우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 1.

가족

1 부 : 감염을 설정

1. flasks의 헬라 세포 성장과 세포가 약 80 % 합류 때까지 기다립니다.
2. 2퍼센트 FBS와 정기 DMEM없이 추가 항생제 : 실험에 대한 충분한 바이러스성 성장 매체를 준비합니다.
3. 감염이 중 원유 알려진 titer와 우두 바이러스 재고, 또는 당신이 호스트 유전자 발현이 염려되는 경우에는 알려​​진 titer와 바이러스를 정화 자당과 함께 수행할 수 있습니다.
4. 당신이 자당 정화 바이러스를 사용하는 경우, 2 부 직접 진행합니다.
5. 방금 전에 감염, 원유 우두 바이러스 주식을 사용하는 경우 대부분 얼음 목욕과 약간의 물과 컵 sonicator에 바이러스의 나누어지는을 sonicate.
   • 20 초 동안 30W 주변에 Sonicate.
   • 소용돌이 튜브를 얼음과 추위로 가득한 컵을 유지하기 위해 필요할 경우 더 많은 얼음을 추가 sonication에게 3 번 반복합니다.
   • 각 sonication 단계 사이에 소용돌이.
   • 2 부 진행합니다.
6. 또는, 당신이 컵 sonicator을 가지고하지 않으면 원유 바이러스 주식 및 0.25mg/mL의 트립신의 동일한 음량을 섞는다.
   • 노골적인 소용돌이.
   • 30 분 37 ° C waterbath에 바이러스 재고 / 트립신 믹스를 품어.
   • 5-10분 간격으로 소용돌이.
   • 2 부 진행합니다.

2 부 : 감염 세포

1. 감염의 원하는 다중성 (뫄)에서 monolayer를 감염하는 데 필요한 바이러스 입자의 양을 계산합니다. 일반적으로, (5 사이 10) 뫄 높은가 감염 timecourses에 사용됩니다.
2. 37 자당 정화 바이러스 또는 trypsinized 원유 바이러스의 원하는 금액을 추가 ° C 바이러스성 성장 매체와 잘 섞는다. 당신은 술병의 바닥을 감추기에 충분 할만큼 미디어를 사용해야합니다. 예를 들어, T - 175 플라스크 미디어 10 ML.
3. 세포에서 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS로 씻어.
4. 각 플라스크에 바이러스 / 바이러스 성장 미디어를 추가합니다.
   • 부드럽게 소용돌이, 37에서 틸트 접시 품어 ° 1 시간 동안 5 % CO2 배양기에서 C.
   • 기울기와 소용돌이 접시는 15 분 간격으로 균일하게 바이러스를 확산하고 세포 촉촉한 유지합니다.
   • 0hr/Mock의 시점 들어, 바이러스가 추가되지 않는 상태로, 오직 바이러스성 성장 미디어를 추가합니다.
5. 1 시간 부화 후, 바이러스가 들어있는 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS로 세 번 씻어.
6. 각 플라스크에 바이러스성 성장 매체의 최대 금액을 추가합니다. 예를 들어, T - 175 플라스크에 대한 미디어의 30 ML. 귀하의 공 인사 시점으로 이것을 계산 시작합니다.

파트 3 : 착취 세포

1. 현미경 세포를 확인하고 cytopathic 효과 (CPE)를 적어 둡니다.
2. 미디어를 제거하고 객실 온도 PBS의 30 ML로 세포를 씻어.
3. 세포에 트립신 15 ML을 추가하고 37 2 5 분 대한 품어 ° C.
4. 세포 분리에 대한 현미경으로 확인하고 세포를 이동시키다을 부드럽게 휴대용 술병을 누릅니다.
5. 50 ML 원뿔 관에 멸균 피펫 serological와 세포를 전송합니다.
6. 세포 성장 매체의 동일한 볼륨으로 술병을 세척하고, 원뿔 튜브 trypsinized 세포에 미디어를 추가합니다.
7. 상온에서 5 분 300 x g에서 세포를 원심 분리기.
8. 세포 펠렛에서 트립신 / 미디어를 제거합니다.
9. 원하는 RNA 격리 키트에서 TRIzol 시약 또는 용해 버퍼 중 하나의 세포 펠렛을 Resuspend.
10. 당신이 TRIzol를 사용하는 경우 -80에서 1.5mL 표시 Eppendorf 튜브 및 동결 1 ML aliquots에 샘플을 나누어 ° C.
11. 시점 당 하나의 휴대용 술병을 수확 모든 시간 지점 반복합니다.

4 부 : TRIzol에서 샘플 RNA 추출

1. 이 시점에서 당신의 샘플을 처리할 수 준비 TRIzol 시약에 resuspended하고 있어야합니다.
2. 각각의 튜브에 TRIzol의 모든 1 ML에 대한 BCP 단계 분리 시약의 200μL를 추가합니다. 당신은 TRIzol 많은 양의와 함께 시작하는 경우 큰 튜브에 샘플을 전송해야 할 수도 있습니다.
3. 소용돌이 또는 적극적으로 악수 후 2-3 분 동안 상온에서 알을 품다.
4. 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
5. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 수성 단계 상단에있는 명확한 계층입니다. 당신은 당신이 밖으로 시작 TRIzol의 모든 1mL 약 600μL 회복해야합니다.
6. 대신 BCP의 두 번째 페놀 / 클로로포름 추출, 1 ML TRIzol 당 클로로포름의 500μL를 사용하여이 시간을 마십시오.
7. 소용돌이 또는 적극적으로 악수 후 2-3 분 동안 상온에서 알을 품다.
8. 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
9. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 수성 단계 상단에있는 명확한 계층입니다.
10. 각 샘플에 선형 아크릴 아미드의 20μg을 추가합니다. 선형 아크릴 아미드는 항공사로서 역할을하고 RNA을 촉진하는 데 도움이됩니다.
11. 추가 500 & MICRO, 이소프로판올의 L은 TRIzol 1 ML 당 당신은 각각의 샘플을 함께 시작 잘 섞는다.
12. 10 분 실온에서 샘플을 품어.
13. 10-15분에 대해 최대 속도 microcentrifuge에 원심 분리기.
14. RNA 펠렛은 튜브의 하단에 표시됩니다. 아주 조심스럽게, 진공 흡인기로하거나, 튜브의 표면에 뜨는를 제거하거나, 수동으로 pipettor로. 펠렛을 방해하지 마십시오.
15. 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오.
    • 펠렛에 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
    • 최고 속도 5-7분에 대한 14,000g을 원심 분리기.
    • 아주 조심스럽게, 진공 흡인기로하거나, 튜브에서 에탄올을 제거하거나, 수동으로 pipettor로. 펠렛은 튜브의 하단에 표시되었는지 확인합니다.
    • 뜨는 폐기하십시오.
16. 세척 단계를 반복합니다. 뜨는이 삭제되면 펠렛은 튜브에 어디에, 마크.
17. 오분 이상 더 이상 공기 건조 펠릿. overdry하지 마십시오, 또는 RNA는 reconstitute하기 어려울 것입니다!
18. 이 예제에서 남아있는 DNA를 제거하는 옵션 DNase 처리를 수행하려는 경우 nuclease없는 물을 17μL의 펠렛을 resuspend. 그렇지 않으면, nuclease없는 물을 20μL의 펠렛을 resuspend 22 단계로 진행합니다.
19. (옵션 DNase 처리) Qiagen RNase 무료 DNase 세트를 사용하여 2μL 버퍼 RDD와 1μL가 resuspended RNA에 RNase 무료 DNase I을 재구성 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
20. (옵션 DNase 처리) 37에서 품어 ° C를 30 분.
21. (옵션 DNase 처리) 65 2.5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화의 2μL 추가 ° 5 분 C는 DNase를 inactivate 수 있습니다. 더 이상 시간 / 높은 온도는 RNA의 저하를 일으킬 수 있으므로 불활 성화 시간 또는 온도를 초과하지 마십시오.
22. 분광 광도계에 의해 RNA 농도를 확인합니다.
23. -80 ° C.에서 RNA 샘플을 저장
24. (선택 사항 QC) 애질런트 BioAnalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 확인하거나, denaturing 젤에서 샘플을 실행 OD 판독을 선택하여. (260nm 및 280분의 260 비율)

중요 단계

파트 1 & 2

동기 우두 감염을 설정하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다, 바이러스의 첫번째 목표가되어주의 sonication (또는 trypzinizing), 바이러스 입자를 disaggregate하기 위해서. 우두는 통합으로 높은 경향이 있으며, 바이러스 입자의 장애는 세포도 감염을 보장하는 것이 중요합니다. 동기 감염을 달성하기 위해, (2보다 큰) 뫄 높은 각 세포가 감염되었는지 확인하는 데 사용해야합니다. 감염과 감염되지 않은 세포의 혼합 감염의 여러 회진 시간 지점의 이기종 혼합물, 그리고 비동기 바이러스성 및 호스트 transcriptional 반응으로 이어질 것입니다. 감염은 세포에 바이러스의 최대 흡착을 허용하는 미디어의 최소 금액에 실시해야합니다. 또한, flasks 또는 문화 요리 (10 분 간격)의 정기적인 흔들림은 술병에 걸쳐 바이러스의 배포를 가능하게하고 세포가 건조하지 않도록 보장합니다.

4 부

1 - 브로모 - 3 - chloropropane (BCP)은 게놈 DNA 오염을 줄이기 위해 페놀 대신에 사용됩니다. 이후 옵션 DNAse 치료는 (Qiagen RNAase 자유 DNAse)도 남아있는 게놈 DNA를 제거하기 위해 수행할 수 있습니다. 두 번째 클로로포름 추출은 심지어 추적 금액은 이후 증폭 단계를 억제 할 수 있듯이, 추출에서 유기 용매의 모든 흔적을 제거하는 데 사용됩니다. 추출 후 총 RNA의 흡광도를 측정하면 / 페놀 BCP의 흔적은 270nm에서 스파이크 (260nm에서 표준 피크 이상)로 검색하실 수 있습니다. 이러한 오염가 나타나면, 증폭을 진행하기 전에 RNA를 (필터 또는 열을 기반의 RNA 추출 방법을 사용하여) 다시 압축을 풉니다. RNA의 최소 금액은 증폭 반응이 100ng는 수행하기 위해 필요한 있지만, 500 1000ng 좋습니다.

신청 / 의의

이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하이브 리다이 제이션 혼합물의 준비에 대한 제조 업체의 지침을 따르시기 바랍니다.

사용자 정의 설계 poxvirus 배열 ^하나를 사용하여, 우리는 바이러스성 DNA 복제는 성적표 감지에 필요한되었습니다 여부 "조기"또는 "늦은"하이브리드화 신호의 타이밍에 기반의 일반적인 범주로 유전자를 분류할 수 있었다. 우리는 전사의 정확한 타이밍에 각 시간적 클래스의 유전자의 예상 기능 범주 (즉, 초기 중급과 늦은 유전자를 예상) 변화를 관찰했다.

이 작품의 활용 방법은 지속하고 있습니다 초기 또는 복제주기의 후반 베꼈는데 바이러스 유전자를 예측할 수 있지만, 이중 늦은 / 이른 발기인과 성적 때문에 초기 늦게 모터와 유전자 비교 더 많은 어려움을 조기 전용 구별을 늦은 시간에 발견했습니다. 배열에 hybridizing RNA가 지정된 ORF 또는 업스트림 ORF에서 온 수 있기 때문에 이외에도, 후반 바이러스 유전자의 전사 -을 통해 실행, 배열에 지정된 프로브 / 지점에서 신호에 영향을 미칠 수 있습니다. 기와 배열이 문제를 해결하기 위해 시도해야하지만 도전 하이브 리다이 제이션을 기반으로 접근 ^2,3,4를 사용하여 녹음을 통해 실행 탐지에 남아 있습니다.

호스트 transcriptional 패턴은 이러한 방법을 사용하여 평가하실 수 있습니다. 그러나, 우두는 호스트 반응을 억제하는 메커니즘을 다양한 인코딩하고, 호스트 transcriptional 응답은 다른 자극 ^5,6,7,8에 비해 줄어들 수 있습니다. 호스트 방어에 관련된 많은 유전자의 표현은 감염 후 변경이기 때문에, 호스트 면역 반응을 중화 바이러스 유전자의 기여 따라서 고려하여야한다.

이러한 방법을 활용하여 모든 바이러스 유전자의 transcriptional 타이밍의지도를 식별하고 알려지지 않은 바이러스 유전자의 기능을 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 바이러스와 호스트 간의 복잡한 대화를 해부하다을 이용하실 수 있습니다. 이러한 방법은 다른 호스트 병원체 감염 시스템에 광범위하게 적용됩니다. 관심의 병원체가 mRNAs을 polyadenylated이없는 경우, 다른 방법은 선형 증폭하지 않고, 직접 총 RNA 레이블을 사용할 수 있습니다. 동기 감염 동안 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현을 분석함으로써, 이러한 방법은 우리가 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 환경뿐만 아니라 호스트 카운터 - 방어와 바이러스의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

화이트 헤드 연구소 펠로 자금