Fluorescenza base tecnica Primer Extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di RNasi

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Fluorescenza estensione primer a base (FPE) è un metodo molecolare per determinare i punti di partenza di trascrizione o siti di trasformazione di molecole di RNA. Ciò è ottenuto mediante trascrizione inversa di RNA di interesse utilizzando specifici primer fluorescente e successiva analisi dei frammenti di cDNA risultante dalla elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide. Contemporaneamente, un tradizionale reazione di sequenziamento Sanger viene eseguito sul gel per mappare le estremità dei frammenti di cDNA alle loro basi corrispondenti esatti. In contrasto con 5'-RACE (Rapid Amplification di cDNA Ends), in cui il prodotto deve essere clonato e sequenziato più candidati, la maggior parte dei frammenti di cDNA generato dall'estensione del primer può essere simultaneamente rilevata in una corsa di gel. Inoltre, l'intera procedura (da trascrizione inversa di analisi finale dei risultati) può essere completato in un giorno lavorativo. Usando primer fluorescente, l'uso di isotopi radioattivi pericolosi reagenti etichettatopossono essere evitati e tempi di lavorazione sono ridotti come i prodotti possono essere rilevati durante la procedura di elettroforesi.

Nella seguente protocollo, si descrive un metodo di estensione in vivo di primer fluorescente per rilevare in modo affidabile e rapido l'estremità 5 'di RNA dedurre trascrizionale punti di partenza e siti di lavorazione RNA (ad esempio, dai componenti di sistema tossina-antitossina) a S. aureus, E. coli e altri batteri.

Estensione Primer ¹ è un metodo molecolare per determinare l'estremità 5 'di molecole di RNA specifici fino ad una risoluzione di una base. Il vantaggio di altri metodi come 5'-RACE (amplificazione rapida delle estremità del cDNA) è il tempo di ritorno veloce e la capacità di analizzare facilmente una miscela di diverse lunghezze di molecole di RNA.

Questo metodo funziona sottoponendo molecole di RNA per invertire le reazioni di trascrizione utilizzando primer fluorescenti specifiche, generando frammenti di cDNA di alcune lunghezze. Queste molecole di cDNA vengono eseguiti insieme reazioni di sequenziamento tradizionali Sanger ² su gel di poliacrilammide denaturante e possono essere rilevate da loro fluorescenza a causa dell'uso di primer fluorescente. Le lunghezze dei frammenti di cDNA vengono quindi valutati rispetto alla scala sequenziamento, consentendo la mappatura delle estremità 5 'RNA.

Tradizionalmente, le reazioni di estensione dei primer sono utilizzati in combinazionecon isotopi radioattivi per rilevare molecole di cDNA su film X-ray. A causa di rischi per la salute, problemi di smaltimento e maneggevolezza, protocolli più recenti utilizzano fluorescenza per la rilevazione del primer extension con sequenziatori automatici, benché la loro sensibilità è leggermente inferiore. Utilizzando primer fluorescente, la procedura di radio-marcatura ricorrenti può essere omesso, come primer fluorescenti sono stabili per un lungo periodo di tempo (più di un anno nelle nostre mani).

Il metodo che descriviamo qui utilizza un sequenziatore automatizzato gel, ma con lievi modifiche, sequenziatori capillari può essere utilizzato anche per la separazione cDNA e rilevamento ^3. Il parallelismo tra analisi del gel permette di rilevare anche una piccola quantità di RNA scissione o trasformazione. Un altro vantaggio è l'alta risoluzione di questo metodo, come scissione o la trasformazione anche di una sola base del terminale può essere rilevato.

Per quanto riguarda la rilevazione di RNA scissione o trasformazione, typically due diversi tipi di estensioni di primer si distinguono. In un caso, il trattamento enzimatico è fatto in vitro utilizzando RNA purificato e l'enzima purificato, mentre nell'altro caso, la lavorazione avviene in vivo e l'RNA risultante viene purificato. In entrambi i casi l'RNA viene sottoposto ad un primer extension effettuata in vitro, tuttavia, a seconda della fonte di RNA, il metodo o è chiamato un primer extension vivo o in vitro. Nel protocollo presentiamo, ci concentriamo esclusivamente sulla vivo primer extension in, a causa della facilità d'uso (non proteine ​​purificate necessario) e la possibilità di determinare punti di partenza trascrizionali e trasformazione in una sola volta. Tuttavia, in vitro estensioni di primer sono in linea di principio configurare allo stesso modo e questo protocollo può servire come punto di partenza.

Il metodo qui illustrato può essere applicato a molte specie batteriche purché siano suscettibili di altapurezza e alto rendimento preparazione di acidi nucleici.

La ricerca nel nostro laboratorio si concentra sulla portata normativa di tossina-antitossina (TA) Sistemi di ^4,5, un campo in cui è ampiamente utilizzato il metodo primer extension. TA-sistemi sono piccoli elementi genetici presenti nei genomi procariotici che consistono di una proteina tossica stabile e endogenamente attiva e una proteina o RNA antitossina lo più instabile che contrasta la tossicità ^6,7. Attività di tossina è a volte esercitata da inibizione della replicazione, sintesi della parete cellulare o altri meccanismi, ma il più delle volte per attività RNasi ^8,9. Tipicamente, RNasi specificità è determinata effettuando diverse prove, una delle quali è il metodo di primer extension. Reazioni primer extension sono adatti per questa applicazione, come miscela di frammenti di lunghezza clivati ​​e completi possono essere analizzati simultaneamente per determinare la loro 5 'estremità. Utilizzando un mix di in vitro e in vivo estensioni di primer, laspecifica RNasi clivaggio tossina, ad esempio, specificità di sequenza può essere determinata ^10-13.

Figura 1. Panoramica della procedura di primer extension. Le colture batteriche sono incubate e trattati in base alle esigenze sperimentali. L'RNA totale viene estratto dalle cellule, trattate con DNasi I per rimuovere tracce di DNA e sottoposti ad una reazione di trascrizione inversa utilizzando bersaglio specifici primer di DNA fluorescenti rendimento cDNA. Il DNA genomico o plasmidi vengono estratti e successivamente utilizzati per fluorescenti reazioni di sequenziamento Sanger per il confronto dimensioni con i frammenti di cDNA. Prodotti primer extension vengono eseguiti insieme a prodotti di sequenziamento Sanger su un gel denaturante di poliacrilammide di urea e analizzati con un laser automatico e microscopio. La base sequenziamento che si allinea con la band cDNA è il lav base 5 'del cDNA (freccia blu). Maggiori informazioni in Fekete, et al. ³ Fate clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una panoramica di tutta la procedura di primer extension può essere trovato in Figura 1. In breve, le cellule batteriche vengono coltivate, raccolte, il pellet cellulare lisato e l'RNA estratto. RNA purificato viene quindi trattato con DNasi I per rimuovere tracce di molecole di DNA che potrebbero agire come modelli per la trascrittasi inversa. Primer fluorescenti specifici sono aggiunti al RNA, ibridato alla regione di interesse e successivamente trascrizione inversa, con conseguente DNA a singolo filamento complementare (cDNA). Una scaletta sequenziamento è stato creato da sequenziamento Sanger tradizionale impiegando primer fluorescenti e separati su un gel di poliacrilammide denaturante a fianco del primer frammenti di estensione di cDNA. La risultantegel viene analizzato confrontando le bande fluorescenti, che permette l'identificazione delle estremità 5 'di interesse. Punti di partenza di trascrizione e siti di lavorazione sono poi valutato individualmente in sequenza comparazioni.

1. High Yield RNA Preparazione

1. RNA Isolation
   NOTA: Elevate concentrazioni di RNA totale sono necessari per la reazione di primer extension. Kit colonna Spin di solito non danno la quantità di RNA necessario (~ 5 - 16 mg in 5 ml di volume). Pertanto si raccomanda di purificazione con il metodo di estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio guanidina acido, riportate qui di seguito.
   NOTA: Il fenolo è cancerogeno, tossico e corrosivo. Si prega di leggere le schede di sicurezza e utilizzare sotto una cappa di aspirazione con protezione adeguata!
   1. Crescere o trattare le cellule batteriche (S. aureus o di E. coli in questo esempio), se lo desideri e la raccolta di 10 min centrifugazione a 4.600 × g e 4 ° C. Nota: In genere abbiamo raccolto un totale _{di 600} OD di 20 - 70. I pellet cellulari possono essere conservati per diverse settimane a -20 ° C.
   2. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di soluzione di acido guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio e versare in un2 ml a vite tazza contenente 0,5 ml di 0,1 mm perle di vetro di zirconio / silice.
   3. Lyse le cellule tre volte in un battitore di preparazione veloce / tallone a 6,5 ​​m / sec per 30 sec per tre turni, raffreddamento i campioni in ghiaccio per 5 minuti dopo ogni esecuzione. Nota: campione omogeneizzato può essere conservato a -80 ° C per diverse settimane.
   4. Incubare lisato per 5 min a temperatura ambiente e quindi aggiungere 200 ml di cloroformio.
   5. Agitare vigorosamente o vortice del campione per 30 secondi per estrarre l'RNA.
   6. Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti quindi si centrifuga per 15 minuti a 13.000 - 15.000 × g e 4 ° C. Nota: I solventi sono separati in una fase organica inferiore (rosa, contiene proteine), l'interfase (bianco, contiene DNA) e una fase acquosa superiore (trasparente, contiene RNA).
      NOTA: Da questo punto in uso solo RNase reagenti liberi e plastica ware!
   7. Preparare fresco RNasi-free da 1,5 ml provette, etichette in modo appropriato e aggiungere circa 500 ml di 100% RNasi isopropanolo gratuita ogni (utilizzare circa la stessa volume come fase acquosa nel tubo precedente).
   8. Tenere il tubo ad angolo e trasferire la fase acquosa (circa 500 ml) per provette preparate utilizzando RNasi punte libere. Non disturbare l'interfase.
   9. Precipitare l'RNA capovolgendo più volte e incubando per 10 minuti a RT.
   10. Centrifugare i campioni per 15 minuti a 13.000 - 15.000 × g e 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta o di aspirazione (pompa a getto d'acqua e il biberon). Non disturbare il pellet di RNA bianco trasparente sul fondo.
   11. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70-80% RNasi libero (non vortex) per lavare. Nota: RNA in etanolo può essere conservato per diverse settimane a -20 ° C.
   12. Centrifugare per 5 minuti a 7500 × g e 4 ° C e scartare il surnatante con una pipetta o, preferibilmente, l'aspirazione.
   13. Aria secca pellet di RNA per 15 - 30 min sotto la cappa. Non asciugare eccessivamente, altrimenti pellet potrebbero essere difficili da ridisciogliere.
   14. Risospendere il pellet in 50 ml di RNasi libero DDH ₂ O o buffer di stoccaggio RNA.
   15. Misurare la concentrazione di RNA con uno spettrofotometro microvolumi UV-Vis o una cuvetta di quarzo (e fotometro convenzionali) e procedere alla DNasi I digestione.
2. DNasi I digestione del RNA per rimuovere tracce di DNA
   NOTA: Poiché DNA può agire come modello spuri nella reazione di trascrizione inversa (primer extension), dovrebbe essere rimosso dal campione. Vari metodi per rimuovere il DNA dal RNA sono disponibili soluzioni che di solito si basano su DNasi digestione. Un metodo efficiente semplice ma efficace ed economico per la rimozione del DNA è indicato di seguito.
   1. Bagno d'acqua Preriscaldare a 37 ° C.
   2. Mescolare i composti elencati nella Tabella 1 in una provetta da 1,5 ml di reazione.
   3. Incubare la miscela per 1 ora a 37 ° C in un bagno d'acqua, e poi procedere direttamente alla estrazione con fenolo / cloroformio. Nota: inattivazione di calore della DNasi I non è raccomandato, in quanto questo potrebbe degradare l'RNA.
3. Estrazione con fenolo / cloroformio di RNA dopo DNasi I digestione
   NOTA: L'RNA deve essere purificato per rimuovere nucleotidi liberi, frammenti di DNA e componenti tampone dalla digestione DNasi I. Estrazione con fenolo / cloroformio permette elevato recupero e la concentrazione del campione di RNA ed è quindi indicato di seguito. Altri metodi per la purificazione dell'RNA possono anche essere utilizzati, se soddisfano questi requisiti.
   1. Dividere la DNasi 500 microlitri mi digestione mescolare in due campioni di 250 microlitri in 2 ml provette di reazione.
   2. Aggiungere 1 volume (250 ml) di acido P / C soluzione / I (in acqua satura di fenolo, cloroformio e isopentanol, rapporto di 25: 24: 1, pH 4,5-5).
      NOTA: P soluzione / C / I è cancerogeno, tossico e corrosivo. Si prega di leggere le schede di sicurezza e utilizzare sotto una cappa di aspirazione con protezione adeguata!
   3. Vigorosamente vortice o posto in una piattaforma vortex per 1 - 3 min.
   4. Centrifugare per 30 minuti a 13.000 - 15.000 xg e 4 ° C.
   5. Raccogliere la fase superiore (acquosa) e trasferimento in nuova provetta (250 microlitri).
   6. Aggiungere 1/9 del volume (28 ml) di 3 M di sodio acetato pH 5.2.
   7. Aggiungi 2,5-3 volumi di etanolo puro (700 ml).
   8. Mescolare nel vortex brevemente e posto a -80 ° C per 30 minuti oa -20 ° C per 2 - 3 ore. Se necessario, memorizzare il RNA O / N a -20 ° C.
   9. Centrifuga per il 30 - 60 min a 13.000 - 15.000 × g e 4 ° C.
   10. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
   11. Lavare pellet aggiungendo 1 ml di etanolo al 70% sul pellet. Non fare del campione vortice.
   12. Campione Centrifugare per 5 minuti a 13.000 - 15.000 × g e 4 ° C.
   13. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
   14. Aria pellet asciutto sotto il cofano fumi. Conservare il pellet a -20 ° CO / N se necessario.
   15. Sciogliere il precipitato in 30 ml DEPC trattati H ₂ O con il vortex per 2 minuti e utilizzare questa soluzione per sciogliere il pellet del corrispondente secondo tubo per campione (30 microlitri soluzione per una coppia di estrazione).
   16. Misurare la concentrazione di RNA, e assicurarsi che sia superiore a 1 mg / mL per l'uso in primer extension di mRNA mediamente espressi.
   17. Se necessario, conservare l'RNA a -20 ° C per diverse settimane fino a pochi mesi.

Reazione 2. Primer Extension

1. Design Primer
   NOTA: Quando si progetta primer per un esperimento di primer extension, obbedire linee guida generali della progettazione di primer PCR (vedi manuale che accompagna il sequenziatore automatico gel per ulteriori informazioni e la discussione sezione di questo documento).
   1. In particolare, assicurano che i primer (i) non contengono sequenze di basi, (ii) possedere una G o C all'estremità 3 ', (iii) hanno un GC equilibrata: AT rapporto, (iv) avere una temperatura di ricottura di circa 55-60 ° C e (v) si legano almeno 50 bp, meglio 100 bp a valle della regione di interesse per ricevere immagini chiare.
2. Reazione di primer extension
   NOTA: La reazione di primer extension (sintesi del DNA) richiede elevate quantità di stampo di RNA. Se la quantità di RNA utilizzati sono scelti in basso, il segnale potrebbe essere troppo bassa per rilevare! Si consiglia pertanto di purificazione dell'RNA come descritto sopra.
   NOTA: ATTENZIONE: Utilizzare RNase reagenti liberi e articoli in plastica !!!
   1. Riscaldare il termo-cycler ad una temperatura di 95 ° C ed effettuare tutte le ulteriori fasi di incubazione in un termo-cycler per facilità di uso e riproducibilità.
   2. Mescolare i composti dalla tabella 2 in un tubo di PCR per ciascun campione di RNA.
   3. Denaturare i campioni per 1 min a 95 ° C.
   4. Posizionare le provette su ghiaccio e freddo per 5 minuti per ibridare RNA e primer.
   5. Impostare la macchina PCR a 47 ° C.
   6. Nel frattempo preparare la miscela di trascrizione master inversa come descritto nella Tabella 3.
   7. Aggiungere 4 ml di trascrizione inversa master mix per ogni RNA ibridadel campione.
   8. Incubare le provette per 1 ora a 47 ° C. Nota: La temperatura ottimale per AMV RT è 42 ° C, temperature più elevate ma aiutano a superare le strutture secondarie delle molecole di RNA.
   9. Arrestare la reazione riscaldando i campioni a 95 ° C per 2 min.
      NOTA: La formammide è corrosivo, tossico e può essere dannoso per il feto. Si prega di leggere le schede di sicurezza, maneggiare con cura e indossare una protezione adeguata!
   10. Aggiungere 6 ml di formammide colorante di caricamento (95% (v / v) formammide deionizzata, EDTA 10 mM, 0,05% (w / v) di blu di bromofenolo) e conservare per O / N a due settimane a -20 ° C al buio.

3. Preparazione del Sequencing Ladder

NOTA: La reazione di sequenziamento scala richiede o moderate quantità di plasmidi o elevate quantità di DNA genomico. Quando possibile, l'uso di plasmidi nella reazione di sequenza è raccomandato a causa della facilità di isolamento e alta sigintensità finale. In altri casi, si usa normalmente un metodo adottato da Marmur ^5,14 per preparare il DNA genomico di E. coli e S. cellule aureus senza la necessità di utilizzare fenolo. In linea di principio può essere utilizzato qualsiasi metodo che permetta di ottenere elevate quantità e la purezza del DNA genomico.

1. Isolamento del DNA genomico
   1. Crescere 10 ml di E. coli o S. cellule aureus O / N in LB, BM ⁵ o medio TSB.
   2. Celle di raccolta per centrifugazione per 10 minuti a 4600 xg in una provetta Falcon da 15 ml.
   3. Pellet risospeso in 2 ml di tampone P1 come si trova in alcuni mini kit di preparazione (50 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 10 mM, 100 ug / ml RNasi A).
   4. Cellule Lisare per 45 - 60 min con 20 - 40 microlitri lysostaphin (0,5 mg / ml, conservazione a -20 ° C). Nota: per E. coli il enzimatico pre-trattamento può essere omesso o lisozima utilizzato.
   5. Aggiungere 100 ml di soluzione satura SDS-(nel 45% etanolo) alla sospensione e incubate per 5 minuti a 37 ° C.
   6. Aggiungere 650 ml 5 M NaClO ₄ e le cellule brevemente vortice.
      NOTA: cloroformio è un potenziale cancerogeno. Si prega di leggere le schede di sicurezza e utilizzare sotto una cappa di aspirazione con protezione adeguata !!!
   7. Aggiungere 3 ml di cloroformio / isopentanol (24: 1 ratio) alla miscela e agitare per almeno 60 sec. Nota: Il liquido deve trasformarsi in una emulsione bianca omogenea.
   8. Centrifugare campione per 10 minuti a 4.600 xg e RT per separare le fasi.
   9. Trasferire con cautela la fase chiara superiore (acquosa) in una nuova provetta. Se la soluzione è torbida, ripetere l'estrazione con cloroformio / isopentanol. Misurare il volume della soluzione di DNA e preparare una nuova provetta con 2 volumi di etanolo (100%).
   10. Lentamente decantare o pipetta la soluzione di DNA in etanolo contenente tubo. Nota: DNA dovrebbe precipitare come trasparenti, dense spire sul fondo o quando completamente disidratato come cluster bianco galleggiante.
   11. Recuperare il DNA utilizzando ganci realizzati pipette Pasteur in vetro (Figura 2) e lavare ogni campione due volte mediante immersione in un singolo tubo di 1 ml di etanolo al 70%.
   12. Posizionare i ganci in posizione verticale in un rack e asciugare il pellet per 60 min. Se necessario, memorizzare il DNA essiccati per diversi giorni a temperatura ambiente.
   13. Sciogliere DNA rompendo i DNA coperti ganci di vetro e messa in una provetta 2,0 ml di reazione contenente 100 - 500 ml DDH ₂ O. Regolare il volume ad una concentrazione finale di DNA di 1.000 - 1.500 ng / ml. Per una reazione di sequenziamento, utilizzare 10 - 18 mg di DNA genomico.

Figura 2. istruzioni su come creare una canna da pesca DNA. Tenere la punta di una pipetta Pasteur di vetro nella fiamma di un becco Bunsen. Ciò causa il vetro per avviare la fusione dopo alcuni secondi, creando un piccolo gancio a tha fine. Rimuovere rapidamente dal fuoco e lasciate raffreddare per 1 min.

2. Plasmide Isolamento
   1. Preparare plasmidi utilizzando kit mini preparazione standard e sciogliere in tampone di eluizione (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). A seconda delle dimensioni plasmide, utilizzare 100 - 500 ng di plasmide per una scaletta sequenziamento.
3. Reazione di sequenziamento Sanger
   NOTA: disponi un semplice protocollo che utilizza un kit di sequenziamento di primer fluorescente con 7-deaza-dGTP che funziona bene ai fini delle estensioni di primer. Fare riferimento al manuale del kit di sequenziamento per informazioni dettagliate. Si noti che la reazione di sequenziamento deve utilizzare lo stesso innesco come la reazione di primer extension per creare prodotti della stessa lunghezza.
   1. Mescolare 12 ml di DNA genomico (~ 10 - 15 mg) con 1 ml di DMSO e 1 ml di primer fluorescente (2 pmol / ml).
   2. Per ogni 1 ml di quattro miscele di reazione di sequenziamento (A, C, G o T), aggiungere 3 ml di DNA / DMSO / miscela di primer.
   3. Mettere i campioni in una macchina PCR, ed eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 2 min; 35 cicli di 95 ° C per 20 sec, 54 ° C per 20 sec, 70 ° C per 30 sec; mantenere a 4 ° C per sempre.
   4. Dopo la corsa, togliere i campioni dalla macchina, aggiungere 6 ml di colorante di caricamento e conservare in ghiaccio (a breve termine) oppure a -20 ° C per diversi giorni o settimane.

4. Gel Setup e Apparato Run

NOTA: Informazioni dettagliate su come l'apparato gel di sequenziamento è assemblato, il gel viene preparato e come il gel viene eseguito può essere trovato nel protocollo del produttore.

1. Preparativi
   1. Preparare 10x TBE, come indicato nella tabella 4.
   2. Il giorno della corsa gel di preparare 1 L di tampone TBE 1x con ultrapura DDH ₂ O.
   3. Preparare 10% (w / v) APS. Nota: Può essere conservato in 200 microlitri aliquote a -20 ° C per diversi mesi, ma l'attività potrebbe ridursi nel tempo <./ Li>
2. Montaggio di gel camera di colata
   1. Evitare la polvere e altri residui tra le lastre di vetro. Superfici di lavoro Quindi pulire accuratamente utilizzando salviettine umidificate.
   2. Pulire una coppia di piastre in vetro da 25 cm usando salviette di carta usa e getta e acqua distillata su entrambi i lati e poi isopropanolo per il lato interno delle lastre di vetro.
   3. Inserire 0,25 millimetri distanziali sul vetro posteriore e abbassare la lastra di vetro dentata sopra (Figura 3).
   4. Fissare le guide di gel per entrambi i lati delle lastre di vetro con l'estremità del modulo e dei piloti di ingresso ferroviario rivolte verso l'alto e stringere leggermente le manopole.

Figura 3. vista delle lastre di vetro elettroforesi di gel esplosa. Lastre di vetro devono essere utilizzati direzionalmente. Fare attenzione ad affrontare il lato interno delle lastre di vetro verso l'interno e l'esternolato verso l'esterno.

Figura 4. Vista di un apparato gel assemblato. Dopo l'iniezione della soluzione di gel, il distanziatore tasca è posizionata nella soluzione tra le lastre di vetro. La piastra di fusione viene poi scivolò tra la lastra di vetro frontale e le rotaie gel e fissato stringendo le manopole ferroviari.

3. Casting il gel
   NOTA: acrilamide non polimerizzato è neurotossico! Si prega di leggere le schede di sicurezza e utilizzare una protezione adeguata !!!
   1. Aggiungere i composti elencati nella Tabella 5 in un becher e miscelare con una barra agitatrice e un agitatore magnetico.
   2. Immediatamente dopo l'aggiunta di APS e TEMED, raccogliere la soluzione di gel in una siringa da 50 ml e posizionare un filtro da 0,45 nm sulla punta.
   3. O tenere il bordo superiore della lastra di vetro con una mano o collocare il sandwich in una colata di gel basamento per creare un pendio inclinato 10 - 20 °.
   4. Lentamente erogare la soluzione di gel tra le lastre di vetro mentre continuo movimento della siringa da un lato all'altro e fermare una volta che la soluzione di gel incontra l'estremità inferiore.
   5. Spostare di lato o rimuovere eventuali bolle formate utilizzando un gancio bolla.
   6. Inserire il distanziale tasca gel (0,25 mm) tra le lastre di vetro alla estremità dentellata, immergere nella soluzione di gel e fissare collegando la piastra di colata.
   7. Viti ferroviari superiore Fissare leggermente (vedi figura 4 per apparecchi completamente assemblato).
   8. Lasciate set gel per 1 - 2 ore.
   9. Togliere la lastra e tasca colata distanziale e pulire la tasca da residui di sale e gel.
   10. Risciacquare con DDH ₂ O e asciugare la soluzione in eccesso con carte veline.
4. L'esecuzione e la visualizzazione del gel
   NOTA: I gel di sequenziamento sono direttamente sottoposti ad elettroforesi in gel di imager, mentrela fluorescenza viene simultaneamente rilevata da un microscopio laser. In contrasto con elettroforesi su gel convenzionale, in cui il gel viene eseguito prima e poi macchiato e visualizzato, l'unità di rilevazione è fisso e analizza le bande in tempo reale mentre passano il laser. Qui di seguito una procedura software di raccolta dati ImagIR in OS / 2 è delineato, che possono essere adottate per versioni più recenti. Per ulteriori informazioni, consultare il manuale dell'utente.
   1. Far scorrere il supporto serbatoio di accumulo nelle guide di gel sulle lastre di vetro anteriore e serrare le manopole.
   2. Posizionare il gel nel serbatoio di gel inferiore della termocamera gel automatizzato contro la piastra di riscaldamento e fissare facendo scorrere l'entrata pilota ferroviario nelle staffe apparecchi.
   3. Riempire tampone TBE 1x nelle camere di tampone di gel inferiore e superiore, chiudere la camera di buffer inferiore e collegare la camera tampone superiore alla potenza utilizzando il cavo di alimentazione.
   4. Se presente, pulire la tasca gel da saline residui ripetutamente pipettando tampone nella tasca.
   5. Chiudere la camera di serbatoio di accumulo in alto con il coperchio superiore del buffer.
   6. Chiudere lo sportello della macchina e accendere la termocamera e il computer e avviare il software di raccolta dei dati di base ImagIR.
   7. Creare un nuovo file di progetto (File-> Nuovo ...), immettere un nome file di progetto, selezionare gli intervalli di laser (700 o 800 nm) e confermare con OK.
   8. Selezionare Opzioni-> Auto gain ... dal menu immagine in alto, fare clic su Auto per avviare la misurazione automatica di guadagno e di accettare le impostazioni facendo clic su OK.
   9. Mettere a fuoco il laser selezionando Opzioni-> Fuoco ... dal menu di controllo dello scanner, fare clic sul pulsante Auto e accettando le impostazioni facendo clic su OK.
   10. Ripetere la procedura di guadagno automatico per regolare l'area che viene messo a fuoco.
   11. Imposta il controllo dello scanner in base a queste impostazioni: 2.000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, filtro di scansione: 3, Velocità di scansione: 3.
   12. Anticipo del gel vuoto per 20 minuti (selezione tensione ON e premere ).
   13. Nel frattempo, riscaldare la scala sequenziamento ed i prodotti di estensione di primer in una macchina PCR per 2 minuti a 90 ° C, poi raffreddare su ghiaccio.
   14. Arrestare il elettroforesi, aprire il sequencer gel automatico e rimuovere la parte superiore del coperchio del serbatoio di accumulo.
   15. Inserire il dente di squalo-pettine tra le lastre di vetro e leggermente perforare il gel con i denti di squalo (vedi Figura 5).

Figura 5. Vista del primo piano di gel con dente di squalo pettine. Esempio (viola) è applicato tra i denti di squalo.

16. Pipetta o 1 - 2 ml di primer prodotti di estensione o reazioni di sequenziamento scaletta in ciascuna tasca gel (formata dai denti di squalo).
17. Se sono necessari non tutte le tasche, riempire le tasche vuote con loading dye per evitare incomportamento in esecuzione costante.
18. Chiudere il serbatoio tampone e porta del sequencer gel.
19. Inizia elettroforesi e accendere il laser (Select tensione ON e Laser ON e premere ).
20. Arrestare elettroforesi una regione di interesse è passato il laser.

Come illustrato nella figura 6, una reazione di primer extension può essere utilizzato per determinare i punti di partenza trascrizionali di trascritti di interesse e può aiutare a dedurre regioni promotrici (tipicamente identificati da -10 e -35 elementi). Il più alto (più lunga) frammento di cDNA rappresenta il 'estremità del mRNA 5 e quindi può essere facilmente mappato rispetto alla scala sequenziamento.

Figura 6. risultato rappresentativa di una reazione di primer extension. Sul lato sinistro un pieno in vivo innesco estensione gel da E. coli con i vari plasmidi è mostrato. Le singole aree di interesse sono allargata. Nella parte superiore (A), la determinazione del punto di inizio trascrizionale ompA è raffigurato. La trascrizione inversa ferma all'estremità 5 'del mRNA e crea una banda di lunghezza completa di RNA (ind cosìdicato da una freccia). Allineando la banda cDNA con la scala sequenziamento, all'estremità 5 'del mRNA può essere determinato come illustrato nella sequenza di accompagnamento. Nella parte inferiore (B), viene visualizzata la scissione della trascrizione ompA dal RNase YoeB-seq2. Lanes 1 - 3 rappresentano i campioni in cui la tossina YoeB-seq2 mancano o sono inattive, mentre corsie 4-5 rappresentano campioni con RNasi attiva, in coincidenza con l'assenza e la presenza di prodotti di cDNA. Due prodotti di taglio principali vengono creati come indicato dalle frecce. Il ddNTP utilizzato in ogni corsia e la corrispondente base di RNA della scala sequenziamento è etichettato. Trascrizione parti sono indicate con caratteri blu, elementi promotori e inizio agosto codone da carattere magenta. Per ulteriori informazioni; vedere l'articolo di ricerca originale dalla Nolle et al., Microbiologia 159, 1575-1585 (2013). Per favore clicca qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.

Nell'esempio illustrato nella Figura 6, il TSP del ompA mRNA è stata determinata essere una base G (contrassegnato con una freccia nella sequenza sotto del gel). Questo è coerente con la ompA TSP pubblicato prima del ^15. Gli elementi -35 e -10 del promotore possono essere dedotte essere TTGTAA e TAGACT ¹⁶ i motivi differiscono solo due basi ciascuno dalle rispettive sequenze consenso (TTGACA e TATAAT rispettivamente).

A differenza di altri metodi come 5 'RACE, reazioni di estensione dei primer possono essere usati per determinare con precisione e quantificare la scissione delle molecole di RNA. La scissione di molecole di RNA crea gratuitamente estremità 5 ', che possono essere contemporaneamente rilevati come bande cDNA nel gel. Identificare diversi prodotti di dissociazione di un mRNA è più difficile in 5 'RACE esperimenti, da diversi prodotti di PCR devono essere messe in sequenza per ottenere prodotti di dissociazioneche rappresentano solo una piccola frazione del totale (non trasformato) RNA di massa.

Nella parte inferiore della figura 6, la mappatura RNA della scissione da una RNasi è raffigurato. Come precedentemente descritto ^5, la RNasi YoeB-seq2, parte di un TA-sistema da S. equorum ^17, scinde mRNA vicino al codone di inizio. Questa scissione può essere inibita da l'affine anti-tossina YefM-seq2. Quando la RNasi YoeB non è presente o non attivo (corsie 1 - 3), nessun prodotto di estensione dei primer si formano in prossimità del codone di inizio. Ogni volta che l'attività RNasi è presente (corsie 4 e 5), due bande forti poco a valle del codone di avvio appaiono. Usando questo approccio, i modelli scissione possono essere facilmente identificati.

La Figura 7 mostra un esperimento primer extension fallito. A causa di eccesso di RNA nella reazione di trascrizione inversa, la quantità di cDNA generato crea un forte segnale tale, quella banda cDNA individuales non possono essere distinte. Questo rende impossibile la determinazione fine RNA 5 '.

Quando si utilizza RNA altamente espressi nella reazione di primer extension, come un RNA ribosomiale (come illustrato nella Figura 7), il rischio di aree sovraesposte aumenta. Pertanto, la quantità di RNA totale modello deve essere regolato per l'abbondanza di RNA di interesse. Al contrario, quando trascrizioni di interesse costituiscono solo una piccola quantità di RNA totale, l'importo nella reazione di trascrizione inversa deve essere aumentata, altrimenti i segnali saranno troppo debole (non mostrato). Ciò vale anche per la reazione di sequenziamento Sanger, come modelli multicopia per cella (come i geni rRNA o geni codificati su plasmidi) provocare segnali molto più forti.

Figura 7. Rappresentante risultato di un primer extension fallito da ng> S. aureus. 16S RNA è molto abbondante in cellule batteriche. Questo porta a forti segnali di trascrizione inversa quando si utilizzano moderate quantità di RNA totale. Nel caso illustrato qui, le forti bande cDNA mascherano l'esatto 5 'e quindi impediscono 5' mappatura. Inoltre, RNA ribosomiale sono altamente strutturati e quindi può terminare prematuramente la trascrizione inversa, la produzione di prodotti di cDNA brevi che non rappresentano frammenti di lunghezza completa. In questo caso l'aumento della temperatura trascrizione inversa, insieme ad una trascrittasi inversa resistente al calore può rendere più facile per sintetizzare strutture secondarie passati. A causa di molteplici copie della sequenza di DNA genomico, la scala sequenziamento Sanger è più forte per i geni a singola copia. Per migliorare l'immagine del gel, RNA e DNA importi per la trascrizione inversa e reazione Sanger dovrebbero essere ridotti e / o meno del prodotto applicato al gel._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: DNasi I digestione del RNA.

Volume di reazione e la quantità di DNasi I può essere scalata verso l'alto o verso il basso a seconda della quantità of RNA utilizzato.

Tabella 2: RNA-Primer ibridazione.

Impostare una reazione per campione di RNA e primer.

Tabella 3: estensione Primer master mix.

Scale fino al numero di reazioni necessarie.

Tabella 4: 10x TBE ricetta.

Filtro per rimuovere polvere e lanugine e conservare a 4 °C.

Tabella 5: Sequenza gel ricetta.

Soluzione di gel Processo rapidamente dopo l'aggiunta di TEMED e APS.

Primer extension fluorescente è un metodo semplice e rapido per determinare l'estremità 5 'di RNA, sia per TSP- o l'identificazione di trasformazione secondaria dell'RNA. Grazie all'uso di primer fluorescenti, le reazioni possono essere impostati e gestiti senza misure di sicurezza supplementari (a differenza in caso di primer marcati radioattivamente). Poiché i campioni vengono rilevati mediante fluorescenza, possono essere esposte mentre l'elettroforesi è in corso che consente l'analisi rapida rispetto ai metodi radioattivi dove pellicole radiografiche sono comunemente utilizzati.

In generale, la qualità della reazione di primer extension è fortemente dipendente dal grado e capacità di legame del primer. Se il sito di legame è scelto troppo vicino alla zona di interesse, strisci di primer possono mascherare il segnale, mentre un sito di legame troppo lontano (> 300 bp) dal 'estremità 5 possono provocare un segnale debole.

Il colorante fluorescente deve essere covalentemente legata alla5 'estremità del oligonucleotide DNA personalizzato durante la sintesi e l'oligonucleotide deve essere purificato mediante HPLC per evitare interferenze con la reazione di trascrizione inversa dai sali residui. Gli oligonucleotidi con un'adeguata modifica colorante (vedi tabella lista reagenti per ulteriori informazioni su coloranti compatibili) possono essere ordinati presso la maggior parte delle aziende di sintesi di oligonucleotidi e devono essere conservate al buio. Purtroppo, siamo a conoscenza di tutte le tecniche enzimatiche per fissare il colorante di oligonucleotidi preesistenti, come è possibile con nucleotidi radiomarcati.

Nel sistema sequenziamento descritto qui, due coloranti fluorescenti differenti possono essere utilizzati per rilevare simultaneamente due campioni, come loro eccitazione (circa 700 e 800 nm) e spettri di emissione sono distinti. A parte i coloranti a quelle originali, altri coloranti come indicato nell'elenco reagenti possono essere utilizzati per produrre risultati eccellenti.

Un altro fattore importante per prLe reazioni di estensione imer è la qualità e la quantità di RNA. Si deve prestare attenzione per rimuovere i contaminanti di DNA, in quanto le transcriptasi inversa come il AMV RT può utilizzare il DNA come modello ^18.

Come mostrato in figura 7, la potenza del segnale rilevato di bande nella fase gel è dipendente dalla quantità di RNA utilizzato nella reazione di trascrizione inversa. E 'quindi essenziale per regolare la quantità di RNA totale, a seconda della quantità proporzionale del RNA di interesse presente nel campione. La bassa sensibilità di questo metodo è anche uno dei suoi svantaggi, come basse RNA espressi possono essere difficili da rilevare. Se nessun segnale possono essere rilevati affatto, la quantità di RNA totale può essere aumentata o l'RNA di interesse può essere artificialmente iperespresso da un plasmide.

Sensibilità di rilevamento del gel per la fluorescenza a base primer extension è di circa dieci fattore inferiore ^{a 32} P e ³³ P radioisotopo base primer extension ¹⁹. Tuttavia, questo svantaggio può essere compensato regolando la quantità di cDNA caricata su gel o aumentando la quantità di templato di RNA utilizzato nella reazione di trascrizione inversa. Nella maggior parte dei casi, la sensibilità è sufficientemente elevata per ottenere risultati soddisfacenti ^4,5. Sensibilità simili alle estensioni di primer radioattivi sono stati riportati utilizzando primer fluorescenti in combinazione con un sequenziatore capillare ^3, con il vantaggio di tempi di esposizione brevi.

Costi confronti tra fluorescenza e la radioattività basati estensioni di primer sono difficili, in quanto dipendono da diversi fattori quali le macchine disponibili, primer, reazioni scaletta, la disponibilità e la manutenzione di un laboratorio per il lavoro con le sostanze radioattive, smaltimento di rifiuti radioattivi, di formazione e di rischi per la salute dei singoli . Primer fluorescenti sono circa cinque a dieci volte più costoso di primer non standard marcati (20 bp). Tuttavia questi primer possono essere utilizzati per almenoun anno (diversi anni più probabile) rispetto al ³² P primer marcati, che hanno una emivita molto più breve. Ri-etichettatura dei primer è lungo e costoso, a causa della necessità di creare nuovo materiale radioattivo in intervalli frequenti. Se la stessa serie di primer viene utilizzato per un periodo di tempo lungo, primer fluorescenti sono più economici di regolare, primer marcati radioattivamente. Il punto principale costo sarà comunque sequencer fluorescenti o imager e l'acquisto di questa apparecchiatura solo scopo di estensioni di primer potrebbe non essere conveniente. Il metodo qui descritto è piuttosto interessante per i gruppi che sono in possesso di o che hanno accesso a una macchina del genere.

Se un sequenziatore automatico gel non è disponibile, altri metodi per il rilevamento della fluorescenza possono essere usati pure. In questo caso, il gel può essere eseguito in un apparato per elettroforesi standard anidro, se necessario e poi trasferito in un imager fluorescente (modelli disponibili che sono simili ad un flscanner atbed). Sebbene il vantaggio di visualizzare gel durante la corsa è perso, l'uso di isotopi radioattivi può essere evitato in questo modo, un vantaggio importante per lo sperimentatore. Inoltre, se disponibile, un sequenziatore capillare può essere utilizzata per la separazione e il rilevamento in tempo reale, che può aiutare ad aumentare la sensibilità.

Vari metodi sono stati pubblicati su come utilizzare primer extension fluorescente con macchine di sequenziamento gel automatizzato o sequenziatori capillari, tuttavia questi metodi richiedono spesso un passo cDNA di precipitazione concentrare il campione (e rimuovere le impurità) ^19. Nel metodo qui presentato, la precipitazione del DNA non è necessario riducendo così il tempo di preparazione. Più importante, tuttavia, omettendo questo passaggio consente di determinare semi quantitativamente la quantità di molecole di RNA nel campione come le incoerenze della procedura di precipitazione possono essere eliminati.

Va notato che, sebbeneestremità 5 'di molecole di RNA possono essere mappati nelle reazioni primer extension, elaborati e finisce primari (punti di partenza trascrizionali) non possono essere facilmente distinguibili. Per aggirare queste restrizioni, una pianificazione meticolosa degli esperimenti con controlli adeguati è essenziale. Sequenze promotrici evidenti possono indicare la presenza di un punto di partenza trascrizionale e mutanti o eliminazione di elementi promotori dovrebbero quindi abolire bande cDNA. D'altra parte, se tali sequenze sono mancanti o specifiche sequenze consenso sono presenti, le bande possono essere causati dalla trasformazione dell'RNA. Se l'enzima di trasformazione è noto e può essere purificato in vitro estensioni di primer possono portare chiarezza, come la trascrizione e la lavorazione possono essere separati. Inoltre, altri metodi come ad esempio 5 RACE '(tra cui l'arricchimento enzimatica di molecole di RNA non trasformati) in grado di integrare le estensioni di primer per distinguere i siti di inizio della trascrizione di RNA processing.

The metodo di estensione primer viene spesso paragonato ad altri metodi come 5 'RACE e S1 test di protezione nucleasi e pertanto la sua utilità viene messa in discussione. Tecniche RNAseq in combinazione con il sequenziamento di nuova generazione, ad esempio può aiutare a determinare TSP e siti di trasformazione di molti degli RNA in parallelo, tuttavia l'onere finanziario e il lavoro bioinformatical richiesti, piuttosto antieconomico per i singoli RNA di interesse. 5'-RACE invece è più conveniente ed i risultati sono più facili da analizzare, ma se RNA vengono elaborati in diversi modi o diversi punti di partenza trascrizionali sono presenti, il prodotto deve essere clonato e una grande quantità di candidati devono essere sequenziato per ottenere un quadro rappresentativo degli RNA di interesse.

Pertanto, nonostante i nuovi metodi che è sorto nel corso degli anni, ancora oggi Primer estensioni hanno la loro ragion d'essere a causa della facilità d'uso, basso costo e tempi di consegna brevi, il che è particolarmente veroper il metodo di fluorescenza a base presentato qui.

The authors have nothing to disclose that would present a conflict of interest.

We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the “priority programmes” SPP1316 and SPP1617.