoptando cualquiera de estos tres modos, un experimento de BFP se compone de ciclos de pruebas repetidas que se realizan secuencialmente.

En ensayo de adherencia de frecuencia, el objetivo se acerca y en contacto con el talón de la sonda en un tiempo de contacto dado (por ejemplo, 1 seg) y se retrae directamente de vuelta a la posición original y empezar el siguiente ciclo. Un evento de adhesión se refleja por una señal de fuerza de tracción durante la fase de retracción. Este ciclo enfoque de contacto de retracción se repite 50 veces durante al menos 3 pares de sonda-diana para calcular un SEM media de frecuencia de la adhesión, P _a.

Ensayo de fluctuación térmica se utiliza para mediciones de por vida bajo de fuerza cero. En cada ciclo, después de tocar el cordón de sonda, el objetivo se retrae a la posición de fuerza cero y se sujeta en contacto con el talón sin compresión o tensión durante 20 segundos, y luego regresa a la posición original para empezar el siguiente ciclo. Bond asociación / disociación bajo de fuerza cero esse manifiesta como una gota / aumento repentino en las fluctuaciones térmicas del talón ^16,30.

Ensayo de la abrazadera de la Fuerza se utiliza para mediciones de por vida bajo fuerzas. Una fuerza de sujeción deseada (por ejemplo, 20 pN) se ajusta antes del experimento. El objetivo es impulsado repetidamente para ponerse en contacto con el cordón de sonda para un tiempo de contacto dado (por ejemplo, 1 seg) para permitir la formación de un enlace de receptor / ligando (Figura 2C, paneles 2 y 3) y luego retraer (Figura 2C, Panel 4 ). Si no se forma ningún enlace, reflejada por ninguna señal de fuerza de tracción en el RBC, o si las rupturas de bonos antes de alcanzar la fuerza de apriete predefinido, el objetivo se vuelva a la posición original y comenzar el siguiente ciclo. En los eventos de unión que sobreviven a la fase de retracción, el objetivo se llevará a cabo en la fuerza de sujeción con una elongación correspondiente de la RBC mediante d hasta los disocia de bonos (Figura 2C, paneles 5 y 6) y, a continuación, vuelve a la posit originalesión para iniciar el siguiente ciclo (Figura 2C, Grupo 7). Lifetime se define como el intervalo de tiempo desde el instante cuando la fuerza alcanzado el nivel deseado para el instante de la disociación del enlace ^20.

Para todos estos tres modos experimentales de BFP, el experimentador debe ser capaz de ver el enfoque de impinge-contact-retráctil (pinza -) (dissociate-) ciclo de pruebas de retorno (Figura 2C), que se repite para varias veces ^{16,20 , 21.}

Los datos recogidos de cada modo experimental de BFP podrían ser analizados en varias maneras para obtener los resultados deseados. La curva de tiempo de vida media es un resultado representativo de la fuerza de sujeción de ensayo (Figura 4). Refleja las plantas fuera de tarifas recíprocas de la disociación del receptor-ligando bajo fuerzas. Ensayo de fluctuación térmica permite la caracterización de 2D en clase y fuera de la tasa de un par receptor-ligando bajo cero de la fuerza ^16; mientras frec adherenciaensayo uidez hace que el 2D en clase, fuera de la tasa y la afinidad en virtud de fuerza cero ^13.

El complemento de la función de imágenes de fluorescencia permite la supervisión de la intracelular de Ca ²⁺ nivel de una sola célula, que se utiliza como la lectura de la señalización celular en este sistema. Para utilizar esta función durante un experimento fBFP, es necesario comprobar la validez de cargar las células con un ^{2 +} indicador de Ca. En el caso de Fura2-AM siendo el colorante fluorescente, las imágenes de fluorescencia de la misma célula bajo 340 nm y 380 nm de excitación canales se registraron alternativamente en el experimento y se inspeccionaron par por par en el análisis. Un umbral de intensidad se le asignó a la imagen fluorescente de cada canal para eliminar el ruido de fondo y reconocer el contorno de células (Figura 5). Comparación de cada par de las imágenes de fluorescencia permite el cálculo de la intracelular Ca ²⁺ nivel. Imágenes fluorescentes claras de la célula bajo tanto 340 nmy 380 nm de excitación canales son necesarios para la medición precisa del nivel de Ca2 ⁺ (Figura 5 A, B), mientras que las imágenes pobres con no despreciable ruido de fondo se traducirá en resultados sesgados y deben evitarse (Figura 5C).

Mediante la introducción de estímulos mecánicos controlables sobre la célula y registro de nivel del Ca2 ⁺ simultáneamente, el fBFP proporciona una potente herramienta de una sola molécula a estudiar mecano-transducción en una célula viva. Vale la pena señalar que, la plataforma se describe aquí es muy versátil; en principio, uno puede diseñar numerosas maneras de aplicar la fuerza a la célula para adaptarse a propósitos particulares y al mismo tiempo el seguimiento de varios eventos de señalización de interés. Los detalles cinéticos de fuerza dependiente se analizan a continuación en el contexto de la lectura de señalización elegido para extraer características de la cinética de fuerza regulada receptor-ligando, la señalización inducida, y su correlación. En el ejemplo de TCR signaling, un TCR-pMHC vínculo catch-agonista específico fue descubierto primero y luego su relevancia para las células T Ca ²⁺ flujo se investigó ^27. La estrategia consistía en tomar el valor de pico de flujo de Ca2 ⁺ como la lectura de señalización para buscar su mejor predictor entre varios parámetros cinéticos, incluyendo el número de adhesiones, la fuerza de la amplitud de la unión, la vida media, la vida útil más larga y la acumulada vida de los enlaces secuencialmente formado. Se muestra en la Figura 6 es un ejemplo de tiempos de vida de los bonos individuo grabadas simultáneamente (donde se aplicó una fuerza de cierre de 10 pN) de una célula T y su acumulación junto con la curva de la señal de Ca ²⁺ correspondiente. En este caso, cuatro eventos de toda la vida se produjo antes de la época en que nivel del Ca2 ⁺ comenzó a elevar a 55 seg, acumulando una suma de 10-segundo curso de la vida de bonos. Este nivel de acumulación de toda la vida activa una señal de Ca ²⁺ con un pico de relación normalizada Fura2de 1,8 que se produjo a los 65 seg. Un análisis matemático sistemática de estos datos recogidos de muchas células individuales reveló que el mejor correlato de Ca ²⁺ fuerza señalización se acumula vidas en el ^1er minuto de repetidas interacciones TCR-pMHC (consulte la Referencia ²⁷ para los detalles técnicos).

Figura 3: Tiempo de fuerza Ejemplar curvas de datos en bruto de un evento no-adherencia (A), un evento de fuerza de ruptura (B) y un evento de toda la vida (C). Varias fases del ciclo y de los segmentos de curva correspondientes están marcados respectivamente en cada panel. La fuerza (eje y) se deriva de seguimiento del cambio de posición de la perla de la sonda, como se muestra en la Figura 2C. (A) No adherencia: la compresión de fuerza (negativo) en los rendimientos de la fase de contacto to cero después de la retracción. (B) Un evento de fuerza de ruptura: una fuerza de tracción (positivo) tira a través de la unión receptor-ligando para alargar el RBC, que se rompe durante la fase de retracción. (C) Un evento de toda la vida: el vínculo persiste hasta que se alcanza la fuerza de sujeción y se disocia a partir de entonces. La duración de la vida evento se indica. El evento de fuerza de ruptura (B) y el comienzo de la vida evento (C) se destacan con un asterisco.

Figura 4:. "Vida media vs. fuerza" curva de células T OT1 interactuar con su agonista OVA (verde) y G4 antagonista (azul) Los datos agrupados se agrupan en diferentes contenedores de la fuerza, y la media ± SEM de vidas de los bonos es trazada frente a la fuerza.

Figura 5:. Representante Ca ²⁺ imágenes excitados en dos longitudes de onda (A, B) de reconocimiento de imagen correcta de una célula T (indicado en rojo) en 340 nm (A) y 380 nm (B) canales basado en punto-to- señalar la detección utilizando un umbral de intensidad correctamente asignado. (C) Incapacidad para reconocer la imagen de fluorescencia de una célula T (indicado en rojo) en el canal de excitación 340 nm, debido a la mala carga Fura2.

Figura 6: La superposición de la "Ca2 ⁺ intracelular nivel (relación relativa Fura2) en función del tiempo" y el "tiempo de vida acumulada en función del tiempo" curvas de una de las células T OT1, generard tocando repetidamente la célula T con un cordón recubierto con OVA más de 300 segundos. (A) A curva de fuerza que muestra una secuencia de no-adherencia, fuerza de ruptura, y eventos de toda la vida generadas por los contactos de repetidas en el tiempo. (B) Las imágenes de fluorescencia Epi-pseudo-de color de Ca2 ⁺ intracelular señales en la célula T en diferentes puntos temporales. El nivel normalizado de Ca2 ⁺ se indica mediante la escala de pseudo-color de la derecha. (C) La superposición de la curva de Ca ²⁺ de señal (rojo) y la curva de vida acumulada (amarillo) en el mismo curso del tiempo. La curva de Ca ²⁺ se trazó sobre la base de la formación de imágenes de Ca ^2+. A Ca ²⁺ flujo está representado por una elevación aguda en la proporción Fura2 normalizado. El momento en que Ca ²⁺ alcanza el pico se indica mediante una línea discontinua. El tiempo de aparición de cada evento de vida está marcado en la curva de vida útil acumulativa (triángulo sólido).

Un experimento exitoso fBFP conlleva algunas consideraciones críticas. En primer lugar, para el cálculo de la fuerza para ser fiable, la micropipeta, el RBC, y el talón de la sonda deben estar alineados lo más cerca posible coaxial posible. La proyección de la RBC dentro de la pipeta debe ser alrededor de un diámetro pipeta sonda de manera que la fricción entre el RBC y la pipeta es insignificante. Para un típico RBC humano, el diámetro óptimo de la pipeta es 2,0-2,4 micras, que produce un mejor ajuste de la Ecuación 1 ^17,30. En segundo lugar, para garantizar mediciones de ensayo de fuerza de sujeción y el ensayo de fluctuación térmica son en su mayoría de enlaces simples, una frecuencia de adhesión de menos del 20% tiene que ser mantenida ^10,13,30. Aquí, las adherencias no específicos deben ser controlados cuidadosamente (generalmente <5% en el bloqueo suficiente con BSA). Además, los datos deben recogerse sólo de eventos de adhesión con una sola fuerza soltar - sello de un comportamiento de una sola molécula (análogo a una desaparición de un solo pasode fluorescencia en una sola molécula FRET). En tercer lugar, la concentración de carga del colorante de fluorescencia debe ser optimizado en una base de caso por caso para conseguir la mejor calidad de imagen. En cuarto lugar, la toxicidad de colorante de carga a las células T u otras células de interés necesita ser cuidadosamente examinados antes de cada experimento. Por ejemplo, la afinidad de unión de las interacciones receptor-ligando en colorante de carga necesita ser medido y comparado a que sin colorante de carga. Si la afinidad de unión se cambie dramáticamente debido a la carga de colorante, un tinte diferente o una concentración diferente de carga tiene que ser considerado. En quinto lugar, se prefieren las proteínas terminales etiquetados con biotina para permitir el acoplamiento conveniente, específico y fuerte que conserva la orientación nativa de la proteína.

Una de las principales de la fBFP es que se realiza un ensayo de enlace sencillo en una sola célula. A pesar del bajo rendimiento, análisis por enlace sencillo a menudo revela características importantes que son inaccesibles por conjunto convencional de míthods. Por ejemplo, mediante el examen de la distribución de tiempo de vida en cada bin fuerza, se puede correlacionar diferentes características de unión con los estados conformacionales de proteínas, proporcionando información sobre cómo regula la fuerza conformacional proteína cambia ^20,32. El BFP también se puede utilizar para medir la rigidez molecular de la fuerza y piezo-traductor de datos de desplazamiento de la fase de retracción, que pueden ser utilizados para investigar proteínas dinámica de conformación ^20,21.

Muchos métodos se han desarrollado para estudiar la adhesión celular mediada por el receptor y la señalización. Cinética de unión ligando-receptor se mide generalmente con proteínas recombinantes en completo aislamiento del entorno celular. Esta práctica es potencialmente problemática. Por ejemplo, se ha demostrado recientemente que en situ cinética medidos en células vivas difiere drásticamente de la que se mide usando las proteínas recombinantes correspondientes ^14, revelando nuevos conocimientos del receptor & #8217; s funciones celulares. No sólo es el fBFP capaz de cuantificar la cinética de receptor-ligando in situ, pero lo más importante, también puede grabar simultáneamente la señalización celular inducida por la unión. Como se ha demostrado para el TCR ^27, la rica información de características de unión y de señalización celular obtenida utilizando fBFP ofrece una oportunidad sin precedentes para analizar sus relaciones y la comprensión de los mecanismos moleculares de la mecano-transducción. Es probable que fBFP encontrará más aplicaciones en otros sistemas de receptor-ligando importantes.

The authors have nothing to disclose.

Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.