Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 1

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.

La famille

Partie 1: Mise en place de l'infection

1. Cultiver des cellules HeLa dans des flacons et attendre que les cellules sont d'environ 80% de confluence.
2. Préparez assez moyennes croissance virale de l'expérience: régulière DMEM avec 2% de FBS et sans antibiotiques ajoutés.
3. L'infection peut être réalisée soit avec un stock brut de virus de la vaccine avec un titre connu, ou saccharose virus purifié avec un titre connu, si vous êtes préoccupé par l'expression du gène hôte.
4. Si vous utilisez le virus du saccharose purifié, passez directement à la partie 2.
5. Si vous utilisez un stock de virus vaccine brut, juste avant l'infection, soniquer une aliquote du virus dans un sonicateur tasse avec un bain de glace et la plupart du temps un peu d'eau.
   • Soniquer à environ 30W pendant 20 secondes.
   • Vortexer le tube et répétez la sonication trois fois, en ajoutant plus de glace si nécessaire pour garder la tasse remplie de glace et de froid.
   • Vortex entre chaque étape de sonication.
   • Passez à la partie 2.
6. Alternativement, si vous ne possédez pas un sonicateur tasse, mélangez un volume égal du stock de virus brut et la trypsine 0.25mg/mL.
   • Vortex vigoureusement.
   • Incuber le stock de virus / trypsine mélanger dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 minutes.
   • Vortex à intervalles de 5-10 minutes.
   • Passez à la partie 2.

Partie 2: infecter les cellules

1. Calculer la quantité de particules virales nécessaires pour infecter la monocouche à la multiplicité désirée d'infection (MOI). Typiquement, un MOI élevé (entre 5 et 10) est utilisé pour timecourses infection.
2. Ajouter la quantité voulue de virus de saccharose purifié ou trypsinisées virus de brut à 37 ° C les milieux de croissance virale et bien mélanger. Vous devez utiliser les médias suffit pas de couvrir le fond de la fiole. Par exemple, 10 ml de médias pour un flacon T-175.
3. Retirez le support à partir des cellules et rincer à température ambiante PBS.
4. Ajouter le virus / media croissance virale dans chaque flacon.
   • Agiter doucement, assiettes d'inclinaison et incuber à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 1 heure.
   • Plaques Tilt et agiter toutes les 15 minutes pour la propagation du virus de façon uniforme et garder les cellules humides.
   • Pour un point de temps 0hr/Mock, ajouter le support de croissance virale uniquement, sans virus ajouté.
5. Après l'incubation de 1 heure, retirer le support contenant le virus, et rincer trois fois avec la température ambiante du PBS.
6. Ajouter le montant maximum du milieu de croissance virale dans chaque flacon. Par exemple, 30 ml de médias pour un flacon T-175. Commencez à compter ce que votre point 0 h de temps.

Partie 3: Récolte des cellules

1. Vérifiez les cellules sous un microscope et de noter tout effet cytopathogène (ECP).
2. Retirez le support et rincer les cellules avec 30 ml de la température ambiante du PBS.
3. Ajouter 15 ml de trypsine dans les cellules et incuber pendant 2-5min à 37 ° C.
4. Vérifiez sous le microscope pour le détachement des cellules et appuyez délicatement flacon pour déloger les cellules.
5. Transfert cellules avec une pipette stérile sérologique dans un tube conique de 50 ml.
6. Laver le ballon avec un volume égal de milieu de croissance cellulaire, et d'ajouter le support pour les cellules traitées à la trypsine dans le tube conique.
7. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Retirez la trypsine / media à partir du culot cellulaire.
9. Reprendre le culot cellulaire soit réactif Trizol ou le tampon de lyse à partir de votre kit d'isolement désiré ARN.
10. Si vous utilisez TRIzol, diviser l'échantillon en aliquotes de 1 mL dans des tubes Eppendorf 1,5 ml étiquetés et congeler à -80 ° C.
11. Répétez l'opération pour tous les points du temps, un flacon de récolte par point de temps.

Partie 4: extraction d'ARN des échantillons dans TRIzol

1. À ce stade, vos échantillons doivent être remis en suspension dans du réactif Trizol et prêtes à être traitées.
2. Ajouter 200 ul de réactif PCA séparation de phase pour chaque 1 mL de Trizol dans chaque tube. Vous pouvez avoir besoin de transférer l'échantillon à un plus grand tube, si vous êtes débutant avec une grande quantité de TRIzol.
3. Vortex ou secouer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant 2-3 minutes.
4. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes.
5. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. La phase aqueuse est la couche claire sur le dessus. Vous devriez être en récupérer environ 600μL pour chaque 1 ml de Trizol vous avez commencé avec.
6. Faites une deuxième extraction phénol / chloroforme, en utilisant cette fois 500μL de chloroforme pour 1 ml TRIzol, au lieu de la BCP.
7. Vortex ou secouer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant 2-3 minutes.
8. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes.
9. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. La phase aqueuse est la couche claire sur le dessus.
10. Ajouter 20 pg d'acrylamide linéaire pour chaque échantillon. L'acrylamide linéaire agit comme un transporteur et contribue à précipiter l'ARN.
11. Ajouter 500 & MiCRO; L d'isopropanol pour 1 ml de Trizol vous avez commencé avec à chaque échantillon et bien mélanger.
12. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes.
13. Centrifuger dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10-15 minutes.
14. Le culot d'ARN sera visible au fond du tube. Très soigneusement, éliminer le surnageant du tube, soit avec un aspirateur, ou manuellement par pipette. Ne pas perturber le culot.
15. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 70%.
    • Ajouter 1 ml d'éthanol à 70% au culot.
    • Centrifuger à vitesse maximale 14 000 g pendant 5-7 minutes.
    • Très soigneusement, éliminer l'éthanol à partir du tube, soit avec un aspirateur, ou manuellement par pipette. Vérifiez que la pastille est visible au fond du tube.
    • Jeter le surnageant.
16. Répéter l'étape de lavage. Après le surnageant est éliminé, marquer l'endroit où culot est sur le tube.
17. Air culot sec pour pas plus de 5 minutes. Ne pas trop sécher, ou l'ARN sera difficile à reconstituer!
18. Si vous souhaitez suivre le traitement optionnel DNase pour éliminer l'ADN restant de l'échantillon, resuspendre le culot dans 17μL d'eau sans nucléase. Sinon, resuspendre le culot dans 20 pi d'eau sans nucléase et continuer à l'étape 22.
19. (Facultatif traitement à la DNase) Utilisation du Qiagen RNase-free DNase jeu, ajoutez 2μL tampon et 1 microlitre RDD reconstitué sans RNase DNase I de l'ARN en suspension. Mélanger délicatement.
20. (Facultatif traitement à la DNase) Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes.
21. (Facultatif traitement à la DNase) Ajouter 2μL de 2,5 mM d'EDTA et incuber à 65 ° C pendant 5 minutes pour inactiver la DNase. Ne pas dépasser le temps d'inactivation ou la température que plus les temps / températures élevées peut entraîner la dégradation de l'ARN.
22. Vérifiez la concentration en ARN par spectrophotomètre.
23. Conserver l'échantillon d'ARN à -80 ° C.
24. (QC Facultatif) Vérifiez la qualité de l'ARN en utilisant une BioAnalyzer Agilent, ou en exécutant l'échantillon sur un gel dénaturant et en vérifiant les lectures de DO. (260 nm et 260/280 ratio)

Étapes critiques

Partie 1 & 2

Il ya plusieurs étapes essentielles à la mise en place d'une infection synchrone de la vaccine, le premier en faisant attention de sonication (ou trypzinizing) du virus, afin de désagréger les particules virales. Vaccine est fortement sujette à l'agrégation, et la perturbation des particules de virus est importante pour assurer même l'infection de cellules. Afin d'atteindre une infection synchrone, une MOI élevé (supérieur à 2) devraient être utilisés pour s'assurer que chaque cellule est infectée. Un mélange de cellules infectées et non infectées mènera à plusieurs tours de l'infection, des mélanges hétérogènes de points dans le temps, et asynchrones virales et réponses transcriptionnelles. L'infection doit être effectuée dans des quantités minimes de médias pour permettre au maximum d'adsorption des virus sur les cellules. En outre, en secouant régulièrement des flacons ou des boîtes de culture (toutes les 10 minutes) permet la distribution de virus à travers le flacon et s'assure que les cellules ne se dessèchent pas.

Partie 4

1-Bromo-3-chloropropane (PCA) est utilisé à la place de phénol pour réduire la contamination d'ADN génomique. Un traitement ultérieur option DNAse (Qiagen RNase Free-DNAse) peut également être réalisée afin d'éliminer tout ADN génomique restantes. Une seconde extraction au chloroforme est utilisé pour éliminer toute trace de solvant organique, de l'extraction, car même les traces peuvent inhiber les étapes d'amplification ultérieure. Des traces de phénol / PCA peut être détecté comme un pic à 270 nm (au-delà des standards de pointe à 260 nm) lors de la mesure d'absorbance de l'ARN total après extraction. Si une telle contamination apparaît, ré-extraire les ARN (en utilisant une méthode d'extraction du filtre ou d'une colonne basée sur l'ARN) avant de procéder à l'amplification. Montant minimal de l'ARN nécessaire pour effectuer une réaction d'amplification est 100 ng, mais 500-1000ng est préférable.

Application / Importance

Les ARN marqués résultant de ce protocole peut être hybridés pour la santé humaine, les biopuces virale, ou de la coutume pour évaluer les réponses expression des gènes dans les cellules infectées en culture. Plates-formes de biopuces varient, alors suivez les instructions du fabricant pour la préparation du mélange d'hybridation de sonde marquée.

En utilisant un tableau de poxvirus personnalisée conçue ^1, nous avons été en mesure de classer les gènes dans les catégories générales de «début» ou «en retard» basée sur le calendrier du signal d'hybridation et de si oui ou non réplication de l'ADN viral est nécessaire pour la détection de transcription. Nous avons observé les catégories attendus fonctionnelle des gènes dans chaque classe temporelle (par exemple, devrait gènes précoces, intermédiaire et tardive) des variations quant au moment exact de la transcription.

Les méthodes utilisées dans ce travail sont en mesure de prédire les gènes du virus transcrit tôt ou tard dans le cycle de réplication, mais ont plus de difficulté à distinguer au début uniquement par rapport aux gènes avec un promoteur précoce et tardif puisque les transcriptions avec un double promoteur précoce / tardif peut persister et être détectées à temps de retard. En outre, l'exécution à travers la transcription des gènes viraux fin peuvent affecter le signal à une sonde donnée / tache sur le tableau, comme l'ARN s'hybridant au tableau peut-être venu de l'ORF désigné ou un amont l'ORF. Carrelage tableaux ont tenté de résoudre ce problème, cependant des défis demeurent dans la détection de courir à travers la transcription en utilisant des approches basées hybridation ^2,3,4.

Schémas hôte transcriptionnelle peut également être évaluée en utilisant ces méthodes. Toutefois, la vaccine code pour une variété de mécanismes pour inhiber réponses de l'hôte, et réponses de l'hôte de la transcription peut être diminuée par rapport à d'autres stimuli ^5,6,7,8. Depuis l'expression de nombreux gènes impliqués dans la défense d'hôte est modifié après l'infection, la contribution des gènes viraux qui neutralisent les réponses immunitaires de l'hôte doivent donc être pris en considération.

En utilisant ces méthodes, une carte de la synchronisation de la transcription des gènes viraux peuvent être identifiés et utilisés pour interroger les fonctions de gènes viraux inconnus. En outre, ces méthodes peuvent être utilisées pour disséquer le dialogue complexe entre le virus et l'hôte. Ces méthodes sont largement applicables à d'autres systèmes d'infection hôte-pathogène. Si l'agent pathogène d'intérêt n'a pas polyadénylé ARNm, des méthodes alternatives peuvent être utilisées pour marquer directement l'ARN total, sans amplification linéaire. En analysant à la fois l'hôte et l'expression des gènes du virus lors de l'infection synchrone, ces méthodes nous permettent de mieux comprendre l'interaction du virus avec l'environnement hôte cellulaire ainsi que l'hôte contre-défenses contre les infections virales.

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