Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 1 di 3.

La famiglia

Parte 1: Impostare l'infezione

1. Crescere le cellule HeLa in fiaschi e aspettare che le cellule sono circa l'80% confluenti.
2. Preparare abbastanza virale medio di crescita per l'esperimento: regolare DMEM con il 2% FBS e senza antibiotici aggiunti.
3. L'infezione può essere effettuata sia con uno stock di greggio virus vaccinia con un titolo noto, o saccarosio virus purificato con un titolo noto se sei preoccupato per ospitare espressione genica.
4. Se si utilizza virus saccarosio purificato, procedere direttamente alla parte 2.
5. Se si utilizza un magazzino greggio virus vaccinico, appena prima l'infezione, sonicare un'aliquota del virus in un sonicatore tazza con un bagno di ghiaccio e per lo più un poco d'acqua.
   • Sonicare a circa 30 W per 20 secondi.
   • Vortex il tubo e ripetere la sonicazione 3 volte, aggiungendo più ghiaccio se necessario per mantenere la coppa piena di ghiaccio e freddo.
   • Vortex tra un passo e sonicazione.
   • Procedere alla parte 2.
6. In alternativa, se non si possiede un sonicatore tazza, mescolare un uguale volume dello stock del virus greggio e tripsina 0.25mg/mL.
   • Energicamente.
   • Incubare il brodo / tripsina mix di virus a 37 ° C bagnomaria per 30 minuti.
   • Vortex ad intervalli di 5-10 minuti.
   • Procedere alla parte 2.

Parte 2: le cellule Infezione

1. Calcolare la quantità di particelle virali necessari per infettare il monostrato alla molteplicità desiderato di infezione (MOI). Tipicamente, un alto MOI (tra 5 e 10) è utilizzato per timecourses infezione.
2. Aggiungere la quantità desiderata di virus saccarosio purificato o trypsinized virus greggio a 37 ° C terreni di crescita virale e mescolare bene. Si dovrebbe usare mezzi sufficienti a coprire appena il fondo del pallone. Ad esempio, 10 ml di media per un T-175 pallone.
3. Rimuovere i supporti dalle cellule e lavare con PBS temperatura ambiente.
4. Aggiungere il virus / media della crescita virale ad ogni pallone.
   • Agitare delicatamente, piastre inclinazione e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 del 5% per 1 ora.
   • Piastre di inclinazione e turbolenza ogni 15 minuti per diffondere virus in modo uniforme e mantenere le cellule umido.
   • Per un punto temporale 0hr/Mock, aggiungere i terreni di coltura virale solo, senza virus aggiunto.
5. Dopo l'incubazione 1 ora, rimuovere il supporto contenente il virus, e lavare tre volte con PBS temperatura ambiente.
6. Aggiungere la quantità massima di terreno di coltura virale ad ogni pallone. Per esempio, 30 ml di media per un T-175 pallone. Comincia a contare questa come punto 0 tempo hr.

Parte 3: Raccolta delle cellule

1. Controllare le cellule al microscopio e nota alcun effetto citopatico (CPE).
2. Togliere la carta e lavare le cellule con 30 ml di PBS temperatura ambiente.
3. Aggiungere 15 mL di tripsina alle cellule e incubare per 2-5min a 37 ° C.
4. Controllare al microscopio per il distacco delle cellule e toccare fiasco delicatamente per staccare le cellule.
5. Trasferire le cellule con una pipetta sterile sierologica in una provetta da 50 ml.
6. Lavare il pallone con un uguale volume di mezzi di crescita delle cellule, e aggiungere la media per le cellule trypsinized nel tubo conico.
7. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Rimuovere la tripsina / supporti dal pellet.
9. Risospendere il pellet cellulare in entrambi i reagenti TRIzol o il tampone di lisi dal kit desiderato isolamento del RNA.
10. Se si utilizza TRIzol, dividere il campione in 1 mL aliquote in provette etichettate Eppendorf 1,5 ml e congelare a -80 ° C.
11. Ripetere l'operazione per tutti i tempi, la raccolta un pallone per ogni punto del tempo.

Parte 4: estrazione di RNA di campioni in TRIzol

1. A questo punto, i campioni devono essere risospesi in reagente TRIzol e pronto per essere lavorato.
2. Aggiungere 200μL di reagente separazione di fase BCP per ogni 1 ml di TRIzol in ciascun tubo. Potrebbe essere necessario trasferire il campione ad un tubo più grande se si sta partendo con una grande quantità di TRIzol.
3. Vortex o agitare vigorosamente e incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti.
4. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 15 minuti.
5. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. La fase acquosa è lo strato più chiaro sulla parte superiore. Si dovrebbe essere il recupero di circa 600μL per ogni 1 ml di TRIzol hai iniziato con.
6. Fare una seconda estrazione fenolo / cloroformio, questa volta usando 500μL di cloroformio per 1 ml TRIzol, invece di BCP.
7. Vortex o agitare vigorosamente e incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti.
8. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 15 minuti.
9. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. La fase acquosa è lo strato più chiaro sulla parte superiore.
10. Aggiungi 20μg di acrilamide lineare per ogni campione. L'acrilamide lineare agisce come un vettore e aiuta a precipitare l'RNA.
11. Aggiungere 500 e micro; L di isopropanolo per 1 ml di TRIzol hai iniziato con a ciascun campione e mescolare bene.
12. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.
13. Centrifuga in una microcentrifuga a velocità massima per 10-15 minuti.
14. Il pellet di RNA sarà visibile nella parte inferiore del tubo. Con molta attenzione, rimuovere il surnatante dal tubo, o con un aspiratore a vuoto, o manualmente pipettatore. Non disturbare il pellet.
15. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70%.
    • Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% al pellet.
    • Centrifugare alla massima velocità 14.000 g per 5-7 minuti.
    • Con molta attenzione, rimuovere l'etanolo dal tubo, o con un aspiratore a vuoto, o manualmente pipettatore. Controllare che il pellet è visibile nella parte inferiore del tubo.
    • Scartare il surnatante.
16. Ripetere la fase di lavaggio. Dopo il supernatante viene scartato, marchio dove pellet è sul tubo.
17. Aria secca a pellet per non più di 5 minuti. Non asciugare eccessivamente, o l'RNA sarà difficile da ricostruire!
18. Se volete seguire il trattamento opzionale DNasi per rimuovere qualsiasi residuo di DNA dal campione, risospendere il pellet in 17μL di acqua priva di nucleasi. Altrimenti, risospendere il pellet in 20μL di acqua priva di nucleasi e continuare al punto 22.
19. (Opzionale trattamento DNasi) Utilizzando la RNasi-free Qiagen set DNasi, aggiungere 2μL Buffer RDD e 1ml ricostituito RNasi-free ho DNasi per l'RNA risospeso. Mescolare delicatamente.
20. (Opzionale trattamento DNasi) Incubare a 37 ° C per 30 minuti.
21. (Opzionale trattamento DNasi) Aggiungere 2μL di 2,5 mM EDTA e incubare a 65 ° C per 5 minuti per inattivare la DNasi. Non superare il tempo di inattivazione o la temperatura, come più volte / alte temperature possono provocare la degradazione dell'RNA.
22. Controllare la concentrazione di RNA da spettrofotometro.
23. Conservare il campione di RNA a -80 ° C.
24. (QC Opzionale) Verificare la qualità dell'RNA utilizzando un Bioanalyzer Agilent, o eseguendo il campione su un gel denaturante e controllando le letture OD. (260 nm e 260/280 ratio)

Passaggi critici

Part 1 & 2

Ci sono diversi passaggi critici della costituzione di una infezione sincrona vaccinia, il primo sonicazione facendo attenzione (o trypzinizing) del virus, in modo da disaggregare le particelle del virus. Vaccino è fortemente incline alla aggregazione e disgregazione di particelle del virus è importante per garantire anche l'infezione delle cellule. Al fine di ottenere una infezione sincrona, un alto MOI (maggiore di 2) deve essere usato per garantire che ogni cella è infetta. Una miscela di cellule infette, porterà a vari cicli di infezione, miscele eterogenee di punti di tempo, e asincrona risposte virale e host trascrizionale. L'infezione deve essere effettuata in quantità minime di mezzi di comunicazione per permettere il massimo assorbimento del virus su cellule. Inoltre, scuotendo regolarmente dei palloni o piatti della cultura (ogni 10 minuti) permette la distribuzione di virus attraverso il pallone e assicura che le cellule non seccare.

Parte 4

1-Bromo-3-cloropropano (BCP) è usato al posto di fenolo per ridurre la contaminazione del DNA genomico. Un successivo trattamento opzionale DNAsi (Qiagen RNAase Free-DNAsi) può essere effettuata anche per eliminare ogni residuo di DNA genomico. Una estrazione con cloroformio secondo è usato per rimuovere eventuali tracce di solventi organici dalle operazioni di estrazione, come anche tracce in grado di inibire l'amplificazione fasi successive. Tracce di fenolo / BCP può essere rilevato come un picco a 270nm (al di là del picco standard a 260 nm) quando si misura l'assorbanza di RNA totale dopo l'estrazione. In caso di contaminazione quali appare, ri-estrarre l'RNA (utilizzando un filtro o una colonna a base di metodo di estrazione RNA) prima di procedere alla amplificazione. Importo minimo di RNA necessari per eseguire una reazione di amplificazione è 100 ng, tuttavia, 500-1000ng è preferito.

Applicazione / Significato

L'RNA etichettati derivanti dal presente protocollo può essere ibridato a uomo, microarray virale, o personalizzate per valutare le risposte di espressione genica di cellule infette in coltura. Piattaforma Microarray variare, quindi seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della miscela di ibridazione dalla sonda marcata.

Utilizzando una matrice personalizzata poxvirus progettato ^1, siamo stati in grado di classificare i geni nelle categorie generali di "early" o "in ritardo" in base alla temporizzazione di segnale di ibridazione e se non la replicazione del DNA virale è stato richiesto per il rilevamento di trascrizione. Abbiamo osservato le categorie atteso funzionali di geni in ciascuna classe temporale (ad esempio, prevede geni precoci, intermedio e in ritardo) variazione per quanto riguarda la tempistica esatta trascrizione.

I metodi utilizzati in questo lavoro sono in grado di predire geni del virus trascritti anticipo o in ritardo nel ciclo di replicazione, ma hanno più difficoltà a distinguere precoce solo contro i geni con un promotore precoce e tardiva poiché trascrizioni con un doppio inizio / fine del promotore può persistere ed essere rilevato, a volte in ritardo. In aggiunta, run-through trascrizione di geni virali in ritardo può influire segnale a una sonda data / spot sulla matrice, come l'RNA ibridazione alla matrice può provenire dal designato ORF o un monte ORF. Array piastrelle hanno tentato di risolvere il problema, tuttavia le sfide restano nella rilevazione attraversano la trascrizione utilizzando approcci basati ibridazione ^2,3,4.

Modelli di ospitare trascrizionale può essere valutata anche con questi metodi. Tuttavia, vaccinia codifica per una varietà di meccanismi per inibire le risposte di accoglienza, e le risposte ospitare trascrizionale può essere ridotta rispetto ad altri stimoli ^5,6,7,8. Dal momento che l'espressione di molti geni coinvolti nella difesa ospite è alterata dopo l'infezione, il contributo dei geni virali che contrastare risposta immunitaria dovrebbe quindi essere presa in considerazione.

Utilizzando questi metodi, una mappa dei tempi di trascrizione di tutti i geni virali possano essere identificati e usato per interrogare funzioni dei geni virali sconosciute. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati per sezionare il dialogo intricato tra virus e ospite. Questi metodi sono generalmente applicabili ad altri sistemi ospite-patogeno infezione. Se l'agente patogeno di interesse non ha polyadenylated mRNA, metodi alternativi possono essere usati per etichettare direttamente la RNA totale, senza amplificazione lineare. Attraverso l'analisi sia di accoglienza e di espressione genica del virus durante l'infezione sincrona, questi metodi ci permettono di ottenere informazioni in interazione del virus con l'ambiente host cellulare così come contro-ospite difese contro le infezioni da virus.

Whitehead Institute Fellows Fondi