Method Article
We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.
基于荧光的引物延伸(FPE)是一个分子的方法来确定转录起始点或RNA分子的加工位点。这是通过使用特定的荧光标记的引物,将所得cDNA片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳随后分析感兴趣的RNA的反转录来实现的。同时,传统的Sanger测序反应是在凝胶上,以该cDNA片段的末端映射到它们的确切相应的碱。而相比之下,5'-RACE(cDNA末端的快速扩增),其中,所述产品必须被克隆和测序的多个候选,堆积由引物延伸所产生的cDNA片段可以同时在一个凝胶运行检测。此外,整个过程(从反转录到的结果的最终分析)可以在一个工作日内完成。通过使用荧光标记的引物,使用危险的放射性同位素标记的试剂可避免与处理时间缩短为可以在电泳过程中,被检测的产品。
在下面的协议中,我们描述了一种在体内的荧光引物延伸的方法来可靠地和快速地检测RNA的5'末端推断的转录起始点和RNA加工位点( 例如,通过毒素-抗毒素系统组件)的S.金黄色葡萄球菌,大肠杆菌大肠杆菌和其它细菌。
引物延伸1是一个分子的方法来确定特定RNA分子的5'末端到一基座分辨率。其它方法,如5'-RACE(cDNA的末端快速扩增)的优点是快速的周转时间,并很容易地分析的RNA分子的长度不同的混合物的能力。
这种方法的工作原理是使RNA分子利用特异性荧光引物反转录反应,生成一定长度的cDNA片段。这些cDNA分子是在变性聚丙烯酰胺凝胶上运行除了传统Sanger测序反应2,并且可以通过它们的荧光由于使用了荧光标记的引物进行检测。的cDNA片段的长度,然后通过比较来测序梯评估,允许5'核糖核酸端的映射。
传统上,引物延伸反应中结合使用用放射性同位素检测到对X射线胶片的cDNA分子。由于对健康的危害,废物处理问题和易于处理,新的协议利用荧光进行引物延伸用自动测序仪的检测中,尽管其灵敏度稍低。使用荧光标记的引物,由重复的无线标签的过程可以省略,如荧光引物是稳定很长一段时间(超过一年中的手)。
我们在这里描述的方法利用了一种自动凝胶序列,但有轻微的修改,毛细管测序仪还可以用于cDNA的分离和检测3。凝胶分析的并行特性使得它能够检测到少量的RNA切割或加工。另一个优点是该高分辨率这种方法,当终端裂解或者甚至一种碱处理可被检测到。
对于RNA裂解或加工,吨的检测ypically两种不同类型的引物延伸的是有区别的。在一种情况下,酶处理完成后在体外用纯化的RNA和纯化的酶,而在其他情况下,该处理完成的体内 ,将所得的RNA进行纯化。在这两种情况下的RNA,进行引物延伸在体外进行,但视RNA的源上,该方法无论是所谓的体外或体内引物延伸。在我们这里介绍的协议中,我们侧重因为易用性(无纯化的蛋白质需要的话),并有可能在同一时间,以确定转录起始点和处理仅仅对体内引物延伸。然而, 体外引物延伸在原理建立相同的方式,该协议可以作为一个起点。
这里说明的方法可以,只要它们适于高被应用于许多种细菌纯度和高收益的准备核酸。
该研究在我们的实验室着重于毒素抗毒素(TA-)系统4,5,其中,所述引物延伸的方法被广泛使用的字段的调节范围。 TA-系统都存在于原核细胞的基因组,它由一个稳定的和内源性活性的毒性蛋白和大多不稳定的蛋白质或RNA的抗毒素是抵消毒性6,7的小遗传元件。毒素活性有时被抑制复制,细胞壁合成或其他机制通过RNase活性8,9-作用,但是最常见的。典型地,RNA酶的特异性是通过进行不同的测试,其中之一是在引物延伸方法测定的。引物延伸反应是非常适合于该应用程序,如裂解和全长片段的混合物可以同时分析,以确定它们的5'末端。使用体外和体内引物延伸的混合,该具体的毒素RNA酶裂解, 例如,序列特异性,可确定10-13。
图的引物延伸步骤(1)概述。细菌培养物,根据实验需要孵育和治疗。总RNA从细胞中,用DNA酶I处理以除去痕量的DNA,并进行使用靶特异性荧光的DNA引物产生的cDNA逆转录反应萃取。基因组DNA或质粒提取并随后用于荧光桑格测序反应中与cDNA片段的大小进行比较。引物延伸产物在变性尿素聚丙烯酰胺凝胶上同时运行桑格测序产物和用自动激光和显微镜分析。测序基础,线与基因带是洛杉矶ST 5'cDNA末端(蓝色箭头)的基地。在菲克特更多信息, 等 。3 ,请点击这里查看该图的放大版本。
整个引物延伸过程的概述可以在图1中找到。简言之,将细菌细胞进行培养,收获,将细胞沉淀溶解和RNA的提取。纯化的RNA,然后用DNA酶I处理以除去的DNA分子,其可作为用于反转录酶的模板的痕迹。特定的荧光引物被加入到RNA的杂交于感兴趣的区域,并随后反向转录,从而产生单链互补DNA(cDNA)。测序梯子是由传统的Sanger测序创建使用荧光引物和分离,旁边的引物延伸cDNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。由此产生的凝胶是通过比较荧光条带,使所关注的5'端的识别分析。转录的出发点和加工点,然后通过序列比单独评估。
1.高产RNA制备
2.引物延伸反应的
3.制备测序天梯
注:排序阶梯反应需要两种适量的质粒或大量基因组DNA中。只要有可能,在测序反应中使用的质粒是因为很容易的分离和高的签名的推荐最终强度。在其他情况下,我们经常使用的Marmur 5,14采用的方法制备的大肠杆菌基因组DNA 大肠杆菌和S.金黄色葡萄球菌细胞,而无需使用酚。在主要能产生高量的和基因组DNA的纯度的任何方法都可以使用。
图2说明了如何创建一个DNA钓竿。保持巴斯德玻璃吸管的尖端插入本生灯火焰。这会导致玻璃开始几秒钟后融化,创造了小钩在t他结束。从火焰迅速捞出晾凉,持续1分钟。
4.凝胶设置和设备上运行
注:详细信息在测序凝胶装置是如何组装的,该凝胶的制备,以及如何将凝胶中运行所用的制造商协议中找到。
图3分解图的凝胶电泳玻璃板。玻璃板应定向使用。照顾到面对玻璃板的内侧向内和外一面朝外。
图4显示的组装凝胶装置。注入的凝胶溶液后,将袋垫片被放置在玻璃板之间的溶液。铸塑板然后在前面玻璃板和凝胶导轨之间滑动,并通过紧固导轨旋钮固定。
图5.特写视图凝胶鲨鱼齿梳。样品(紫色)是鲨鱼的牙齿之间。
如示于图6中 ,引物延伸反应可以用来确定感兴趣转录物的转录起点,并可以帮助推断启动子区域(典型地由在-10和-35元件识别)。最上面的(最长)的cDNA片段代表了mRNA的5'端,因此可相比的测序梯容易地进行映射。
引物延伸反应的图6。代表性结果 。左边一个完整的活体引物延伸,从E.凝胶显示大肠杆菌各种质粒。感兴趣的各个领域被放大。在顶端部分(A),所述的ompA转录起始点的确定是描绘。逆转录停止在mRNA的5'末端,从而产生全长的RNA的条带(的ind由箭头icated)。通过对准的cDNA条带的测序梯,在mRNA的5'末端可被确定为显示在所附的序列。在所述下部(B)中 ,示出了的ompA转录由的YoeB-SEQ2核糖核酸酶的切割。泳道1 - 3表示样品中的毒素的YoeB-SEQ2缺失或不活动的,而泳道4 - 5表示样品有活性RNA酶,与缺少和的cDNA产物的存在相一致。创建两个主要裂解产物中的箭头所指示的。在每个泳道中并测序梯的相应的RNA基所用的ddNTP的标记。谈话部分由蓝色字体,子元素和AUG起始用红色字体标明密码子。欲了解更多信息;看到中止等人的原创性研究文章。,159微生物学 ,1575年至1585年(2013年)。 请点击这里查看该图的放大版本。
在图6所示的例子中, 的ompA mRNA的TSP被确定为一个G为基础的(标记为凝胶下面的序列中的箭头)。这与15年前出版的的ompA TSP一致。启动子的-35和-10元件可以推导为TTGTAA和TAGACT 16的基序的区别仅在于每两个碱基从它们各自的共有序列(TTGACA和TATAAT分别)。
相对于其他方法,如5'RACE,引物延伸反应可以用来精确地确定和定量RNA分子的切割。 RNA分子的裂解产生游离5'端,可以同时检测作为在凝胶中的cDNA条带。标识若干裂解产物1的mRNA在5'RACE实验比较困难,因为几个PCR产物必须被测序,以获得裂解产物仅代表总(未处理)的RNA本体的一小部分。
在图6的下部,所述裂解的RNA酶的RNA作图描述。如前面所描述的图5中,RNA酶的YoeB-SEQ2,的TA系统从S的部分equorum 17,切割mRNA的靠近起始密码子。该裂解可通过同源抗毒素YefM-SEQ2被抑制。当RNA酶的YoeB不存在或不活动的(泳道1 - 3),无引物延伸产物形成靠近起始密码子。每当RNase活性存在(泳道4&5),两强带起始密码子出现短期内下游。使用这种方法,切割图案可以容易地识别。
图7示出一个失败的引物延伸实验。由于在逆转录反应过量的RNA的cDNA的生成量产生如此强烈的信号,即个体的cDNA带S不能区分。这使得5'RNA一端的决心是不可能的。
当使用高表达的RNA的引物延伸反应,如核糖体RNA(如在图7中示出),过度曝光区域的危险性增大。因此,总的模板RNA的量必须被调整到感兴趣的RNA的丰度。与此相反,当所关心的转录只占少量的总RNA,在逆转录反应的量必须增加,否则信号将太微弱(未示出)。这也适用于Sanger测序反应中,每个细胞的多拷贝模板(如rRNA基因或基因编码在质粒上),导致更强的信号。
图7.引物延伸,从失败的代表性结果 NG> S.金黄色葡萄球菌 。16S RNA是在细菌细胞中高丰度。这会导致强烈的反转录信号时使用适量的总RNA。在这里所示的情况下,强的cDNA条带掩模的精确5'末端,从而防止5'映射。此外,核糖体RNA是高度结构化的,因此,可以终止逆转录过早,产生不表示全长片段短cDNA产物。在这种情况下,与耐热性逆转录增加反转录温度下,一起可以更容易地合成以往的二级结构。由于在基因组DNA序列的多个拷贝,桑格测序梯比单拷贝基因更强。以改善凝胶图像,RNA和DNA量为逆转录和桑格反应应减少和/或更低的产品加到凝胶。_upload / 52134 / 52134fig7large.jpg"TARGET ="_空白">请点击这里查看该图的放大版本。
表1:RNA的DNA酶I消化。
物质 | 量 |
从以上步骤RNA | 70 - 100微克 |
10倍的DNA酶I缓冲液(100毫摩尔Tris,pH为7.5,25mM的MgCl 2的,5mM的氯化钙2) | 50微升 |
DNA酶I,RNA酶(2 U /μL) | 10.0微升(最多10个核糖核酸微克每1μl的DNA酶I)的 |
把音量开到500微升与DDH 2 O的(DEPC处理) |
反应体积的DNA酶和量我可以放大或缩小根据定量O˚FRNA使用。
表2:RNA的引物杂交。
复合 | 量为1反应 |
RNA | 5 - 15微克 |
荧光标记的引物 | 2皮摩尔 |
带量至6微升与DDH 2 O的(DEPC处理) |
设置各RNA样品和引物一个反应。
表3:引物延伸母液。
复合 | 量为1反应 |
DDH 2 O的(DEPC处理) | 1.3微升 |
AMV RT缓冲液(10X) | 1.0微升 |
的dNTP(10毫米,无RNA酶) | 1.0微升 |
核糖核酸酶抑制剂 | 0.2微升 |
AMV逆转录酶(RT)(20 - 25 U /μL) | 0.5微升 |
向上扩展到所需要的反应的数量。
表4:10X TBE配方。
物质 | 量 |
三基地 | 107.8克 |
硼酸 | 55.0克 |
EDTA | 7.4克 |
带量高达1000毫升超纯DDH 2 O的和过滤器清除灰尘和毛絮 |
过滤器清除灰尘和毛絮和储存在4℃C.
表5:测序凝胶配方。
复合 | 量 |
尿素 | 10.5克 |
DDH 2 O的(MilliQ中) | 13.0毫升 |
10X TBE | 2.5毫升 |
XL快速凝胶溶液 | 5.0毫升 |
TEMED(N,N,N',N'- Tetramethylethane -1,2-二胺) | 25微升 |
的APS(过硫酸铵,10%) | 175微升 |
后迅速加入TEMED和APS的过程中凝胶溶液。
荧光引物延伸是用于确定RNA的5'末端的简单和快速的方法,无论是对TSP-或仲RNA加工鉴定。由于利用荧光引物,所述反应可以建立和无需额外的安全预防措施,运行(不像在壳体的放射性标记的引物)。作为样品,通过荧光检测到,它们可以被成像,而在电泳过程中,它允许快速的分析相比,放射性的方法,其中X线片是常用的。
在一般情况下,引物延伸反应的质量在很大程度上取决于等级和引物的结合能力。如果该结合位点被选择太靠近感兴趣区域,引物涂片可能掩盖的信号,而一个结合位点太远(> 300 bp)的从5'末端,可能会导致差的信号。
荧光染料必须被共价连接到定制的DNA寡核苷酸的5'端合成与寡核苷酸中应通过HPLC进行纯化,以防止由残留的盐逆转录反应的干扰。用适当的染料修饰(见试剂名单表上兼容染料的详细信息)的寡核苷酸可以从最寡核苷酸合成的公司订购并应贮存在黑暗中。不幸的是,我们不知道任何酶技术,以高度的染料先前存在的寡核苷酸,是可能用放射性标记的核苷酸。
在这里所描述的测序系统中,两种不同的荧光染料可用于同时检测两个样品,因为它们的激发(约700和800纳米)和发射光谱是不同的。除了原有的制造染料,其它染料,例如在试剂列表中指示可用于产生极好的效果。
对于公关的另一重要因素IMER延伸反应是RNA的质量和数量。应当小心以除去DNA污染物,如逆转录酶,如AMV逆转录可以使用DNA作为模板18。
如图7所示,在凝胶的运行频带的检测到的信号强度依赖于在逆转录反应中使用的RNA的量。因此,必须调整总RNA的量,取决于样品中存在的感兴趣的RNA的比例量。该方法的灵敏度低也是其缺点之一,因为低表达的RNA可以是难以察觉。如果没有信号可以在所有被检测到,总RNA的量可以增加或感兴趣的RNA可从质粒被人为地过度表达。
基于引物延伸的荧光凝胶检测灵敏度大约是基于引物延伸19因子10比32 P或33 P放射性同位素低。但是,该缺点可以通过调整的cDNA的量上样到凝胶或通过增加RNA模板的逆转录反应中使用的量进行补偿。在大多数情况下,灵敏度是令人满意的结果4,5-不够高。在组合使用时,荧光引物,用毛细管测序3,具有短曝光时间的优点敏感性相似,放射性引物延伸的报道。
收费是基于引物延伸的荧光和放射性之间的比较是困难的,因为它们依赖于几个因素,如可用的机器,引物,梯反应,可用性和维护一个实验室用于与放射性物质,处置放射性废物,训练和个人的健康风险的工作。荧光引物是大约五至十倍比非标记的标准引物(20 bp)的更昂贵。然而,这些引物可用于至少一年(更可能几年)相比,32 P标记的引物,其具有更短的半衰期。重新标号的引物是耗时和昂贵的,由于需要在频繁的时间间隔的新的放射性物质。如果一组相同的引物被用于在整个长的时间周期,荧光引物是不是规则的,放射性标记的引物便宜。然而,主要的成本点将会是荧光测序或成像仪和单独购买本设备用于引物延伸的目的可能不符合成本效益。这里介绍的方法是相当有趣的谁是持有还是有机会获得这样的计算机组。
如果一个自动化凝胶序器不可用时,可以使用其它方法进行荧光检测。在这种情况下,该凝胶可以在一个标准电泳装置中运行,如果需要干燥,然后转移至荧光成像仪(型号均有其类似于一个佛罗里达州atbed扫描仪)。虽然可视化在运行过程中的凝胶的优点丧失,使用放射性同位素,可避免这种方式,一个重要的优点为实验者。另外,如果有的话,一个毛细管测序可以用于分离和实时检测,这可以帮助提高灵敏度。
各种方法已经公布关于如何使用荧光引物延伸与自动化凝胶测序仪或毛细管测序仪,然而这些方法通常需要的cDNA沉淀步骤以浓缩样品(和去除杂质)19。在这里提出的方法中,DNA的沉淀是没有必要的因此降低了制备时间。然而,更重要,省略此步骤使得可以半定量地测定RNA分子的量与样品中的沉淀过程中的不一致之处可以被消除。
应当指出的是,尽管RNA分子的5'末端可被映射在引物延伸反应,处理和初级端(转录起始点)不能很容易地分辨。为了规避这些限制,适当控制实验的精心策划是必不可少的。明显的启动子序列可以表示一个转录起始点的存在下,然后突变或缺失的启动子元件应取消的cDNA条带。在另一方面,如果这样的序列缺失或特定的共有序列都存在,该带可通过RNA的加工造成的。如果处理的酶是已知的并且可被纯化, 在体外引物延伸可以使澄清,如转录和处理可被分离。此外,其他方法,如5'RACE(包括未加工的RNA分子的酶富集)可以互补的引物延伸来区分的RNA加工的转录起始位点。
日Ë引物延伸方法是经常与其它方法相比,如5'RACE和S1核酸酶保护测定,因此其有用有时质疑。与新一代测序例如组合RNAseq技术可以帮助确定的TSP和许多并行的RNA的加工点,但所需的财政负担,生物信息学的工作,使其不经济的,而单RNA的兴趣。另一方面5'-RACE的是更便宜的,其结果是更容易分析,但如果RNA的多种方法或几个转录起点被处理都存在,该产品必须被克隆,并需要大量的候选的待测序以得到感兴趣的RNA的一个代表性视图。
因此,在出现多年来尽管新方法具有,即使在今天,引物延伸有其存在的理由,由于易于使用,低成本和短的周转时间,这是特别真实对于这里提出的基于荧光的方法。
The authors have nothing to disclose that would present a conflict of interest.
We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the “priority programmes” SPP1316 and SPP1617.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
DNase I (RNase free) | Ambion (life technologies) | AM2222 | |
FastPrep-24 Instrument | MPBio | 116004500 | |
Fluorescently labeled primers | Biomers | n/a | 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna. |
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software | Li-Cor | Product discontinued | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
Nuclease free water | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
Plasmid mini preparation kit | QIAGEN | 12125 | |
RapidGel-XL-40% Concentrate | USB | US75863 | |
RNA STORAGE BUFFER | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720) |
SUPERase•In RNase Inhibitor | Ambion (life technologies) | AM2696 | |
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
TRIzol reagent | life technologies | 15596-026 | |
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
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