牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析：第1部分

协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。

家庭

第1部分：设置感染

1. HeLa细胞生长在烧瓶，等到约80％融合的细胞。
2. 准备足够的实验病毒的生长介质：含2％FBS的DMEM定期和不添加抗生素。
3. 感染可以进行原油库存的牛痘病毒与已知的滴度，或蔗糖纯化与一个已知滴度的病毒，如果你对宿主基因表达有关。
4. 如果您使用的是蔗糖纯化的病毒，请直接进入第2部分。
5. 如果您使用的是一个粗略的牛痘病毒的股票，只是之前的感染，超声一杯sonicator病毒等分的大多是冰的浴缸和一点点水。
   • 在20秒左右30W超声。
   • 涡管和重复的超声3次，加入更多的冰，如果需要保持与冰和冷冻包装的杯子。
   • 涡之间的每个超声一步。
   • 进入第2部分。
6. 另外，如果你不具备一个杯子sonicator，等体积混合的原油病毒库存和0.25mg/mL胰蛋白酶。
   • 涡大力。
   • 股票/胰蛋白酶在37℃水浴孵育病毒混合30分钟。
   • 涡在5-10分钟一班。
   • 进入第2部分。

第2部分：感染细胞

1. 计算病毒感染所需的感染复数（MOI）的单层颗粒的数量。通常情况下，高MOI（5和10之间），是用于感染timecourses。
2. 添加蔗糖纯化的病毒或胰酶消化原油病毒所需的金额，以37 ° C病毒的生长媒体和拌匀。您应该使用足够的介质，以刚好盖住烧瓶的底部。例如，10毫升的T - 175烧瓶媒体。
3. 从细胞中移除的媒体和室温PBS冲洗。
4. 添加到每个烧瓶中的病毒/病毒的生长介质。
   • 涡流轻轻倾斜板和37 ° C为1小时5％CO2培养箱。
   • 每15分钟倾斜和旋流板，传播病毒的统一，保持细胞的湿润。
   • 对于0hr/Mock时间点，只添加病毒的生长介质，添加没有病毒的。
5. 1小时的潜伏期后，取出含有病毒的媒体，并与室温PBS冲洗三次。
6. 添加到每个烧瓶中的病毒的生长介质的最高金额。例如，30毫升的T - 175烧瓶媒体。开始计数为0小时的时间点。

第3部分：收获细胞

1. 细胞在显微镜下检查，并注意任何细胞病变效应（CPE）。
2. 取出介质，并与30毫升室温PBS冲洗细胞。
3. 添加15毫升的胰蛋白酶的细胞和2 - 5分钟，在37 ° C。
4. 在显微镜下检查细胞脱落和挖掘烧瓶中，轻轻地打跑细胞。
5. 血清50 mL锥形管，用无菌吸管转移细胞。
6. 洗细胞生长介质等体积的容量瓶中，并添加媒体在锥形管的胰酶消化细胞。
7. 离心机在室温下5分钟的300 ×克细胞。
8. 取出细胞​​沉淀的胰蛋白酶/媒体。
9. 无论你所需的RNA提取试剂盒TRIzol试剂或细胞裂解液重悬细胞沉淀。
10. 如果你是用TRIzol，分为1毫升分装在1.5ml的标记Eppendorf管中，并冻结的样品在-80 ° C。
11. 重复所有的时间点，每一个时间点瓶收获。

第4部分：在TRIZOL RNA提取样品

1. 在这一点上，您的样品应悬浮于Trizol试剂，并准备进行处理。
2. 新增的Trizol每1毫升每管BCP相分离试剂200μL。您可能需要将样品转移到一个较大的管，如果你开始与大量的Trizol。
3. 涡或用力振摇，并在室温下孵育2-3分钟。
4. 离心12,000 15分钟XG的样本。
5. 水相转移到一个新的管。水相是在顶部的层次清晰。你应该收回大约为每毫升TRIZOL你开始600μL。
6. 做第二个酚/氯仿抽提，而不是口岸这次使用的氯仿每1 ml TRIZOL500μL，。
7. 涡或用力振摇，并在室温下孵育2-3分钟。
8. 离心12,000 15分钟XG的样本。
9. 水相转移到一个新的管。水相是在顶部的层次清晰。
10. 每个样品中添加20μg线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺作为载体，有助于沉淀的RNA。
11. 新增500＆MICRO;异丙醇大号，每1毫升的Trizol，你开始了与每个样品拌匀。
12. 样品在室温下孵育10分钟。
13. 离心机在一个最高速度为10-15分钟，离心。
14. 的RNA沉淀在试管底部可见。非常仔细，从管中移除上清液，使用真空吸引器，或手动移液器。请勿打扰的颗粒。
15. 1毫升70％的乙醇洗涤沉淀。
    • 加入1毫升70％的乙醇沉淀。
    • 以最快的速度离心14000克为5-7分钟。
    • 非常仔细，从管中删除乙醇，使用真空吸引器或手动移液器。检查，沉淀在试管底部可见。
    • 上清液。
16. 重复洗涤步骤。后取上清液丢弃，标记颗粒管。
17. 空气干燥颗粒不超过5分钟。不要overdry，或RNA的重组将难以！
18. 如果你想按照可选的DNA酶处理，以去除任何剩余的DNA样品，无核酸酶水悬浮颗粒在17μL。否则，重悬沉淀，无核酸酶水20μL，继续到步骤22。
19. （可选的DNA酶处理）使用Qiagen公司的无RNA酶的DNA酶设置，添加2μL缓冲区的RDD和1μL重组无RNase的悬浮RNA的DNA酶我。轻轻混匀。
20. （可选的DNA酶处理）37 ° 30分钟。
21. （可选的DNA酶处理）添加2μL2.5毫米EDTA和孵化，在65 ° C至5分钟灭活DNA酶。不要超过灭活时间或温度，更长的时间/温度较高，可能会导致RNA的降解。
22. 检查由分光光度计的RNA浓度。
23. RNA样品存放在-80 ° C
24. （可选的QC）使用安捷伦生物分析仪检查RNA的质量，或通过运行一个变性凝胶上的样品和检查的OD值。 （260nm和260/280的比例）

关键步骤

第1部分和2

有几个关键步骤设置同步的牛痘感染，小心病毒（或trypzinizing）超声，以分解病毒颗粒。牛痘是极易发生聚合，重要的是确保即使感染细胞的病毒颗粒的破坏。为了实现一个同步的感染，高MOI（大于2）应使用，以确保每一个细胞都感染。受感染和未受感染的细胞的混合物，会导致感染，多轮异构混合物的时间点，和异步的病毒与宿主转录反应。感染者应进行极少量的媒体，允许最大病毒吸附到细胞。此外，经常晃动的培养瓶或培养皿中（每10分钟）使整个烧瓶中病毒的分布和保证，没有干出的细胞。

第4部分

1 - 溴-3 - 氯丙烷（BCP），是用来代替苯酚，以减少基因组DNA的污染。随后可选的DNA酶处理（QIAGEN RNA酶免费DNA酶）也可进行，以消除任何剩余的基因组DNA。第二氯仿提取用于去除有机溶剂提取任何痕迹，即使是微量的，可以抑制后续的扩增步骤。苯酚/ BCP的痕迹，可以检测后提取总RNA的吸光度测量时，作为一个为270nm尖峰（超出标准峰值在260nm）。如果出现这种污染，重新进行放大之前提取RNA（使用一个过滤器或基于列的RNA提取方法）。 RNA的最低金额需要进行扩增反应是100ng;然而，500 1000ng是首选。

应用程序/意义

人类，病毒，或自定义芯片杂交标记的RNA可以从本议定书，以评估在文化感染的细胞的基因表达反应。微阵列平台各不相同，因此按照制造商的指示标记的探针杂交混合物的准备。

使用定制设计痘阵列^1，我们可以分为“早”或“迟到”的基础上杂交信号的时间和病毒DNA的复制是否成绩单检测所需的一般分类的基因。我们观察到的预期在每个时间类基因的功能类别（即，预计早期，中期和晚期基因）的转录的确切时间变化。

在这项工作中利用该方法能够预测病毒的基因转录的早期或在复制周期的后期，但有更多的困难与早期和晚期启动子的基因，因为采用了双早/晚启动成绩单区分早期只可能坚持和检测到后期倍。此外，通过后期病毒基因的转录运行可能影响在一个给定的探头/阵列上的即期的信号，作为杂交到阵列的RNA可以从指定的ORF或上游的ORF来。平铺阵列曾试图解决这个问题，但挑战依然存在通过使用杂交^2,3,4为基础的方法检测转录运行在。

主机转录模式，也可以使用这些方法进行评估。然而，牛痘编码多种机制抑制宿主反应，和主机转录反应可能会减少，比^5,6,7,8等刺激。由于在参与宿主的防御许多基因的表达，感染后的改变，对抗宿主的免疫反应的病毒基因的贡献，因此考虑。

利用这些方法，可确定的所有病毒基因的转录时间图谱，并询问未知病毒基因的功能。此外，这些方法可以用来解剖病毒与宿主之间复杂的对话。这些方法被广泛适用于其他的宿主 - 病原体感染系统。如果感兴趣的病原体没有聚腺苷酸化的mRNA的，可供选择的方法可直接用于标签的总RNA，没有线性放大。通过在主机和同步感染病毒的基因表达分析，这些方法使我们能够获得的洞察力与宿主细胞环境，以及对病毒感染的主机反防御到病毒的相互作用。

怀特黑德研究所的研究员基金