Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

A fluorescência baseada extensão do iniciador (FPE) é um método molecular para determinar pontos de partida da transcrição ou locais de processamento de moléculas de RNA. Isto é conseguido através de transcrição reversa do ARN de interesse, utilizando iniciadores marcados com fluorescência específicos e análise subsequente dos fragmentos de ADNc resultantes por electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida. Simultaneamente, uma reacção de sequenciação de Sanger tradicional é executado sobre o gel para mapear as extremidades dos fragmentos de ADNc correspondentes às suas bases exactas. Em contraste com 5'-RACE (Amplificação Rápida de Extremidades de ADNc), no qual o produto deve ser clonados e sequenciados vários candidatos, a maior parte dos fragmentos de ADNc gerados por extensão do iniciador pode ser detectado em simultâneo uma corrida de gel. Além disso, todo o procedimento (a partir de transcrição reversa para análise final dos resultados) pode ser completada em um dia de trabalho. Ao utilizar os iniciadores marcados com fluorescência, a utilização de reagentes perigosos isótopo radioactivo marcadopode ser evitada e os tempos de processamento são reduzidos como produtos podem ser detectadas durante o processo de electroforese.

No protocolo seguinte, nós descrevemos um método de extensão do iniciador fluorescente in vivo para detectar de forma fiável e rápida extremidades 5 'dos RNAs para deduzir pontos de partida da transcrição e locais de processamento de RNA (por exemplo, por componentes do sistema de toxina-antitoxina) em S. aureus, E. coli e outras bactérias.

A extensão do iniciador ¹ é um método molecular para determinar as extremidades 5 'de moléculas de RNA específicas até uma resolução de uma base. A vantagem de outros métodos, tais como 5'-RACE (amplificação rápida de extremidades de ADNc) é o tempo de resposta rápido e a capacidade de analisar facilmente uma mistura de diferentes comprimentos de moléculas de RNA.

Este método funciona por sujeição de moléculas de ARN para reacções de transcrição reversa, utilizando iniciadores fluorescentes específicos, gerando fragmentos de cDNA de determinados comprimentos. Estas moléculas de cDNA são executados juntamente com as reacções de sequenciação de Sanger tradicional ² em géis desnaturantes de poliacrilamida e podem ser detectadas pela sua fluorescência devida à utilização de iniciadores marcados com fluorescência. Os comprimentos dos fragmentos de cDNA são então avaliadas por comparação com a escada de sequenciação, permitindo que o mapeamento dos terminais 5 'de RNA.

Tradicionalmente, as reacções de extensão de iniciadores são utilizados em conjuntocom isótopos radioactivos para detectar moléculas de cDNA em películas de raios-X. Devido aos riscos de saúde, problemas de eliminação de resíduos e facilidade de manuseamento, os protocolos mais recentes utilizam fluorescência para a detecção da extensão do iniciador com sequenciadores automatizados, embora a sua sensibilidade é ligeiramente inferior. Usando primers marcados com fluorescência, o procedimento da marcação recorrentes podem ser omitidos, como iniciadores fluorescentes são estáveis ​​por um longo tempo (mais de um ano em nossas mãos).

O método aqui descrito utiliza um sequenciador automatizado de gel, mas com ligeiras modificações, sequenciadores capilares podem também ser utilizados para a separação e detecção de cDNA ^3. A natureza paralela de análise de gel faz com que seja possível detectar mesmo uma pequena quantidade de clivagem ou processamento de RNA. Outra vantagem é a elevada resolução deste método, como clivagem ou mesmo um tratamento de base terminal pode ser detectado.

No que diz respeito à detecção de clivagem de RNA ou de transformação, typically dois diferentes tipos de extensões de primer são distinguidos. Em um caso, o tratamento enzimático é realizado in vitro utilizando ARN purificado e enzima purificada, enquanto que no outro caso, o processamento é realizado in vivo, e o ARN resultante é purificado. Em ambos os casos, o ARN é sujeito a uma extensão de primer efectuada in vitro, no entanto, dependendo da fonte de RNA, o método é chamado tanto uma extensão do iniciador in vivo, in vitro ou in. No protocolo apresentamos aqui, nos concentrarmos apenas na extensão do iniciador in vivo, por causa da facilidade de utilização (não há proteínas purificadas necessário) e a possibilidade de determinar pontos de partida da transcrição e processamento ao mesmo tempo. No entanto, in vitro extensões de primer são, em princípio, criado da mesma maneira e este protocolo pode servir como um ponto de partida.

O método ilustrado aqui pode ser aplicado a muitas espécies de bactérias, desde que eles são passíveis de altapureza e elevado rendimento de preparação de ácidos nucleicos.

A pesquisa em nosso laboratório centra-se no âmbito regulatório da toxina-antitoxina (TA) Sistemas de ^4,5, um campo em que o método de extensão do primer é usado extensivamente. TA-sistemas são pequenos elementos genéticos presentes nos genomas procarióticos que consistem de uma proteína tóxica e estável endogenamente activa e uma proteína ou RNA antitoxina na maior parte instável, que neutraliza a toxicidade ^6,7. A actividade da toxina é por vezes exercida pela inibição da replicação, síntese da parede celular ou outros mecanismos, mas na maioria das vezes pela actividade de ARNase ^8,9. Tipicamente, a RNase especificidade é determinada através da realização de testes diferentes, um dos quais é o método de extensão do primer. Reacções de extensão de iniciadores são adequados para esta aplicação, como uma mistura de fragmentos de comprimento completo e clivados podem ser simultaneamente analisadas para determinar suas extremidades 5 '. Usando uma mistura de in vitro e in vivo em extensões de iniciadores, otoxina de clivagem específico de RNase, por exemplo, a especificidade de sequência pode ser determinada ^10-13.

Figura 1. Visão geral do procedimento de extensão do primer. As culturas bacterianas são incubados e tratados de acordo com as necessidades experimentais. O RNA total é extraído das células, tratadas com ADNase I para remover os vestígios de ADN e submetidos a uma reacção de transcrição inversa utilizando iniciadores fluorescentes específicos de ADN alvo produzindo cDNA. O ADN genómico ou plasmídeos são extraídos e subsequentemente utilizada para a fluorescentes reacções de sequenciação de Sanger para comparação do tamanho com fragmentos de cDNA. Produtos de extensão dos iniciadores são executados juntamente com os produtos de sequenciação de Sanger sobre um gel de poliacrilamida desnaturante de ureia e analisadas com um microscópio a laser e automatizado. A base de seqüenciamento que se alinha com a banda de cDNA é a last base da extremidade 5 'de cDNA (seta azul). Mais informações em Fekete, et al. ³ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma visão geral de todo o processo de extensão do primer pode ser encontrada na Figura 1. Resumidamente, as células bacterianas são cultivadas, colhidas, o sedimento de células lisadas e o RNA extraído. RNA purificado é então tratado com ADNase I para remover vestígios de moléculas de ADN, que possam actuar como modelos para a transcriptase reversa. Iniciadores fluorescentes específicos são adicionados ao ARN, hibridados com a região de interesse e subsequentemente objecto de transcrição reversa, resultando numa única cadeia de ADN complementar (cDNA). Uma escada de sequenciação é criado por sequenciação de Sanger tradicional utilizando iniciadores fluorescentes e separados num gel de poliacrilamida desnaturante a par dos fragmentos de cDNA de extensão de iniciadores. A resultantegel é analisado por comparação das bandas fluorescentes, permitindo a identificação de terminais 5 'de interesse. Pontos de partida de transcrição e locais de processamento são, então, avaliados individualmente pela comparação de seqüências.

1. High Yield RNA Preparação

1. Isolamento de ARN
   NOTA: As elevadas concentrações de ARN total são necessários para a reacção de extensão do iniciador. Kits de coluna spin normalmente não produzem a quantidade de ARN necessária (~ 5-16 ug em 5 ul de volume). Portanto, recomenda purificação utilizando o método de extração de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidina ácido, descrito abaixo.
   NOTA: O fenol é cancerígeno, tóxico e corrosivo. Por favor, leia as folhas de dados de segurança e usar sob um exaustor com proteção adequada!
   1. Crescer ou tratar as células bacterianas (S. aureus ou E. coli neste exemplo) como desejado e colheita por 10 minutos de centrifugação a 4.600 x g e 4 ° C. Nota: Tipicamente nós colher um total de OD ₆₀₀ de 20 - 70. Os sedimentos celulares podem ser armazenadas durante várias semanas a -20 ° C.
   2. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio ácido e transferir para um2 ml parafuso copo contendo 0,5 ml de 0,1 milímetros pérolas de vidro de zircônio / sílica.
   3. Lyse as células três vezes em uma batedeira de preparação rápida / talão de 6,5 m / s por 30 s por três rodadas, resfriamento as amostras em gelo durante 5 minutos após cada ensaio. Nota: amostra homogeneizada pode ser armazenado a -80 ° C durante várias semanas.
   4. Incubar lisado durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar 200 ul de clorofórmio.
   5. Sacudir vigorosamente ou vortex a amostra por 30 segundos para extrair RNA.
   6. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min, em seguida, centrifuga-se durante 15 min a 13.000 - 15.000 x g e 4 ° C. Nota: Os solventes são separados em uma fase orgânica inferior (rosa, contém proteínas), uma interfase (branco, contém ADN) e uma fase aquosa superior (claro, contém RNA).
      NOTA: A partir deste passo sobre o uso de apenas RNase reagentes livres e utensílios de plástico!
   7. Prepare fresco livre de RNase 1,5 ml tubos de reação, etiqueta de forma adequada e adicionar cerca de 500 mL de 100% RNase livre isopropanol cada (utilizar aproximadamente o mesmo volume como a fase aquosa no tubo anterior).
   8. Segurar o tubo em ângulo e transferir a fase aquosa (cerca de 500 ul) para os tubos preparados utilizando RNase pontas livres. Não perturbe a interfase.
   9. Precipitar o ARN invertendo diversas vezes e incubando durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   10. Centrifugar as amostras durante 15 minutos a 13.000 - 15.000 × g e 4 ° C e remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração (bomba de jato de água e mamadeira). Não perturbar o pellet de RNA branco transparente na parte inferior.
   11. Adicionar 1 ml de etanol 70-80% RNase livre (não vortex) para lavar. Nota: o ARN em etanol podem ser armazenadas durante várias semanas a -20 ° C.
   12. Centrifugar durante 5 minutos a 7.500 x g e 4 ° C e desprezar o sobrenadante por pipetagem ou de preferência aspiração.
   13. Air pellet RNA seco para 15-30 min sob a coifa. Não overdry, caso contrário, pelotas pode ser difícil de dissolver.
   14. Ressuspender o sedimento em 50 mL de RNase livre DDH ₂ O ou tampão de armazenamento RNA.
   15. Medir a concentração de RNA com um espectrofotômetro microvolume UV-Vis ou uma tina de quartzo (e fotômetro convencional) e proceder à DNase I digestão.
2. ADNase I digestão de ARN para remover vestígios de ADN
   Observação: Uma vez que o ADN pode actuar como um modelo espúrio na reacção de transcrição reversa (extensão do iniciador), ele deve ser removido a partir da amostra. Vários métodos para a remoção de DNA a partir de soluções de ARN estão disponíveis que geralmente dependem de digestão de DNase. Um método simples, mas eficaz e de custo eficiente para a remoção de DNA está indicado a seguir.
   1. Pré-aqueça o banho de água a 37 ° C.
   2. Misturar os compostos listados na Tabela 1 em um tubo de 1,5 ml de reacção.
   3. Incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C num banho de água, e, em seguida, seguir diretamente para a extracção com fenol / clorofórmio. Nota: inativação Calor da DNase I não é recomendado, pois isso pode degradar o RNA.
3. Extracção com fenol / clorofórmio, o ARN com DNase I, após digestão
   NOTA: O ARN devem ser purificados para remover os nucleótidos livres, fragmentos de ADN e os componentes do tampão a partir da digestão com DNase I. Extracção com fenol / clorofórmio permite uma elevada recuperação e concentração da amostra de RNA e, por conseguinte, está indicado a seguir. Outros métodos de purificação de RNA também pode ser usado, desde que satisfaçam esses requisitos.
   1. Dividir a DNase 500 ul I digestão misturar em duas amostras de 250 ul em 2 ml tubos de reacção.
   2. Adicionar 1 volume (250 uL) de / solução ácida P C / I (em água saturada de fenol, clorofórmio e isopentanol, proporção de 25: 24: 1, pH 4,5 - 5).
      NOTA: / C / I solução P é cancerígeno, tóxico e corrosivo. Por favor, leia as folhas de dados de segurança e usar sob um exaustor com proteção adequada!
   3. Vigorosamente vórtice ou coloque em uma plataforma vórtex para 1-3 min.
   4. Centrifugar durante 30 minutos a 13.000 - 15.000 x g e 4 ° C.
   5. Recolher a fase superior (aquosa) e transferir para um tubo fresco (250 ul).
   6. Adicione 1/9 do volume (28 ul) de 3 M de acetato de sódio pH 5,2.
   7. Adicionar 2,5-3 volumes de etanol puro (700 ul).
   8. Misturar em vortex e logo lugar a -80 ° C durante 30 min ou a -20 ° C durante 2-3 horas. Se necessário, armazenar o ARN O / N à temperatura de -20 ° C.
   9. Centrifugar durante 30 - 60 min a 13.000 - 15.000 x g e 4 ° C.
   10. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
   11. Lavar pelete por adição de 1 ml de etanol a 70% sobre o sedimento. Não amostra vórtice.
   12. Centrífuga amostra durante 5 minutos a 13.000 - 15.000 x g e 4 ° C.
   13. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
   14. Air pellet seco sob a coifa. Armazenar o sedimento a -20 ° CO / N se necessário.
   15. Dissolve-se o pellet em 30 ul tratada com DEPC _H2O em vortex durante 2 min e usar esta solução para dissolver o pellet do segundo tubo correspondente por amostra (30 solução ul por um par de extração).
   16. Medir a concentração de RNA, e garantir que ele seja superior a 1 mg / mL para uso em extensão do primer de mRNAs expressos em média.
   17. Se necessário, o ARN armazenar a -20 ° C durante várias semanas até meses.

2. Primer Extension Reaction

1. Projeto Primer
   NOTA: Ao projetar primers para uma cartilha de extensão experiência, obedecer as diretrizes gerais de desenho de primers PCR (consulte o manual que acompanha o sequenciador gel automatizado para mais seção de informações e discussão neste artigo).
   1. Especificamente, assegurar que os iniciadores (i) não contêm pistas de bases, (ii) possuem um G ou C na extremidade 3 ', (iii) têm um GC equilibrada: AT proporção, (iv) tem uma temperatura de recozimento de cerca de 55-60 ° C e (v) se ligam, pelo menos, 50 pb, 100 pb melhor a jusante da região de interesse para receber imagens claras.
2. Reacção de extensão do iniciador
   NOTA: A reacção de extensão do iniciador (síntese de ADNc) requer grandes quantidades de ARN de modelo. Se as quantidades de RNA utilizadas são escolhidas para baixo, o sinal pode ser muito baixo para detectar! Portanto, recomendamos a purificação do ARN, tal como descrito acima.
   NOTA: CUIDADO: Use RNase reagentes livres e plásticas !!!
   1. Pré-aqueça o termo-reciclador a uma temperatura de 95 ° C e levar a cabo todos os passos de incubação em mais um termo-reciclador para facilidade de uso e reprodutibilidade.
   2. Misturar os compostos da Tabela 2, num tubo de PCR para cada amostra de RNA.
   3. Desnaturar as amostras durante 1 min a 95 ° C.
   4. Colocar os tubos em gelo e frio durante 5 min para hibridar RNAs e iniciadores.
   5. Defina a máquina de PCR a 47 ° C.
   6. Enquanto isso preparar a mistura principal de transcrição reversa, tal como descrito na Tabela 3.
   7. Adicionar 4 ul de mistura principal de transcrição reversa para cada RNA hibridadaamostra.
   8. Incubar os tubos durante 1 hora a 47 ° C. Nota: A temperatura óptima para AMV RT é de 42 ° C, as temperaturas mais elevadas no entanto ajudar a superar estruturas secundárias das moléculas de RNA.
   9. Parar a reacção por aquecimento das amostras a 95 ° C durante 2 min.
      NOTA: Formamide é corrosivo, tóxico e pode ser prejudicial para o feto. Por favor, leia as folhas de dados de segurança material, manusear com cuidado e usar proteção adequada!
   10. Adicionar 6 ul de corante de carga de formamida (95% (v / v) de formamida desionizada, 10 mM de EDTA, 0,05% (w / v) de azul de bromofenol) e armazenamento de O / N a duas semanas à temperatura de -20 ° C no escuro.

3. Preparação da Escada Sequencing

NOTA: A reação escada sequenciamento requer ou quantidades moderadas de plasmídeos ou grandes quantidades de DNA genômico. Sempre que possível, o uso de plasmídeos na sequência de reacção é recomendado devido à facilidade de isolamento e de alta sigintensidade nal. Em outros casos, que rotineiramente usar um método de Marmur ^5,14 adoptada para preparar DNA genómico a partir de E. coli e S. aureus células sem a necessidade de utilizar fenol. Em princípio, qualquer método que produz elevadas quantidades e pureza de ADN genómico pode ser utilizado.

1. Isolamento de DNA genómico
   1. Cresça 10 ml de E. coli ou S. células aureus O / N em LB, BM ⁵ ou meio TSB.
   2. Células colheita por centrifugação durante 10 min a 4600 × g num tubo Falcon de 15 ml.
   3. Pelota foi ressuspensa em 2 ml de tampão P1 como encontrado em alguns kits de preparação de mini (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de EDTA, 100 ug / ml de RNase A).
   4. Lisar células para 45 - 60 min com 20 - 40 ul lisostafina (0,5 mg / ml, de armazenamento a -20 ° C). Nota: Para E. células de E. coli o pré-tratamento enzimático pode ser omitidas ou lisozima utilizados.
   5. Adicionar 100 ul de solução saturada de SDS-(em 45% de etanol) à suspensão e incubate durante 5 min a 37 ° C.
   6. Adicionar 650 mL 5 M NaClO ₄ e as células brevemente vórtice.
      NOTA: O clorofórmio é um potencial cancerígeno. Por favor, leia as folhas de dados de segurança e usar sob um exaustor com proteção adequada !!!
   7. Adicionar 3 ml de clorofórmio / isopentanol (24: 1 ratio) à mistura e agitar durante pelo menos 60 seg. Nota: O líquido deve se transformar em uma emulsão branca homogénea.
   8. Centrífuga amostra durante 10 min a 4.600 x g e RT para separar as fases.
   9. Transferir cuidadosamente a fase límpida superior (aquosa) para um tubo fresco. Se a solução estiver turva, repetir a extracção de clorofórmio / isopentanol. Medir o volume da solução de DNA e preparar um tubo fresco com 2 volumes de etanol (100%).
   10. Lentamente decantar ou pipetar a solução de DNA em etanol contendo o tubo. Nota: DNA deve precipitar, bobinas densas como transparentes no fundo ou quando completamente desidratado como um aglomerado branco flutuante.
   11. Recuperar o DNA usando ganchos feitos a partir de pipetas de Pasteur de vidro (Figura 2) e lava-se cada uma das amostras duas vezes por imersão em um tubo individual de 1 ml de etanol de 70%.
   12. Coloque os ganchos na posição vertical em um rack e secar o sedimento por 60 min. Se necessário, o ADN armazenar seco durante vários dias à TA.
   13. Dissolve-se o ADN por romper os ganchos de vidro coberto de ADN e colocando em um tubo de 2,0 ml de reacção contendo 100 - 500 ul ddH ₂ O. Ajustar o volume para uma concentração final do DNA 1000 - 1500 ng / mL. Para uma reacção de sequenciação, utilizam 10-18 ug de ADN genómico.

Figura 2. Instruções sobre a forma de criar uma cana de pesca de ADN. Segurar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro para a chama de um bico de Bunsen. Isto faz com que o vidro para começar a derreter após vários segundos, criando um pequeno gancho em tele termina. Remover rapidamente do fogo e deixe esfriar por 1 min.

2. Plasmídeo Isolamento
   1. Preparar os plasmídeos utilizando estojos de mini-preparação padrão e dissolvem-se em tampão de eluição (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Dependendo do tamanho do plasmídeo, usam 100 - 500 ng de plasmídeo de uma escada de sequenciação.
3. Reação Sanger Sequencing
   NOTA: O abaixo um protocolo simples, que utiliza um kit de sequenciação com iniciador marcado por fluorescência 7-desaza-dGTP que funciona bem para a finalidade de extensões de iniciador. Consulte o manual do kit de seqüenciamento para obter informações detalhadas. Por favor note que a reacção de sequenciação deve usar o mesmo iniciador como a reacção de extensão do iniciador para criar produtos com o mesmo comprimento.
   1. Misturar 12 ul de ADN genómico (~ 10 - 15 ug) com 1 ul de DMSO e 1 ul iniciador marcado de modo fluorescente (2 pmol / ul).
   2. Para cada um dos quatro ul de misturas de reacção de sequenciação (A, C, G ou T), adicionar 3 ul de DNA / DMSO / mistura de iniciadores.
   3. Coloque as amostras em uma máquina PCR, e executar o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 20 seg, 54 ° C durante 20 seg, 70 ° C durante 30 seg; manter a 4 ° C para sempre.
   4. Após a corrida, remover as amostras a partir da máquina, adicionar 6 ul de corante de carga e armazenar em gelo (a curto prazo) ou a -20 ° C durante vários dias a semanas.

4. Setup Gel e Aparelho Run

NOTA: informação pormenorizada sobre a forma como o aparelho é montado gel de sequenciação, o gel é preparado e como o gel é executado pode ser encontrada no protocolo do fabricante.

1. Preparativos
   1. Prepare 10x TBE como indicado na Tabela 4.
   2. No dia da execução do gel preparar 1 L de tampão 1 x TBE com ultrapura ddH ₂ O.
   3. Prepare a 10% (w / v) de APS. Nota: Pode ser armazenado em alíquotas de 200 uL a -20 ° C durante vários meses, mas a actividade pode diminuir ao longo do tempo <./ Li>
2. Assembléia de gel câmara de moldagem
   1. Evite o pó ea sujidade entre as placas de vidro. Superfícies de trabalho, portanto, completamente limpas usando lenços umedecidos.
   2. Limpar um par de chapas de 25 centímetros de vidro usando toalhas de papel descartáveis ​​e água destilada em ambos os lados e, em seguida, isopropanol para o lado interior das placas de vidro.
   3. Coloque 0,25 milímetros espaçadores na placa de vidro traseira e baixar a placa de vidro dentada na parte superior (Figura 3).
   4. Conecte os trilhos de gel para ambos os lados das placas de vidro com a extremidade entalhada e os pilotos entrada trilho viradas para cima e apertar botões levemente.

Figura 3. Vista explodida das placas de vidro de electroforese de gel. Placas de vidro deve ser usado direcionalmente. Cuidar para enfrentar o lado interior das placas de vidro para o interior e o exterioro outro para o exterior.

Figura 4. Vista de um aparelho de gel montado. Depois de injectar a solução de gel, do bolso do espaçador é colocado na solução entre as placas de vidro. A placa de fundição é, então, deslizou entre a placa de vidro da frente e os trilhos de gel e protegidas pelo apertar os botões ferroviários.

3. Lançando o gel
   NOTA: a acrilamida não polimerizada é neurotóxico! Por favor, leia as folhas de dados de segurança e usar com a proteção adequada !!!
   1. Adicionar os compostos listados na Tabela 5 para uma proveta e misturar utilizando uma barra de agitação e um agitador magnético.
   2. Imediatamente após a adição de APS e TEMED, levar até a solução de gel em uma seringa de 50 ml e coloque um filtro de 0,45 nm na ponta.
   3. Ou segurar a borda superior da placa de vidro com uma mão ou colocar o sandwich em um casting gel se para criar uma inclinação angular 10-20 °.
   4. Dispensar lentamente a solução do gel de entre as placas de vidro enquanto se move continuamente a ponta da seringa a partir de um lado para o outro e parar uma vez que a solução de gel se encontra com o fim de fundo.
   5. Mover-se para o lado ou remover completamente as bolhas formadas usando um gancho de bolha.
   6. Deslize o espaçador bolso gel (0,25 mm) entre as placas de vidro na extremidade entalhada, mergulhe na solução de gel e corrigir, anexando a placa de casting.
   7. Parafusos do trilho superior Aperte levemente (Veja a Figura 4 para aparelho totalmente montado).
   8. Vamos conjunto gel para 1-2 horas.
   9. Remova a placa de elenco e bolso espaçador e limpar o bolso de sal e resíduos de gel.
   10. Enxágüe com DDH ₂ O e limpe o excesso de solução com papéis de seda.
4. Executando e visualizando o gel
   NOTA: Os geles de sequenciação são directamente sujeitos a electroforese em gel de o gerador de imagens, enquantoa fluorescência é detectada simultaneamente através de um microscópio de laser. Em contraste com a electroforese em gel convencional, onde o gel é executado em primeiro lugar e, em seguida, coradas e visualizados, a unidade de detecção é fixo e examina as bandas em tempo real, à medida que passam a laser. Abaixo um procedimento para o software de coleta de dados ImagIR no OS / 2 está delineado, que pode ser adotado para as versões mais recentes. Para mais informações consulte o manual do usuário.
   1. Deslize o suporte do tanque de reserva para os trilhos de gel sobre as placas de vidro da frente e apertar os botões.
   2. Coloque gel no tanque de gel inferior do gerador de imagens de gel automatizado contra a placa de aquecimento e fixar fazendo deslizar o piloto entrada trilho nos suportes de aparelhos.
   3. Preencha tampão TBE 1x para as câmaras de amortecimento em gel inferior e superior, feche a câmara tampão inferior e ligar a câmara tampão superior à energia usando o cabo de alimentação.
   4. Se estiver presente, limpar o bolso gel de sal-resíduos por pipetagem repetidamente tampão no bolso.
   5. Feche a câmara de depósito de inércia superior usando a tampa do tampão de topo.
   6. Feche a porta da máquina e ligar o gerador de imagens e computador e iniciar o software de coleta de Base de Dados ImagIR.
   7. Crie um novo arquivo de projeto (File-> New ...), digite um nome de arquivo do projeto, selecione as faixas de laser apropriados (700 ou 800 nm) e confirme com OK.
   8. Selecione Opções> ganho Auto ... no menu de imagem no topo, clique em Auto para iniciar a medição de ganho automático e aceitar as configurações clicando em OK.
   9. Concentre-se o laser, selecionando Opções> Foco ... no menu de controle do scanner, clicando no botão Auto e aceitar as configurações clicando em OK.
   10. Repita o procedimento de ganho automático para ajustar-se à região recentemente focado.
   11. Configuração de controle do scanner de acordo com essas configurações: 2.000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, filtro de digitalização: 3, Velocidade de digitalização: 3.
   12. Prerun o gel vazia por 20 min (selecione ON tensão e pressione ).
   13. No entanto, aquecer a escada de sequenciação e os produtos de extensão de iniciadores numa máquina de PCR durante 2 min a 90 ° C, em seguida, arrefecer em gelo.
   14. Pare a eletroforese, abra o seqüenciador automático gel e retire a tampa do tanque de reserva superior.
   15. Inserir o dente de tubarão-pente, entre as placas de vidro e ligeiramente perfurar o gel com a dentes de tubarão (ver Figura 5).

Figura 5. Close-up vista de gel com pente de dentes de tubarão. Amostra (roxo) é aplicada entre os dentes de tubarão.

16. Pipeta ou 1 - 2 ul de produtos de extensão do primer ou reacções de escada de sequenciação em cada bolsa de gel (formado pelos dentes de tubarão).
17. Se são necessários nem todos os bolsos, encher os bolsos vazios com corante para evitar acomportamento corrida consistente.
18. Feche a porta do tanque de armazenamento e do sequenciador gel.
19. Comece eletroforese e ligue a laser (Select Tensão ON e Laser ON e pressione ).
20. Pare de eletroforese uma vez a região de interesse passou a laser.

Como representado na Figura 6, uma reacção de extensão do iniciador pode ser utilizado para determinar os pontos de partida da transcrição de transcritos de interesse e pode ajudar a deduzir regiões promotoras (tipicamente identificados por elementos de -10 e -35). O nível superior (mais longa) fragmento de cDNA representa o "fim do ARNm 5 e, portanto, pode ser facilmente mapeada quando comparada com a escada de sequenciação.

Figura 6. representativas resultado de uma reacção de extensão do iniciador. No lado esquerdo um total in vivo cartilha extensão gel de E. coli com diversos plasmídeos é mostrado. Áreas individuais de interesse são ampliadas. Na parte superior (A), a determinação do ponto de partida da transcrição está representado ompA. A transcrição reversa pára na extremidade 5 'do mRNA e cria, assim, uma banda de ARN de comprimento completo (indicated por uma seta). Ao alinhar a banda de cDNA com a escada de sequenciação, a extremidade 5 'do mRNA pode ser determinado como se mostra na sequência de acompanhamento. Na parte inferior (B), a clivagem do transcrito ompA pela RNase YoeB-seq2 é mostrado. As pistas 1-3 representam as amostras em que a toxina YoeB-seq2 está em falta ou inactivos, enquanto que as pistas 4-5 representam as amostras com uma RNase activa, que coincide com a presença e ausência de produtos de cDNA. Dois principais produtos de clivagem são criados conforme indicado pelas setas. O ddNTP utilizado em cada pista e a base de ARN correspondente da escada de sequenciação é rotulado. Peças de transcrição são indicadas por fonte azul, elementos promotores e agosto codão por fonte magenta. Para mais informações; consulte o artigo original da investigação Nolle et al., Microbiology 159, 1575-1585 (2013). Por favor, clique aqui paravisualizar uma versão maior desta figura.

No exemplo mostrado na Figura 6, o TSP do ARNm de ompA foi determinada como sendo uma base de G (marcada com uma seta na sequência abaixo do gel). Isto é consistente com o ompA TSP publicada antes de ^15. Os elementos de -35 e -10 do promotor pode ser deduzido para ser TTGTAA e TAGACT ¹⁶ como os motivos diferem apenas duas bases de cada uma das suas respectivas sequências de consenso (TTGACA e TATAAT respectivamente).

Em contraste com outros métodos, tais como 5 'RACE, as reacções de extensão do iniciador pode ser utilizada para determinar com precisão e quantificar a clivagem de moléculas de RNA. A clivagem de moléculas de RNA cria livres as extremidades 5 ', as quais podem ser simultaneamente detectados como bandas de cDNA no gel. Identificar vários produtos de clivagem de um mRNA é mais difícil em cinco "experiências de corrida, uma vez que vários produtos de PCR deve ser sequenciado para obter produtos de dissociaçãoque representam apenas uma pequena fração do total (não processado) bulk RNA.

Na parte inferior da Figura 6, o mapeamento de ARN da clivagem por uma RNase está representado. Como descrito anteriormente ^5, a RNase YoeB-seq2, parte de um sistema de S. TA equorum ^17, cliva mRNAs perto do codão de iniciação. Esta clivagem pode ser inibida pelo anti-toxina YefM-seq2 cognato. Quando a RNase YoeB não está presente ou inactivo (pistas 1-3), não há produtos de extensão dos iniciadores são formados perto do codão de iniciação. Sempre que está presente actividade de ARNase (pistas 4 & 5), duas bandas fortes logo a jusante do codão de início apresentado. Utilizando esta abordagem, os padrões de clivagem pode ser facilmente identificado.

A Figura 7 ilustra uma experiência de extensão de iniciador falhou. Devido ao excesso de ARN na reacção de transcrição reversa, a quantidade gerada de cDNA cria um sinal tão forte, que a banda de cDNA individuaiss não podem ser distinguidos. Isto faz 5 'determinação do final de ARN impossível.

Quando se utiliza ARN altamente expressos na reacção de extensão do iniciador, tal como um ARN ribossomal (como representado na Figura 7), o risco de sobre-expostas áreas aumenta. Portanto, a quantidade de RNA modelo total deve ser ajustado para a abundância do ARN de interesse. Em contraste, quando os transcritos de interesse constituem apenas uma pequena quantidade do ARN total, a quantidade na reacção de transcrição reversa deve ser aumentada, caso contrário, os sinais serão muito fraca (não mostrada). Isto também se aplica à reacção de sequenciação de Sanger, como modelos de múltiplas cópias por célula (tais como genes de rRNA ou genes codificados em plasmídeos) resultar em sinais muito mais fortes.

Figura 7. resultado Representante de uma extensão do primer com falha do ng> S. aureus. 16S RNA é altamente abundante em células bacterianas. Isto conduz a sinais de transcrição reversa fortes quando quantidades moderadas de ARN total são utilizados. No caso representado aqui, as bandas fortes mascarar o cDNA exacto extremidade 5 'e, portanto, impedir 5' mapeamento. Além disso, RNAs ribossomais são altamente estruturadas e, portanto, podem terminar prematuramente a transcrição reversa, produzindo produtos de ADNc curtos que não representem fragmentos de comprimento total. Neste caso o aumento da temperatura de transcrição reversa, em conjunto com uma transcriptase reversa resistente ao calor pode torná-lo mais fácil de sintetizar estruturas secundárias últimos. Devido a múltiplas cópias da sequência no ADN genómico, a escada de sequenciação de Sanger é mais forte do que para os genes de cópia única. Para melhorar a imagem de gel, RNA e DNA ascende para a transcrição reversa e reacção Sanger deve ser reduzida e / ou menos do produto aplicado ao gel._upload / 52134 / "target =" _ 52134fig7large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: a digestão com DNase I de ARN.

Volume de reacção e quantidade de ADNase I podem ser ajustados para cima ou para baixo, dependendo da quantidade of RNA usado.

Tabela 2: Primer ARN-hibridação.

Configure uma reação por amostra de RNA e primer.

Tabela 3: mix mestre extensão Primer.

Escale até o número de reações necessárias.

Tabela 4: 10x TBE receita.

Filtro para remover poeira e fiapos e armazenar a 4 °C.

Tabela 5: Receita gel de seqüenciamento.

Processo de solução de gel rapidamente após a adição de TEMED e APS.

Extensão do iniciador fluorescente é um método simples e rápido para a determinação extremidades 5 'dos ​​RNAs, quer para identificação TSP- ou processamento de RNA secundário. Devido ao uso de iniciadores fluorescentes, as reacções podem ser configurar e executar, sem precauções de segurança adicionais (ao contrário do caso de iniciadores marcados radioactivamente). Como as amostras são detectadas por fluorescência, que pode ser convertido em imagem, enquanto a electroforese está em progresso que permite a análise rápida em comparação com os métodos radioactivos, onde filmes de raios-X são comummente utilizadas.

Em geral, a qualidade da reacção de extensão do iniciador é fortemente dependente do grau e as capacidades de ligação do iniciador. Se o local de ligação é escolhido demasiado perto da área de interesse, esfregaços de iniciadores pode mascarar o sinal, enquanto que um sítio de ligação demasiado longe (> 300 pb) a partir da extremidade 5 'pode resultar em um sinal fraco.

O corante fluorescente deve ser ligado de forma covalente aoExtremidade 5 'do oligonucleótido durante a síntese de ADN sob encomenda e o oligonucleótido deve ser purificado por HPLC para evitar a interferência com a reacção de transcrição reversa por sais residuais. Os oligonucleotídeos com modificação corante adequado (consulte a tabela da lista de reagentes para mais informações sobre os corantes compatíveis) podem ser encomendados a partir de a maioria das empresas de síntese oligonucleotídeo e deve ser armazenado no escuro. Infelizmente, não temos conhecimento de todas as técnicas enzimáticas para fixar o corante para oligonucleotídeos previamente existentes, como é possível com nucleotídeos radiomarcados.

No sistema de sequenciação descrito aqui, dois corantes fluorescentes diferentes podem ser utilizados para detectar simultaneamente duas amostras, como a sua excitação (cerca de 700 e 800 nm) e os espectros de emissão são distintos. Para além dos corantes originais do fabricante, outros corantes, como indicado na lista de reagentes podem ser utilizados para produzir excelentes resultados.

Outro fator importante para a prImer reacções de extensão é a qualidade e quantidade do RNA. Cuidados devem ser tomados para remover contaminantes de DNA, como transcriptases reversa, como o AMV RT pode usar DNA como um modelo ^18.

Como mostrado na Figura 7, a intensidade do sinal detectado de bandas no gel de execução é dependente da quantidade de RNA usada na reacção de transcrição reversa. É, portanto, essencial para ajustar a quantidade de ARN total, dependendo da quantidade proporcional do ARN de interesse presente na amostra. A baixa sensibilidade deste método é também uma das suas desvantagens, como RNAs expressos baixos pode ser difícil de detectar. Se não há sinais podem ser detectados de todo, a quantidade de RNA total pode ser aumentado ou o ARN de interesse pode ser sobre-expresso artificialmente a partir de um plasmídeo.

Gel de sensibilidade de detecção de fluorescência para a base da extensão do iniciador é de cerca de factor dez menor do que ³² ou ³³ P P radioisótopo base da extensão do iniciador ¹⁹. No entanto, esta desvantagem pode ser compensada através do ajuste da quantidade de cDNA carregado no gel ou por aumento da quantidade de molde de ARN utilizado na reacção de transcrição reversa. Na maioria dos casos, a sensibilidade é alta o suficiente para resultados satisfatórios ^4,5. Sensibilidades semelhantes a extensões de primers radioativos foram relatados ao usar primers fluorescentes em combinação com um sequenciador capilar ^3, com a vantagem de curtos períodos de exposição.

Custos comparações entre fluorescência e radioatividade base extensões de primers são difíceis, uma vez que dependem de vários fatores, tais como máquinas disponíveis, primários, reações escada, disponibilidade e manutenção de um laboratório para o trabalho com substâncias radioactivas, eliminação de resíduos radioativos, treinamento e riscos de saúde individuais . Primers fluorescentes são cerca de cinco a dez vezes mais caro do que primers padrão não marcadas (20 pb). No entanto, estes iniciadores podem ser utilizados para, pelo menosum ano (mais prováveis ​​vários anos) em comparação com ³² P iniciadores marcados, que têm uma meia-vida muito mais curto. Re-rotulagem dos primers é demorado e caro, devido à necessidade de novo material radioativo em intervalos freqüentes. Se o mesmo conjunto de iniciadores é usado ao longo de um período de tempo longo, iniciadores fluorescentes são mais baratos do que os iniciadores regulares, marcados radioactivamente. O principal ponto de custo será, contudo, o seqüenciador fluorescente ou imager e adquirir este aparelho exclusivamente para a finalidade de extensões de primer pode não ser rentável. O método descrito aqui é bastante interessante para os grupos que estão na posse de ou têm acesso a tal máquina.

Se um sequenciador automatizado de gel não está disponível, outros métodos para a detecção de fluorescência pode ser utilizado como bem. Neste caso, o gel pode ser executado num aparelho de electroforese padrão, secou-se, se necessário, e, em seguida, transferida para um gerador de imagens fluorescentes (modelos estão disponíveis, que são semelhantes aos de uma flscanners atbed). Embora a vantagem da visualização do gel durante a corrida é perdida, a utilização de isótopos radioactivos pode ser evitada desta forma, uma vantagem importante para o experimentador. Além disso, se disponível, um sequenciador capilar pode ser utilizado para a separação e detecção em tempo real, o que pode ajudar a aumentar a sensibilidade.

Vários métodos têm sido publicados sobre como usar a extensão do iniciador fluorescente com máquinas de sequenciamento automatizado de gel ou seqüenciadores capilares, entretanto esses métodos muitas vezes requerem um passo cDNA precipitação para concentrar a amostra (e remover as impurezas) ^19. No método aqui apresentado, a precipitação de ADN não é necessária, reduzindo assim o tempo de preparação. Mais importante, no entanto, a omissão deste passo faz com que seja possível a semi-quantitativamente determinar a quantidade de moléculas de RNA na amostra tal como as inconsistências do processo de precipitação pode ser eliminado.

Deve notar-se, que emboraas extremidades 5 'das moléculas de ARN pode ser mapeado em reacções de extensão de iniciadores, processados ​​e extremidades primárias (pontos de partida da transcrição) não podem ser facilmente distinguidas. Para contornar essas restrições, planejamento meticuloso dos experimentos com controles adequados é essencial. As sequências promotoras óbvias podem indicar a presença de um ponto de partida da transcrição e mutantes ou eliminar os elementos do promotor deve então abolir bandas de cDNA. Por outro lado, se tais sequências estiverem ausentes ou sequências de consenso específicas estão presentes, as bandas podem ser causados ​​por processamento do ARN. Se a enzima de processamento é conhecido e pode ser purificado, in vitro extensões de iniciador pode trazer clarificação, como transcrição e processamento podem ser separados. Além disso, outros métodos, tais como 5 'RACE (incluindo o enriquecimento enzimática de moléculas de ARN não transformados) pode complementar as extensões de iniciadores para distinguir sítios de início da transcrição a partir de processamento de RNA.

The método de extensão primer é muitas vezes comparado a outros métodos, como 5 'RACE e S1 nuclease ensaios de proteção e, portanto, a sua utilidade é muitas vezes questionada. Técnicas RNAseq em combinação com o sequenciamento de próxima geração, por exemplo, pode ajudar a determinar TSPs e locais de processamento de muitos dos RNAs em paralelo, no entanto os encargos financeiros e trabalho bioinformatical necessário torná-lo bastante rentável para os RNAs individuais de interesse. 5'-RACE, por outro lado, é mais barato, e os resultados são mais fáceis de analisar, mas se os ARN são processados ​​em várias formas ou vários pontos de partida da transcrição está presente, o produto deve ser clonado e uma grande quantidade de candidatos devem ser sequenciados para obter uma visão representativa dos RNAs de interesse.

Portanto, apesar de novos métodos tendo surgido ao longo dos anos, ainda hoje cartilha extensões têm a sua razão de ser, devido à facilidade de uso, baixo custo e tempo de resposta curto, o que é especialmente verdadeiropara o método de fluorescência com base aqui apresentados.

The authors have nothing to disclose that would present a conflict of interest.

We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the “priority programmes” SPP1316 and SPP1617.