Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.

המשפחה

חלק 1: הגדרת זיהום

1. לגדל תאים הלה ב צלוחיות ולהמתין עד התאים הם כ 80% ומחוברות.
2. הכינו מספיק בינוני צמיחה ויראלי לניסוי: DMEM קבוע עם 2% FBS ללא אנטיביוטיקה הוסיף.
3. הזיהום יכול להתבצע גם עם מלאי גולמי של הנגיף vaccinia עם כייל ידוע, או סוכרוז מטוהרים וירוס עם כייל ידוע אם אתה מודאג לגבי ביטוי גנים המארח.
4. אם אתה משתמש וירוס סוכרוז מטוהרים, להמשיך ישירות חלק 2.
5. אם אתה משתמש מלאי וירוס גולמי vaccinia, זמן קצר לפני הזיהום, sonicate aliquot של הנגיף sonicator כוס עם אמבטיה של קרח בעיקר מעט מים.
   • Sonicate בסביבות 30W למשך 20 שניות.
   • וורטקס הצינור וחזור על sonication 3 פעמים, הוספת קרח יותר אם יש צורך לשמור על כוס מלא קרח צונן.
   • וורטקס בין כל שלב sonication.
   • המשך חלק 2.
6. לחלופין, אם אינכם בעלי sonicator כוס, לערבב נפח שווה של המניה וירוס גולמי טריפסין 0.25mg/mL.
   • וורטקס במרץ.
   • דגירה המניות / טריפסין וירוס לערבב 37 ° C waterbath במשך 30 דקות.
   • וורטקס במרווחים 50-10 דקות.
   • המשך חלק 2.

חלק 2: הדבקת תאים

1. לחשב את הסכום של חלקיקים נגיפיים צריך להדביק את monolayer על ריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים). בדרך כלל, גבוה הפנים (בין 5 ל 10) משמש timecourses זיהום.
2. מוסיפים את כמות הרצויה של וירוס סוכרוז מטוהרים או וירוס גולמי trypsinized על 37 מעלות צלזיוס צמיחה התקשורת ויראלי ומערבבים היטב. אתה צריך להשתמש בתקשורת מספיק כדי לכסות רק את החלק התחתון של הבקבוק. לדוגמה, 10 מ"ל של המדיה עבור בקבוק T-175.
3. הסר מדיה מן התאים ולשטוף עם בטמפרטורת החדר PBS.
4. הוסף את הוירוס / מדיה צמיחה ויראלי בקבוק אחד.
   • מערבולת בעדינות, צלחות הטיה לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 בחממה במשך שעה 1.
   • צלחות הטיה מערבולת כל 15 דקות כדי להפיץ וירוס אחיד לשמור תאים לחים.
   • עבור נקודת זמן 0hr/Mock, מוסיפים את התקשורת צמיחה ויראלי בלבד, עם וירוס לא הוסיף.
5. לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את המדיה המכילים את הנגיף, ולשטוף שלוש פעמים עם בטמפרטורת החדר PBS.
6. הוסף את הסכום המקסימלי של מדיום הגידול ויראלי בקבוק אחד. לדוגמה, 30 מ"ל של המדיה עבור בקבוק T-175. מתחילים לספור את זה כנקודת 0 hr שלך זמן.

חלק 3: תאים קציר

1. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ לב כל השפעה cytopathic (CPE).
2. הסר את המדיה ולשטוף תאים עם 30 מ"ל של בטמפרטורת החדר PBS.
3. הוסף 15 מ"ל של טריפסין אל התאים דגירה עבור 2-5min על 37 ° C.
4. בדוק במיקרוסקופ על ניתוק התא ברז הבקבוק בעדינות כדי לסלק תאים.
5. העברת תאים עם טפטפת סרולוגיות סטרילי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
6. לשטוף את הבקבוק עם נפח שווה של התקשורת צמיחת תאים, ולהוסיף את התקשורת התאים trypsinized בצינור חרוטי.
7. צנטריפוגה התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הסר את טריפסין / מדיה מן התא גלולה.
9. Resuspend התא גלולה ב מגיב או TRIzol או החיץ תמוגה מתיק הרצוי RNA שלך בבידוד.
10. אם אתה משתמש TRIzol, לחלק את הדגימה לתוך 1 מ"ל aliquots שכותרתו צינורות 1.5mL Eppendorf ולהקפיא ב -80 ° C.
11. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן, קצירת one בקבוק לכל נקודת זמן.

חלק 4: מיצוי RNA של דגימות TRIzol

1. בשלב זה, דגימות שלך צריך להיות resuspended ב מגיב TRIzol ומוכן להיות מעובד.
2. הוסף 200μL של מגיב הפרדת פאזות BCP עבור כל 1 מ"ל של TRIzol בצינור אחד. ייתכן שיהיה עליך להעביר את הצינור מדגם גדול יותר אם אתה מתחיל עם כמות גדולה של TRIzol.
3. וורטקס תנער במרץ דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
4. צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות.
5. מעבירים את השלב מימית לצינור טריים. השלב מימית היא שכבת ברור למעלה. אתה צריך להיות מחלים 600μL כ 1mL עבור כל TRIzol שהתחלת לצאת עם.
6. האם החילוץ פנול / כלורופורם שנייה, הפעם באמצעות 500μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל TRIzol, במקום BCP.
7. וורטקס תנער במרץ דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
8. צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות.
9. מעבירים את השלב מימית לצינור טריים. השלב מימית היא שכבת ברור למעלה.
10. הוסף 20μg של acrylamide ליניארית מדגם זה. Acrylamide ליניארי מעשים כנשא ועוזר לזרז את הרנ"א.
11. הוספת 500 & miקרו; L של isopropanol לכל 1 מ"ל של TRIzol שהתחלת לצאת עם לדגום כל ומערבבים היטב.
12. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
13. צנטריפוגה ב microcentrifuge במהירות המרבית במשך 10-15 דקות.
14. גלולה RNA יוצג בחלק התחתון של הצינור. בזהירות רבה, להסיר את supernatant מהצינור, או עם aspirator ואקום, או באופן ידני על ידי pipettor. נא לא להפריע את הכדור.
15. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול 70%.
    • הוסף 1 מ"ל של אתנול 70% על גלולה.
    • צנטריפוגה שיא של 14,000 גרם במשך 5-7 דקות.
    • בזהירות רבה, להסיר את אתנול מן הצינור, או עם aspirator ואקום, או באופן ידני על ידי pipettor. בדוק כי גלולה גלוי בתחתית הצינור.
    • בטל supernatant.
16. חזור על השלב לשטוף. לאחר supernatant נמחקת, לסמן היכן גלולה היא ברכבת התחתית.
17. האוויר יבש גלולה לא יותר מ 5 דקות. אל overdry, או RNA יהיה קשה לשחזר!
18. אם ברצונך לעקוב אחר הטיפול אופציונלי DNase להסיר כל שאר ה-DNA מן המדגם, resuspend גלולה ב 17μL מים nuclease חינם. אחרת, resuspend גלולה ב 20μL מים nuclease ללא והמשך לשלב 22.
19. (אופציונאלי טיפול DNase) באמצעות מערכת RNase ללא Qiagen DNase, להוסיף 2μL הצפת RDD ו 1μL מחדש RNase ללא DNase אני על RNA resuspended. מערבבים בעדינות.
20. (אופציונאלי טיפול DNase) לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
21. (אופציונאלי טיפול DNase) הוסף 2μL של 2.5 mM EDTA ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית DNase. אין לעבור את הזמן איון או טמפרטורה כמו פעמים יותר / טמפרטורות גבוהות יותר עלולות לגרום השפלה של רנ"א.
22. בדוק את ריכוז RNA על ידי ספקטרופוטומטר.
23. חנות מדגם RNA ב -80 ° C.
24. (QC אופציונאלי) בדוק את איכות RNA באמצעות BioAnalyzer Agilent, או על ידי הפעלת המדגם על ג'ל denaturing ובדיקת קריאות OD. (260nm ו - 260/280 יחס)

קריטי שלבים

חלק 1 & 2

ישנם שלבים קריטיים כמה הגדרת זיהום סינכרוני vaccinia, sonication first להיות זהיר (או trypzinizing) של הנגיף, על מנת disaggregate חלקיקי הנגיף. Vaccinia נוטה מאוד צבירה, לבין שיבוש של חלקיקי נגיף חשוב להבטחת אפילו זיהום של תאים. על מנת להשיג זיהום סינכרוני, בגובה הפנים (יותר מ 2) יש להשתמש כדי להבטיח כל תא נגוע. תערובת של תאים נגועים נגוע תוביל סבבים רבים של זיהום, תערובות הטרוגניות של נקודות זמן, אסינכרוני התגובות תעתיק ויראלי המארח. זיהום צריכה להתבצע בכמויות מינימליות של התקשורת על מנת לאפשר מקסימום ספיחה של הנגיף על גבי התאים. בנוסף, רעד קבוע של צלוחיות או מאכלים תרבות (כל 10 דקות) מאפשר הפצה של הנגיף על פני הבקבוק ומבטיח כי התאים אינם מתייבשים.

חלק 4

1-Bromo-3-chloropropane (BCP) משמש במקום של פנול להפחתת זיהום הדנ"א הגנומי. הטיפול שלאחר מכן אופציונלי DNAse (Qiagen RNAase חופשי DNAse) יכול גם להתבצע כדי לחסל כל הדנ"א הגנומי הנותרים. מיצוי כלורופורם השני משמש כדי להסיר כל עקבות של ממיס אורגני מן החילוץ, כמו גם כמויות זעירות יכול לעכב צעדים הגברה הבאים. עקבות של פנול BCP / ניתן לאתר כמו ספייק ב 270nm (מעבר לשיא התקן ב 260nm) במדידת הספיגה של רנ"א מסך לאחר החילוץ. אם זיהום כזה מופיע, לחלץ מחדש את RNA (בשיטת לסנן או עמודה מבוססי RNA החילוץ) לפני שתמשיך הגברה. כמות מינימום של רנ"א הדרושים לביצוע התגובה הגברה הוא 100ng, אולם 500-1000ng היא העדיפה.

בקשה / משמעות

RNA שכותרתה הנובע פרוטוקול זה יכול להיות הכלאה אל, microarrays האדם ויראלי, או מותאם אישית כדי להעריך ביטוי בתגובות הגן תאים נגועים בתרבות. פלטפורמות microarray להשתנות, ולכן פעל בהתאם להוראות היצרן להכנת תערובת הכלאה בין בדיקה שכותרתו.

באמצעות מערך מעוצב אישית poxvirus ^1, הצלחנו לסווג גנים לקטגוריות כללי של "בראשית" או "מאוחר" מבוסס על העיתוי של אות הכלאה והאם שכפול ה-DNA הנגיפי נדרש לגילוי תמליל. ראינו את הקטגוריות פונקציונלי הצפוי של גנים בכל כיתה הזמני (כלומר, צפוי גנים מוקדם, ביניים מאוחר) וריאציה באשר לעיתוי המדויק של שעתוק.

שיטות מנוצל בעבודה זו מסוגלים לחזות גנים וירוס עיבד מוקדם או מאוחר של מחזור השכפול, אך מתקשים יותר להבחין מוקדם בלבד לעומת גנים עם האמרגן מוקדם ומאוחר מאז תמלילי עם מקדם מוקדם / מאוחר כפול עשוי להימשך ולהיות זוהה בשעות המאוחרות. בנוסף, ריצה באמצעות שעתוק של גנים נגיפיים מאוחר עשוי להשפיע על האות ב בדיקה נתון / מקום במערך, כמו רנ"א והכלאה למערך אולי בא מן ORF המיועד או ORF במעלה הזרם. מערכים ריצוף ניסו לפתור בעיה זו, אולם נותרו אתגרים באיתור להפעיל באמצעות שעתוק תוך שימוש בגישות הכלאה מבוסס ^2,3,4.

דפוסי מארח תעתיק ניתן להעריך באמצעות שיטות אלה. עם זאת, vaccinia מקודד מגוון של מנגנונים לעכב תגובות המארח, ותגובות מארח תעתיק ניתן פחתה לעומת גירויים אחרים ^5,6,7,8. מאז הביטוי של גנים רבים המעורבים בהגנת המארחת משתנה לאחר ההדבקה, התרומה של גנים ויראלי לנטרל התגובות מארח החיסון ולכן צריך להילקח בחשבון.

ניצול שיטות אלה, מפה של עיתוי תעתיק של כל הגנים ויראלי ניתן לזהות ולהשתמש בהם כדי לחקור את התפקידים של גנים ויראליים ידועים. בנוסף, שיטות אלה יכול להיות מנוצל כדי לנתח את הדיאלוג המורכב בין הנגיף לבין המארח. שיטות אלה החלים רחב לארח-הפתוגן מערכות אחרות זיהום. אם הפתוגן של עניין אין polyadenylated mRNAs, שיטות חלופיות ניתן להשתמש ישירות התווית RNA מוחלט, ללא הגברה ליניארית. על ידי ניתוח שני המארח הגן ביטוי וירוס במהלך זיהום סינכרוני, שיטות אלה מאפשרות לנו לקבל תובנה וירוס אינטראקציה עם הסביבה מארח הסלולר, כמו גם לארח נגד הגנות מפני הידבקות בווירוסים.

וייטהד במכון עמיתי קרנות