Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 1 de 3.

A família

Parte 1: Configurando a infecção

1. Cultivar células HeLa em frascos e espere até que as células são aproximadamente 80% confluentes.
2. Prepare o suficiente meio de crescimento viral para o experimento: DMEM regular com 2% FBS e sem antibióticos acrescentou.
3. A infecção pode ser realizada com o estoque bruto de um vírus vaccinia com um título conhecido, ou sacarose purificada vírus com um título conhecido, se você estiver preocupado com a expressão do gene host.
4. Se você estiver usando vírus sacarose purificada, prossiga diretamente para a parte 2.
5. Se você estiver usando uma ação do vírus vaccinia bruto, pouco antes da infecção, sonicate uma alíquota do vírus em um sonicador copo com um banho de gelo e principalmente um pouco de água.
   • Sonicado em torno de 30W por 20 segundos.
   • Vortex do tubo e repetir a sonicação 3 vezes, acrescentando mais gelo se necessário para manter o copo cheio de gelo e refrigerada.
   • Vortex entre cada passo sonicação.
   • Proceda a parte 2.
6. Alternativamente, se você não possuir um sonicador copo, misture um volume igual de o estoque de vírus bruto e tripsina 0.25mg/mL.
   • Vortex vigorosamente.
   • Incubar o vírus mix de ações / tripsina a 37 ° C banho-maria por 30 minutos.
   • Vortex em intervalos de 5-10 minutos.
   • Proceda a parte 2.

Parte 2: células Infectando

1. Calcular a quantidade de partículas virais necessários para infectar a monocamada na multiplicidade desejado de infecção (MOI). Normalmente, uma alta MOI (entre 5 e 10) é usado para timecourses infecção.
2. Adicione a quantidade desejada de vírus sacarose purificada ou vírus bruto tripsinizados a 37 ° C viral meios de crescimento e misture bem. Você deve usar a mídia apenas o suficiente para cobrir o fundo do balão. Por exemplo, 10 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175.
3. Remova a mídia a partir de células e enxágüe com temperatura ambiente PBS.
4. Adicione o vírus / media o crescimento viral em cada balão.
   • Agite, placas de inclinação e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO2 de 5% por 1 hora.
   • Placas de inclinação e agite a cada 15 minutos para espalhar vírus de maneira uniforme e manter as células úmido.
   • Para um ponto no tempo 0hr/Mock, adicione o meio de crescimento viral só, sem vírus acrescentou.
5. Após a incubação de 1 hora, retire a mídia que contém o vírus, e lavar três vezes com PBS em temperatura ambiente.
6. Adicionar a quantidade máxima de meio de crescimento viral em cada balão. Por exemplo, 30 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175. Começar a contar isso como o ponto de tempo 0 hr.

Parte 3: células colheita

1. Verifique as células sob um microscópio e observe qualquer efeito citopático (CPE).
2. Remova a mídia e lavar as células com 30 mL de PBS à temperatura ambiente.
3. Adicionar 15 mL de tripsina para as células e incubar por 2-5min a 37 ° C.
4. De seleção em microscópio para desprendimento de células e toque em frasco suavemente para deslocar as células.
5. Transferência de células com uma pipeta estéril sorológica em um tubo cônico de 50 mL.
6. Lavar o balão com um volume igual de meio de crescimento celular, e adicione a mídia para as células tripsinizados no tubo cônico.
7. Centrifugar as células a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
8. Remova a tripsina / media a partir do pellet celular.
9. Ressuspender o pellet celular em qualquer reagente Trizol ou o tampão de lise do seu kit desejado isolamento do RNA.
10. Se você estiver usando TRIzol, dividir a amostra em 1 mL em alíquotas de 1,5 ml tubos Eppendorf rotulado e congelar a -80 ° C.
11. Repita o procedimento para todos os momentos, a colheita um frasco por ponto de tempo.

Parte 4: extração de RNA de amostras em TRIzol

1. Neste ponto, as amostras devem ser ressuspendidos em reagente Trizol e pronto para ser processado.
2. Adicionar 200μL do reagente Separação de Fase BCP para cada 1 mL de TRIzol em cada tubo. Você pode precisar de transferir a amostra para um tubo maior se você estiver começando para fora com uma grande quantidade de TRIzol.
3. Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos.
4. Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos.
5. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior. Você deve estar se recuperando aproximadamente 600μL para cada 1mL de TRIzol você começou com.
6. Fazer uma segunda extração fenol / clorofórmio, desta vez utilizando 500μL de clorofórmio por 1 ml TRIzol, em vez de BCP.
7. Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos.
8. Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos.
9. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior.
10. Adicionar 20μg de acrilamida linear para cada amostra. A acrilamida linear age como uma transportadora e ajuda a precipitar o RNA.
11. Adicionar 500 & micro; L de isopropanol por 1 ml de TRIzol você começou com a cada amostra e misture bem.
12. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos.
13. Centrifugar em microcentrífuga à velocidade máxima, por 10-15 minutos.
14. O pellet de RNA será visível na parte inferior do tubo. Com muito cuidado, remover o sobrenadante do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Não perturbar o pellet.
15. Lave o pellet com 1 mL de etanol 70%.
    • Adicionar 1 mL de etanol 70% para o sedimento.
    • Centrifugar a velocidade máxima 14.000 g por 5-7 minutos.
    • Com muito cuidado, remover o etanol do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Verifique se o pellet é visível na parte inferior do tubo.
    • Desprezar o sobrenadante.
16. Repita o passo de lavagem. Após o sobrenadante é descartado, marcar onde pellet é no tubo.
17. Ar seco pellet por não mais que 5 minutos. Não overdry, ou o RNA será difícil reconstituir!
18. Se você deseja seguir o tratamento DNase opcional para remover qualquer DNA restante da amostra, ressuspender o sedimento em 17μL de água livre de nuclease. Caso contrário, ressuspender o sedimento em 20μL de água livre de nuclease e continuar para o passo 22.
19. (Tratamento DNase Opcional) Usando o Qiagen RNase set DNase, adicione 2μL buffer RDD e 1μL reconstituído RNase DNase I da RNA ressuspendido. Misture delicadamente.
20. (Tratamento DNase Opcional) Incubar a 37 ° C por 30 minutos.
21. (Tratamento DNase Opcional) Adicione 2μL de 2,5 mM EDTA e incubar a 65 ° C por 5 minutos para inativar a DNase. Não exceda o tempo de inativação ou temperatura as vezes mais longos / temperaturas mais elevadas podem causar a degradação do RNA.
22. Verificar a concentração de RNA por espectrofotometria.
23. Conservar a amostra de RNA a -80 ° C.
24. (QC Opcional) Verifique a qualidade do RNA usando um Bioanalyzer Agilent, ou executando a amostra em um gel desnaturante e verificar as leituras OD. (260nm e 260/280 ratio)

Passos crítica

Parte 1 & 2

Existem vários passos críticos para a criação de uma infecção vaccinia síncrona, a sonicação ser o primeiro cuidado (ou trypzinizing) do vírus, a fim de desagregar as partículas do vírus. Vaccinia é altamente propensos a agregar, e ruptura de partículas do vírus é importante para assegurar mesmo a infecção de células. A fim de alcançar uma infecção síncrono, uma alta MOI (superior a 2) deve ser usado para garantir que cada célula é infectada. A mistura de células infectadas e não infectadas levará a várias rodadas de infecção, misturas heterogêneas de pontos de tempo, e assíncronas virais e do hospedeiro respostas transcricional. A infecção deve ser realizado em quantidades mínimas de mídia para permitir máxima de adsorção do vírus sobre as células. Além disso, agitação regular dos frascos ou placas de cultura (a cada 10 minutos) permite a distribuição de vírus em todo o frasco e garante que as células não sequem.

Parte 4

1-Bromo-3-cloropropano (BCP) é usado no lugar de fenol para reduzir a contaminação do DNA genômico. Um posterior tratamento DNAse opcional (Qiagen RNAase Free-DNAse) também pode ser realizada para eliminar qualquer DNA genômico remanescente. A extração de clorofórmio segundo é usado para remover qualquer vestígio de solvente orgânico de extração, já que mesmo pequenas quantidades podem inibir as etapas de amplificação subseqüentes. Traços de fenol BCP / pode ser detectada como um pico em 270nm (para além do pico de padrão a 260nm) na medição de absorção de RNA total após a extração. Se tal contaminação aparece, re-extrair o RNA (utilizando um método de extração de filtro ou coluna baseada em RNA) antes de proceder à amplificação. Quantidade mínima de RNA necessários para executar uma reação de amplificação é 100ng, no entanto, 500 1000ng é o preferido.

Application / Significado

O RNA marcado resultantes deste protocolo pode ser hibridizado com humanos, microarrays viral, ou o costume de avaliar as respostas de expressão gênica de células infectadas em cultura. Plataformas microarray variam, por isso siga as instruções do fabricante para a preparação de mistura de hibridização da sonda marcada.

Usando uma matriz poxvírus personalizados ^1, fomos capazes de classificar os genes nas categorias geral de "precoce" ou "atrasado" com base no tempo do sinal de hibridização e se ou não a replicação do DNA viral foi necessária para a detecção de transcrição. Observamos as categorias funcionais de genes esperados em cada classe temporal (ou seja, espera genes precoce, intermediária e tardia) a variação quanto ao momento exato de transcrição.

Os métodos utilizados neste trabalho são capazes de prever genes transcritos vírus cedo ou mais tarde no ciclo de replicação, mas têm mais dificuldade em distinguir início somente contra genes com um promotor precoce e tardia desde transcrições com um promotor cedo / tarde dupla pode persistir e ser detectada, por vezes, tarde. Além disso, run-through transcrição de genes virais tarde podem afetar sinal em um determinado teste / ponto na matriz, como a hibridação RNA para a matriz pode ter vindo da ORF designado ou uma ORF upstream. Arrays azulejos têm tentado resolver este problema, no entanto os desafios permanecem na detecção de executar através de transcrição usando abordagens baseadas hibridização ^2,3,4.

Padrões anfitrião transcricional também pode ser avaliada através destes métodos. No entanto, vaccinia codifica uma variedade de mecanismos para inibir as respostas de acolhimento, e resposta do hospedeiro transcricional pode ser diminuída em comparação a outros estímulos ^5,6,7,8. Uma vez que a expressão de muitos genes envolvidos na defesa do hospedeiro é alterada após a infecção, a contribuição de genes virais que neutralizam as respostas imune do hospedeiro deve ser levado em consideração.

Utilizando estes métodos, um mapa do tempo de transcrição de todos os genes virais podem ser identificadas e usadas para interrogar funções de genes desconhecidos viral. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para dissecar o diálogo intrincado entre o vírus e hospedeiro. Estes métodos são amplamente aplicáveis ​​a outros sistemas de acolhimento patógeno-infecção. Se o patógeno de interesse não tem polyadenylated mRNAs, métodos alternativos podem ser usados ​​diretamente para rotular o RNA total, sem amplificação linear. Ao analisar o anfitrião e expressão de genes de vírus durante a infecção síncrona, estes métodos permitem-nos para obter insights sobre a interação do vírus com o ambiente celular do hospedeiro, assim como anfitrião contra-defesas contra infecção por vírus.

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