Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.

La familia

Parte 1: Configuración de la infección

1. Se cultivan las células HeLa en frascos y esperar hasta que las células son aproximadamente el 80% confluente.
2. Prepare suficiente medio de cultivo viral para el experimento: regular DMEM con FBS al 2% y no hay antibióticos añadidos.
3. La infección se puede realizar ya sea con una reserva de crudo del virus de la vacuna con un título conocido, o sacarosa purificada de virus con un título sabe si usted está preocupado acerca de la expresión génica de acogida.
4. Si está utilizando virus sacarosa purificada, vaya directamente a la parte 2.
5. Si usted está usando un archivo crudo virus vaccinia, justo antes de la infección, sonicar una alícuota del virus en una taza de baño de ultrasonidos con un baño de hielo y sobre todo un poco de agua.
   • Sonicado en torno a 30W durante 20 segundos.
   • Vórtice del tubo y repetir el tratamiento con ultrasonidos 3 veces, agregando más hielo si es necesario para mantener el vaso lleno de hielo y frío.
   • Vortex en cada paso sonicación.
   • Proceder a la parte 2.
6. Por otra parte, si usted no posee un sonicador taza, mezcle un volumen igual de la acción del virus del crudo y la tripsina 0.25mg/mL.
   • Agitar vigorosamente.
   • Incubar el virus de archivo / tripsina mezcla en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos.
   • Vortex a intervalos de 5-10 minutos.
   • Proceder a la parte 2.

Parte 2: Infección de las células

1. Calcular la cantidad de partículas virales necesarias para infectar a la monocapa en la multiplicidad deseado de infección (MOI). Por lo general, un alto MOI (entre 5 y 10) se utiliza para timecourses infección.
2. Agregar la cantidad deseada de virus sacarosa purificada o el virus de crudo trypsinized a 37 ° C los medios de cultivo viral y mezclar bien. Que deben utilizar los medios suficientes para cubrir sólo el fondo del frasco. Por ejemplo, 10 ml de los medios de comunicación de un frasco T-175.
3. Retire el medio de las células y enjuague con la temperatura ambiente PBS.
4. Añadir el virus / los medios de comunicación viral de crecimiento a cada frasco.
   • Agitar suavemente, placas de inclinación y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% durante 1 hora.
   • Placas de inclinación y agitar cada 15 minutos a la propagación del virus de manera uniforme y mantener las células húmedas.
   • Por un momento el punto 0hr/Mock, añadir el medio de cultivo viral solamente, sin virus añadido.
5. Después de la incubación de 1 hora, retire el material que contiene el virus, y enjuáguese la boca tres veces con PBS temperatura ambiente.
6. Añadir la cantidad máxima de medio de cultivo viral a cada frasco. Por ejemplo, 30 ml de los medios de comunicación de un frasco T-175. Empezar a contar esto como su punto 0 tiempo hr.

Parte 3: las células de cosecha

1. Comprobar que las células bajo un microscopio y observar cualquier efecto citopático (CPE).
2. Eliminar los medios de comunicación y aclarar las células con 30 ml de PBS temperatura ambiente.
3. Agregar 15 ml de tripsina a las células y se incuba durante 2-5min a 37 ° C.
4. Compruebe bajo el microscopio para el desprendimiento de células y pulse frasco suavemente para separar las células.
5. La transferencia de células con una pipeta serológica estéril en un tubo cónico de 50 ml.
6. Lavar el matraz con un volumen igual de medio de cultivo celular, y añadir los medios de comunicación a las células con tripsina en el tubo cónico.
7. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Retire la tripsina / medios de comunicación de la célula de pellets.
9. Resuspender el botón celular en cualquier reactivo TRIzol o el tampón de lisis de su kit de aislamiento de ARN deseado.
10. Si usted está usando TRIzol, dividir la muestra en alícuotas de 1 ml en 1,5 ml etiquetados tubos Eppendorf y se congela a -80 ° C.
11. Repita este procedimiento para todos los tiempos, la cosecha de un frasco por cada punto del tiempo.

Parte 4: extracción de RNA de muestras en TRIzol

1. En este punto, las muestras deben ser resuspendidas en el reactivo Trizol y listo para ser procesado.
2. Añadir 200μL del reactivo de separación de fase BCP por cada 1 ml de TRIzol en cada tubo. Puede que tenga que transferir la muestra a un tubo más grande si usted está comenzando con una gran cantidad de TRIzol.
3. Vortex o agite vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
4. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos.
5. Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo. La fase acuosa es la capa transparente en la parte superior. Usted debe ser la recuperación de aproximadamente 600μL por cada 1 ml de TRIzol que empezó.
6. Hacer una segunda extracción con fenol / cloroformo, esta vez con 500μL de cloroformo por 1 ml de Trizol, en lugar de BCP.
7. Vortex o agite vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
8. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos.
9. Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo. La fase acuosa es la capa transparente en la parte superior.
10. Añadir a 20 microgramos de acrilamida lineal para cada muestra. La acrilamida lineal actúa como soporte y ayuda a precipitar el ARN.
11. Añadir 500 y micro, L de isopropanol por 1 ml de TRIzol que comenzó con a cada muestra y mezclar bien.
12. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos.
13. Centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 10-15 minutos.
14. El ARN precipitado será visible en la parte inferior del tubo. Con mucho cuidado, separar el sobrenadante del tubo, ya sea con una aspiradora, o manualmente por pipeta. No moleste a la bolita.
15. Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 70%.
    • Añadir 1 ml de etanol al 70% de la pastilla.
    • Centrifugar a 14.000 g velocidad máxima durante 5-7 minutos.
    • Con mucho cuidado, separar el etanol del tubo, ya sea con una aspiradora, o manualmente por pipeta. Compruebe que la pastilla es visible en la parte inferior del tubo.
    • Eliminar el sobrenadante.
16. Repita el paso de lavado. Después se desecha el sobrenadante, marcar el lugar donde se pellet en el tubo.
17. Aire seco en pelets por no más de 5 minutos. No seque en demasía, o el ARN será difícil reconstruir!
18. Si desea seguir el tratamiento opcional DNasa para eliminar cualquier resto de ADN de la muestra, resuspender el precipitado en 17μL de agua libre de nucleasa. De lo contrario, resuspender el precipitado en 20μL de agua libre de nucleasa y continúe con el paso 22.
19. (Opcional tratamiento DNasa) Utilizando el Qiagen RNasa libre de DNasa set, añadir 2μL Buffer RDD y 1μL reconstituido RNasa libre de DNasa I para el ARN se resuspendió. Mezclar suavemente.
20. (Opcional tratamiento DNasa) Se incuba a 37 ° C durante 30 minutos.
21. (Opcional tratamiento DNasa) Añadir 2μL de 2,5 mM EDTA y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos para inactivar la DNasa. No exceda el tiempo de inactivación o temperatura ya veces / altas temperaturas pueden causar la degradación del ARN.
22. Comprobar la concentración de ARN por espectrofotometría.
23. Almacenar las muestras de ARN a -80 ° C.
24. (CC Opcional) Compruebe la calidad del ARN mediante un Bioanalyzer Agilent, o mediante la ejecución de la muestra en un gel desnaturalizante y comprobar las lecturas de OD. (260 nm y la relación 260/280)

Los pasos críticos

Part 1 & 2

Hay varios pasos fundamentales para la creación de una infección sincrónica vaccinia, el primer baño de ultrasonidos con cuidado (o trypzinizing) del virus, con el fin de desagregar las partículas de virus. Vaccinia es muy propensa a la agregación, y la alteración de las partículas del virus es importante para asegurar incluso la infección de las células. A fin de lograr una infección sincrónica, un alto MOI (superior a 2) se debe utilizar para asegurar que cada célula está infectada. Una mezcla de las células infectadas y no infectadas dará lugar a múltiples rondas de infección, una mezcla heterogénea de puntos de tiempo, y asincrónicas las respuestas de la transcripción viral y el huésped. La infección debe ser llevado a cabo en una mínima cantidad de medios de comunicación para permitir la máxima absorción del virus en las células. Además, el temblor regular de los frascos o placas de cultivo (cada 10 minutos) permite la distribución de virus en el frasco y se asegura de que las células no se sequen.

Parte 4

1-Bromo-3-cloropropano (BCP) se utiliza en lugar de fenol para reducir la contaminación de ADN genómico. Un tratamiento posterior opcional DNasa (Qiagen ARNasa libre DNasa) también se puede realizar para eliminar cualquier resto de ADN genómico. Una segunda extracción con cloroformo se utiliza para eliminar cualquier resto de solvente orgánico de la extracción, ya que incluso pequeñas cantidades puede inhibir la amplificación de los pasos posteriores. Restos de fenol / BCP puede ser detectado como un pico en 270nm (más allá del pico del patrón a 260 nm) cuando se mide la absorbancia de ARN total después de la extracción. Si esta contaminación parece, volver a extraer el ARN (utilizando un método de extracción de RNA de filtro o de la columna de base) antes de proceder a la amplificación. Mínima cantidad de ARN necesarias para llevar a cabo una reacción de amplificación es 100 ng, sin embargo, 500-1000 ng es el preferido.

Application / Importancia

El ARN marcado como resultado de este protocolo puede ser hibridado con microarrays humanos, viral, o la costumbre de evaluar las respuestas de la expresión génica de las células infectadas en la cultura. Plataformas de microarrays varían, así que siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la mezcla de hibridación de la sonda marcada.

El uso de un conjunto personalizado diseñado ^un virus de la viruela, hemos sido capaces de clasificar los genes en las categorías generales de "principios" o "finales" sobre la base de sincronización de la señal de hibridación y si la replicación del ADN viral se requiere para la detección de la transcripción. Hemos observado las categorías espera funcional de los genes en cada clase temporal (es decir, que se espera genes temprana, intermedia y tardía) variación en cuanto al momento exacto de la transcripción.

Los métodos utilizados en este trabajo son capaces de predecir los genes de virus de la transcripción temprano o tarde en el ciclo de replicación, pero tienen más dificultades para distinguir las primeras sólo frente a los genes con un promotor de principios y finales desde las transcripciones con un doble temprano / tardío promotor puede persistir y detectados en los tiempos finales. Además, la ejecución a través de la transcripción de finales de los genes virales pueden afectar a la señal en un sondeo determinado / lugar en la matriz, como el ARN que hibrida con la matriz puede haber venido de la ORF designado o aguas arriba ORF. Arreglos de baldosas han tratado de resolver este problema, sin embargo, sigue habiendo dificultades en la detección de ejecutar a través de la transcripción mediante enfoques basados ​​en la hibridación ^2,3,4.

Patrones de hosts de la transcripción también se pueden evaluar mediante estos métodos. Sin embargo, la vacuna codifica una variedad de mecanismos para inhibir las respuestas del huésped, y las respuestas de acogida de la transcripción puede ser disminuida en comparación con otros estímulos ^5,6,7,8. Dado que la expresión de muchos genes implicados en la defensa del huésped se altera después de la infección, la contribución de los genes virales que contrarrestan las respuestas inmunitarias del huésped por lo tanto, deben ser tomados en consideración.

La utilización de estos métodos, un mapa de la fecha de la transcripción de los genes virales pueden ser identificadas y utilizadas para interrogar a las funciones de los genes virales desconocidas. Además, estos métodos pueden ser utilizados para analizar el diálogo entre los intrincados virus y el huésped. Estos métodos son ampliamente aplicables a otros sistemas de infección huésped-patógeno. Si el agente patógeno de interés no tiene poliadenilado ARNm, los métodos alternativos se pueden utilizar para etiquetar directamente el ARN total, sin amplificación lineal. Al analizar tanto el anfitrión como la expresión de genes del virus durante la infección sincrónica, estos métodos nos permiten comprender mejor la interacción del virus con el medio ambiente celular del huésped, así como defensas del huésped contra la infección del virus.

Los becarios del Instituto Whitehead Fondos