Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34⁺ 세포

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34⁺ 세포. CD34 방법⁺ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

혈소판 생산 thrombopoiesis로 알려진 프로세스에서 골 수에서 주로 발생 합니다. Thrombopoiesis, 동안 조 혈 조상 세포 형태 혈소판 선구자 라는 없으며, 말기 출시 되 나 proplatelets 긴 세포질 프로세스에서 혈소판 분화를 구분 합니다. 없으며 희귀 세포 골 수에 국한 되며 따라서 실험실 사용을 위해 충분 한 숫자에 수확 하기가. 인간의 없으며의 효율적인 생산 수 달성 생체 외에서 CD34 경작⁺ 적당 한 조건 하에서 세포. 여기서 설명 하는 프로토콜 CD34의 격리에 설명 합니다⁺ 탯 줄 혈액 샘플에서 정렬 하는 자기 셀에 의해 세포. 매우 순수 하 고, 성숙한 없으며 혈 청 무료 조건 하에서 생산 하는 필요한 단계를 설명 합니다. Megakaryocyte 차별화의 phenotypic 분석 및 proplatelet 형성 및 혈소판 생산의 결정도 제공 됩니다. 이펙터 megakaryocyte 차별화 및 항 혈소판 항 체 등 thrombopoietin mimetics proplatelet 형성에 영향을 주는 생물 학적 기능 검사 경작된 한 세포에 추가할 수 있습니다.

일반 실험실 사용에 대 한 기본 인간의 없으며 (MK)의 충분 한 숫자의 절연은 ~0.01% nucleated 세포¹의 담당 그들은 골 수에서 낮은 주파수로 인해 가능 합니다. 편리한 대안 ex vivo 확장 및 조 혈 줄기와 조상 세포 특정 성장 요인의 존재의 차별화 이다. Megakaryocytic 문화에 대 한 가장 효과적인 성장과 차별화 요소는 MKs. Thrombopoietin (TPO) 생산 문화 시스템에서 고용 cytokines 줄기 세포 요소 (SCF; c-kit ligand), IL-11 및 인터 루 킨 (IL)-3 등의 숫자 되었습니다. 혼자 또는 다른 cytokines, SCF 및 IL-3²등 효과적 이다. TPO 확산 MKs²의 성숙에 결과 줄기 세포 인구에 작동할 수 있다.

Proplatelets 라는 세포질 돌출부에서 MK 생산 혈소판, vivo에서, 약 1 x 10¹¹ 혈소판은 최대 1000는 150-400 x 10⁹/L. 혈소판 생산에서 생체 외에서 혈소판 수를 유지 하기 위해 매일 형성 -배는 vivo에서 견적³, 그리고이 에겐 CD34를 사용 하 여 여러 문화 조건 보다 낮은⁺ MK와 혈소판 생산에서 체 외에서개선 하기 위해 조 혈 조상 세포. CD34의 초기 소스⁺ 세포 MK 차별화 사용 했다 인간 주변 혈액⁴. 다른 셀 소스 등이 골^5,6, 배아 줄기 세포/유도 만능 줄기 세포 (ESC/iPSC)⁷, 탯 줄 혈액 (UCB)^8,9,10 . 인간의 골 CD34^{+ 11} 와 마우스 리니지 부정적인 골 수 세포⁵ 생산 MK와 혈소판 시험관; 인간의 골의 가용성의 부족 CD34의 근원으로 그것의 사용을 제한 하는 그럼에도 불구 하 고,⁺ 세포. 대조적으로, ESC, iPSC 생체 외에서 혈소판 생산을 위한 세포의 무제한 소스를 나타냅니다. 이 세포에서 혈소판 생산 murine OP9 셀 등 오랜 문화 피더 세포를 필요합니다. 급지대 무료 조건에서 파생 된 혈소판 기능 덜¹²나타납니다. iPSC 파생 혈소판 때문에 그들은 큰 규모로 확장 될 수 있다 임상 설정에 사용 될 가능성이 있다. 이 프로세스에서는 녹음 방송 요인과 장기 세포 문화¹³lentiviral 중재 변환 합니다.

UCB는 CD34의 액세스할 수 있는 소스⁺ 세포에 쉽게 사용할 수 있는 설정 연구. TPO 혼자 코드의 차별화를 홍보할 수 있는 혈액 유래 CD34⁺ 세포와이 생겨나게 혈 청 보충 또는 급지대 셀과 공동 문화에 대 한 필요 없이 매우 순수 하 고, 성숙한 MKs. 다른 cytokines SCF UCB CD34에서 차별화를 저하 될 수 있습니다와 같은⁺ 세포, Flt 3 ligand 그리고 IL-11 미 숙 없으며¹⁴의 생산을 촉진 하는 동안. 이 프로토콜에 설명 합니다 매우 순수한 MK 문화 코드 혈액 CD34에서에서⁺ 의 생산 세럼 무료 조건에서 세포.

이 프로토콜 남쪽 동부 쪽 시드니 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 대학의 뉴 사우스 웨일즈의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 비준 되었다. 탯 줄 혈액 건강 한 기증자 로부터 얻은 의해 시드니 코드 혈액 은행 (시드니, NSW, 호주)를 제공 했다. 볼륨 약 100 mL의이 절차를 위해 사용 되었다.

참고: 클래스 II biosafety 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 코드 혈액 주머니의 외부 오염을 (가 위, 핀셋) 불 임 악기를 사용 하 여이 절차에 대 한.

1. 탯 줄 혈액 세포 준비 및 절연 CD34의⁺ 세포

1. 살 균 분리 버퍼 (SB) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.2, 그리고 포함 된 0.5% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA를 준비 합니다.
2. (혈액 10 mL 당 1 개의 관은 필요) 50 mL 원뿔 관으로 SB의 10 mL를 분배. 10 mL 주사기에 장착 G18 무딘 바늘을 사용 하 여, 혈액 10 mL 가방에서 그리고 포함 하는 SB의 10 mL 50 mL 튜브로 분배.
3. 두 개의 레이어를 만드는 희석된 혈액을 포함 하는 관의 바닥에 림프 구 분리 미디어 ( 재료의 표참조)의 15 mL를 추가 합니다.
   참고: 다른 레이어를 혼합 하지 마십시오 튜브의 하단에 천천히 미디어 분배.
4. 휴식 및 가속 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1200 × g에서 튜브를 원심.
5. 단 세포 (각 관에서 약 5-10 mL) 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 들어 있는 튜브의 중앙 레이어를 전송 합니다. SB 각 관 50 mL의 총 볼륨을 추가 합니다.
6. 실시간 삭제에서 10 분 동안 400 × g에서 원심은 상쾌한.
7. Resuspend 셀 펠 릿 하고있다 결합의 5-10 mL에 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 정지 세포와 볼륨 50 mL SB와 함께.
8. 수 셀 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 또는 자동 세포 카운터 ( 재료의 표참조). CD34의 비율을 확인 하려면⁺ 세포 샘플, resuspend 2.5 × 10⁵ 셀 SB와 얼룩의 100 µ L에 4 ° c.에 15-30 분에 대 한 안티-CD34-PE 항 체의 10 µ L을 추가 하 여 Cytometry (그림 1A) 분석.
9. 4 ° c.에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리기 튜브 상쾌한을 삭제 합니다.
   참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 단 세포가이 단계에서 동결 수 있습니다.
10. 10⁸ 셀 당 SB의 300 µ L 셀 resuspend FcR 인간 IgG의 100 µ L를 추가 (차단 시 약, 재료의 표참조) 및 100 µ L 10⁸ 셀 당 CD34 자석 구슬의. 부드럽게 혼합 하 고 30-40 분 동안 4 ° C에서 품 어.
    참고: 단일 셀 서 스 펜 션은 필수 (필요한 경우 통과 셀 30 µ m 필터 시 약을 추가 하기 전에). 또는 그이 하 10⁸ 셀에 대 한 여기에 설명 된 시 볼륨을 사용 합니다. 10 이상⁸ 셀에 대 한 시 약 (SB, 솔루션, 그리고 CD34 자석 구슬 차단)를 따라 확장할.
11. LS 분리 열 인큐베이션 기간 동안 준비 하 여 마그네틱 홀더에서 LS 열을 배치 하 고 유출 하고있다 삭제의 3 mL로 세척.
    참고: LS 분리 열 최대 2 × 10⁸ 총 셀으로 로드할 수 있습니다. 작고 큰 열 사용할 수 있습니다.
12. 5-10 mL SB의 셀 혼합물에 추가 하 고 400 × g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
13. Resuspend 1.5 ml SB의 세포 및 세포 현 탁 액 (1.5 mL) LS 열에 로드 합니다. 레이블이 없는 셀 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)에 포함 된을 통해 흐름을 수집 합니다. 액체 드레인과 1.5 mL SB의 열을 씻어 보자.
14. (3 mL)를 통해 수집 된 흐름 열에 다시 로드 하 고 동일한 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)을 통해 흐름을 수집. 3 번 3 mL SB와 LS 열 세척.
    참고: 필요한 경우 셀 부정적인 분수 (12 mL)에 얼룩이 질 수 있다 안티 CD34 항 체 확인 CD34의 캡처로⁺ LS 열에 의해 세포.
15. 마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 2 mL SB의 새로운 15 mL 튜브에 주사기 플런저를 천천히 세포를 플러시.
16. 다시 열에 자석 분리기 및 로드 셀의 2 mL에 다시 열을 놓습니다. 통해 흐름을 수집 하 고 2 mL SB로 씻어. 이것은 부정적인 분수 #2 (4 mL) 이다.
17. 자석 분리기에서 LS 열을 제거 하 고는 CD34 수집 주사기 플런저와 꾸준히 고 단단히 하고있다 플러시 세포의 2 개 mL를 추가⁺ 셀 분수. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
18. 4 ° c.에 15 분 동안 400 × g에서 긍정적인 분수와 함께 원심 분리기 튜브 폐기는 상쾌한. CD34에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀 resuspend⁺ 셀 (SFM, 재료의 표참조).
    참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 셀 수 있는 동결 액체 질소에이 단계에서.

2. 순도 확인 격리 된 CD34의⁺ 세포

1. 10 µ L 안티-CD34-PE 항 체와 20 µ L 안티-CD45-PerCP 항 체 4 ° C (사용 별도 튜브 isotype 컨트롤)에서 15 분에 대 한 긍정적인 분수에서 2 × 10⁴ 셀을 얼룩 (그림 1B).
2. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 SB의 200 µ L 펠 릿 Resuspend.
3. 흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 파편 (그림 1B)을 제외 하도록 라이브 셀 인구 게이트. PE 및 PerCP isotype 컨트롤 (그림 1B)를 사용 하 여 PE 및 PerCP 긍정적인 인구에 대 한 게이트를 설정 하 고 CD34의 비율 결정⁺/CD45⁺ 세포.

3. megakaryocyte 차별화

1. 씨앗 5 × 10⁵ 셀/mL CD34⁺ 12-잘 접시에 잘 당 50 ng/mL 재조합 인간 thrombopoietin (rhTPO)와 보충 SFM의 2 mL에 세포. 37 ° C, 5% CO₂ 습도 분위기에서 세포를 품 어. 셀 confluent 경우 분석을 위해 필요한 전에 세포를 수확 하 고 신선한 미디어와 rhTPO 여러 우물으로 분할.
   참고: 두 개 또는 3 개의 우물 특별히 다른 시간 지점 (예를 들어, 7, 9, 10 일)에서 차별화를 모니터링 하는 준비 되어야 한다.
2. 다른 우물에 셀을 방해 하지 않고 차별화를 모니터링을 마련해 우물에서 세포를 수확.
3. 20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 세포와 10 µ L 안티-GPIX/CD42a-알 렉 사 Fluor 647 항 체 100 µ L. 마지막 볼륨에서 컨트롤 설정 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 튜브. 4 ° c.에 15 30 분 동안 품 어
4. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다.

4. proplatelet 계산, 혈소판 열거, 및 혈소판 활성화

1. 8 또는 감 별 법 및 종자의 9 일에 1 × 10⁴ 셀/잘 50 ng/mL rhTPO와 보충 하는 신선한 SFM의 200 µ L에 48-잘 접시에서 (3.1 단계)에서 세포를 수확. 37 ° C, 5%에서 5 일 동안 문화 공동_2.
   참고: 정량 목적 3 중 웰 스 씨. 이 낮은 밀도 시각화를 위한 필요 하며 문화의 2 일 후 나타나는 시작 proplatelet-베어링의 mk. Proplatelets 일반적으로 계산 합니다. 피크 일 4와 5 사이입니다.
2. 10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 가벼운 현미경에 전체 잘에서 proplatelet 베어링 MK의 수를 계산 합니다.
   참고: 온수 (37 ° C) 현미경 단계가 바람직합니다, 이후 proplatelet 확장의 수축 하면 오랜된 시간 동안 실내 온도에 세포를 유지. Proplatelets MK 시체에서 긴 확장으로 관찰 된다. 각 MK 여러 proplatelet 돌출 할 수 있습니다. Proplatelets 개발는 MK의 몸 크기가 감소 합니다.
3. 세포를 수확 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심. 3.3 및 3.4 단계에 설명 된 대로 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체, 세포를 얼룩. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율을 계산: pbMK (%) = [(Proplatelet 베어링 MKs/잘) / (총 CD41⁺ 세포 / 잘)] x 100
4. 문화 매체에 발표 하는 혈소판을 계산, 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다.
   1. 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체 4 ° c.에 20-30 분으로 얼룩 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 컨트롤 튜브를 설정 합니다.
   2. SB의 150 µ L 구슬 세 50 µ L를 추가 합니다.
   3. 흐름 cytometric 분석을 위해 로그 스케일 FSC 그리고 SSC를 설정 합니다. 4.4.1 게이팅 혈소판 (그림 3A)에 대 한 설정 섹션에 설명 된 대로 사용 하 여 정상적인 인간의 혈액 혈소판 혈소판이 풍부한 혈장에서 CD41 FITC와 스테인드.
   4. 구슬 cytometry에 의해 계산 스테인드 혈소판 분석. 구슬 SSC 점도 (그림 3A) 대 FSC를 사용 하 여 계산의 1000 이벤트를 수집 합니다. CD41 FITC 긍정적인 이벤트 (그림 3B) 수식을 사용 하 여에 따라 혈소판의 수를 계산.
      µ L 당 혈소판 = [(CD41 FITC 긍정적인 이벤트의 번호)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/볼륨 샘플)]
5. 혈소판 활성화를 분석 하려면 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다. 작은 셀을 5 분 동안 200 x g에서 Tyrode의 버퍼 (137 mM NaCl, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl₂, 1.8 m CaCl_2, 0.2 m m 나₂HPO₄m, 12 mM NaHCO₃, 5.5 m m D-포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 1 mL를 추가 합니다.
   1. 상쾌한 그리고 혈소판 크기의 입자를 작은 10 분 800 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.
   2. 상쾌한 삭제 하 고 Tyrode의 버퍼의 100 µ L에서 resuspend. 20 µ M. 최종 농도 20 µ L PAC1 FITC 항 체와 아데노신 diphosphate (ADP)의 추가 FITC 긍정적인 이벤트의 비율을 확인 하려면 cytometry로 20 분 분석에 대 한 실 온에서 품 어. 사용 신선한 인간 혈소판 긍정적인 컨트롤 (그림 3C)와 같은 방식으로 처리.

이 프로토콜 수 있습니다 매우 순수 MK 문화 코드에서의 준비 혈액 유래 CD34⁺ 세포. CD34의 비율⁺ 세포 탯 줄 혈액은 약 1.3¹⁵ (그림 1A)와 단 세포 (단계 1.8) 범위 90-300 x 10의 총 수 UCB 단위 당⁶ . CD34의 순도 + CD45 + 세포 격리 범위 90에서 99% (그림 1B) 후. MK (CD41 정의⁺ 세포) 혈 청 무료 CD34 초기에 관찰 된다⁺ 세포 rhTPO의 문화. 7 일에의 비율 MK 성숙 (CD41⁺ 및 CD42a⁺ 세포)은 일반적으로 30-40% (그림 1C). CD41 최고 수준의⁺ 및 CD42a⁺ 두 배 긍정적인 세포 (90 ~ 99%) 10와 차별화 (그림 1C)의 12 일 사이 관찰 됩니다. 관찰 하는 변화에 따라 달라 집니다 주로 코드 혈액 소스는 CD34의 순도⁺/CD45⁺ 세포 단계 1.17에서에서 격리. 입력된 CD34 당 5-10에서 10 일 범위에 성숙한 MK의 수확량은⁺ 셀. 성숙한 MK (CD41⁺/CD42b⁺) 형광에서 관찰 현미경 그림 2A에 표시 됩니다. 교양된 MK 큰, 보통 multinucleated 셀 (그림 2A, 화살촉)로 나타납니다. MK의 세분화 된 콘텐츠는 vWf (녹색) 및 CD62p (p selectin, 빨간색) 얼룩 (그림 2B)에 의해 결정 되었다. 교양된 MKs에서 관찰 ploidy 분포는 그림 2C에 표시 됩니다.

Proplatelets는 길고, 파란색 섬유 또는 필 라 멘 트 MK 시체에서 확장 하는. Proplatelets 몇 백 마이크로미터 긴¹⁶ 고 지점과 팽창된 지역 포함. Proplatelet 베어링 MK 특성은 2D 그림에에서 나와 있습니다. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율 1.3 ± 0.17% 이었다.

혈소판 분석 하 고 프로토콜에 설명 된 대로 계산 될 수 있습니다. 그림 3B에서 같이, 대부분 혈소판 표면에 뜨는 세포 배양에서의 주변 혈액 혈소판 혈소판 마커 CD41에 대 한 긍정적인 (그림 3B) 분석 게이트 내에서을. 19에서 문화에서 생산 mk. 혈소판 당 42 혈소판이 메서드 범위에서 혈소판 항복 ADP 활성화 관련 PAC1 단일 클론 항 체 (그림 3C)의 증가 된 바인딩에 의해 결정 등 혈소판 촉진제에 의해 활성화 될 수 있다 .

그림 1: Flow cytometry 플롯 CD34의⁺ 세포 격리 및 문화에서 MK 차별화. (A) 단 세포 (왼쪽된 패널에 표시 된 문이) 인간 탯 줄 혈액 (단계 1.8)에서 정화는 CD34의 비율을 결정 하기 위해 안티-CD34-PE 항 체로 얼룩진 했다⁺ 세포 샘플 (1.3%, 오른쪽 패널). (B) 분리 후 긍정적인 분수 (1.17 단계) 안티-CD34-PE 및 안티 CD45 PerCP 항 체와 스테인드 했다. 풍부한 CD34⁺ 인구 (98.1%, 오른쪽 패널, 상단 오른쪽 사분면) 그림에 표시 됩니다. MK의 (C) Phenotypic 분석에서 차별화 생체 외에서 CD34 + 세포에서 7 일 또는 11 일 안티-CD41 및 안티-CD42a 항 체와 얼룩 했다. 성숙한 MK는 두 CD41에 대 한 긍정적인⁺ 및 CD42a⁺ (상단 오른쪽 사분면). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: MK 얼룩, ploidy 및 생체 외에서proplatelet 형성. (A) 안티-CD41-PE와 CD42b APC 항 체로 얼룩진 하루 11 MK의 형광 이미지. 핵은 DAPI와 얼룩이 있었다. 노란색 화살표는 안티 CD62p (빨간색)와 안티-CD42b-APC (마젠타) 항 체 다 핵 MKs. 눈금 막대, 30 µ m. (B) 형광 이미지 vWf (녹색), 안티로 얼룩진 하루 14 MK의를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 얼룩이 있었다. 눈금 막대, 15 µ m (C) 대표 제어 전략 CD41 ploidy 분포를 보여 주는⁺ 이벤트. 그래프 (하단 패널) ploidy 클래스의 관찰 된 분포를 보여 (n = 4), 오차 막대, sd. (D) proplatelet 베어링 MK의 특성 형태 표시 됩니다. MK 몸 화살표로 표시 됩니다. MK (proplatelets)에서 연장 긴 세포질 프로세스는 화살촉으로 표시 됩니다. 하나 또는 두 개의 MK는 이러한 proplatelet 확장을 생산 하 고 있는지 여부를 보기의 일부 지역/분야에 명확 하지 수 있습니다. 이 거꾸로 한 현미경, 10 X 목표와 함께 찍은 한 proplatelet 베어링 mk. 이미지 계산 한다. 스케일 바, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 혈소판의 생산 생체 외에서 혈소판 활성화. 혈소판이 풍부한 혈장에서 (A) 인간의 혈소판 분석 게이트 앞으로 옆 분산형 (왼쪽된 패널)에 대 한 로그 스케일을 사용 하 여 설정 하는 데 사용 했다. 오른쪽 패널 MK 문화에서 셀을 표시합니다. 혈소판 생산 생체 외에서 인간 혈소판에 대 한 정의 분석 게이트에서 관찰 된다. 셀과 세 구슬 그림에 표시 됩니다. Plt, 혈소판 (B) 혈소판 생산 체 외에 안티-CD41 항 체 물 했다 혈소판이 풍부한 혈장에서 인간 혈소판 분석 게이트 측 분산형 및 앞으로 대 한 로그 스케일을 사용 하 여 설정 하 고 CD41 FITC 게이트 내 프로필을 비교 사용 되었다. C-FITC FITC isotype 제어 (C) 혈소판 활성화 혈소판이 풍부한 혈장에서 20 µ M. 인간 혈소판의 최종 농도에 ADP에 의해 치료를 다음과 같은 제어 (위 패널)로 사용 되었다. 문화에서 생산 하는 혈소판은 낮은 패널에 표시 됩니다. 항 체는 혈소판 활성화를 나타냅니다 PAC1의 바인딩. C FITC, FITC isotype 컨트롤 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기에 설명 된 프로토콜은 MK와 문화 탯 줄 혈액에서 혈소판의 일관 생산에 적합 합니다. 이러한 세포 MK 확산, 감 별 법, proplatelet 형성 및 혈소판 생산에 마약 또는 생물 학적 활동의 효과 같은 다양 한 프로세스를 연구에 사용할 수 있습니다.

다양 한 문화 미디어와 cytokine 조합 문학에서 제시 되었다. ⁺ 줄기 세포 요소, Flt 3 ligand, 일리노이-3, 일리노이-6 지원 CD34 등 cytokines의 추가 확산 세포. 그러나,이 확장 문화¹⁴감소 MK 순수성에서 발생합니다. 혈 청 무료 미디어와 혼자, rhTPO를 사용 하 여, 여기에 제시 된 방법은 조상 세포의 중요 한 확장을 허용 하지 않습니다 하지만 unilineage megakaryocytic 확산 및 감 별 법 및 MK의 일관 된 생산 (90-99 %CD41⁺ CD42a⁺ 두 배 긍정적인 세포) 다른 계보에서 오염 없이. MK 형성에 대 한 문화 기간은 10 ~ 12 일 stromal 지원 또는 급지대 셀에 대 한 필요 없이입니다. 이 호의 더 큰 문화 기간 (20 일 이상)^17,18필요로 하는 다른 방법으로 비교 합니다. 현재 프로토콜에서 혈소판 수확량은 19-42 혈소판 입력된 CD34 당 420 혈소판 또는 MK 당⁺ 셀. 낮은 혈소판에서 대부분 프로토콜 결과^18,19를 생성합니다.

수확량은 다른 방법에 상대적으로 높은, CD34 셀의 큰 소스 치료 사용에 대 한 혈소판의 충분 한 숫자를 생산 하기 위해 필요 합니다. 코드 혈액 MK 낮은 속도로 성숙, 일반적으로 작은 (낮은 ploidy 클래스의) 그리고 혈소판 생산 능력²⁰감소. 그럼에도 불구 하 고, 신선한 UCB 일반적으로 더 접근 가능한 리소스 이며이 연구원에 대 한 상당한 우위를 나타냅니다. 또한 MK 및 치료 목표와 혈소판의 높은 수율을 생산할 수 있는 다른 방법이 설명된^13,17있었다.

가변성을 고려의 몇몇 근원이 있다: A)의 코드 혈액 단위 품질. 24 시간 이내 수집만 코드 혈액 CD34의 원본으로 사용 해야 합니다⁺ 세포. 혈전을 포함 하는 코드 혈액 단위 또한 삭제 한다. CD34의 비율 B)⁺ 단 셀 분수 (1.8 단계) 세포:⁺ 미만 0.3 %CD34 단 셀 분수를 사용 하 여 셀 발생할 수 있습니다 상대적으로 낮은 순도 CD34의 낮은 수율⁺ 세포. 이 세포는 MK 차별화에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것만 중력 힘에 의해 액체 드레인 수 있도록 필수적 이다 (예를 들어, 1.13, 1.14, 1.16 단계). 열 차단, 경우 자석에서 열을 제거, 새로운 튜브로 부드럽게 주사기 플런저와 함께 세포를 밀어 새로운 equilibrated 열에 다시 로드 하는 것이 좋습니다.

다양 한 조건에는 혈소판 수 그리고 기능에 영향을. 혈소판 외부 및 내부 출혈로 이어질 수 있는 혈소판 숫자에 표시 된 감소를 의미 합니다. 자동-면역 조건 면역 혈소판 (ITP) 등 약물 유발 혈소판 (DITP) 혈소판^21,22의 잘 알려진 원인이 있습니다. 반성 루 푸 스, 류 마티스 관절염 등 다른 면역 질환은 혈소판에 해로운 효과 가질 수도 있습니다. 비 면역 혈소판의 원인에는 암 치료, 심한 외상, 감염, 골 수 실패, 그리고 수술 포함 됩니다. 화학 요법을 받고 또는 줄기 세포가 식을 받은 환자에서 혈소판의 높은 활용도 인해 혈소판 수혈 지난 수 십년 동안 꾸준히 증가 했다. MK와 혈소판 연구 의심할 여 지 없이 임상 응용 프로그램에 대 한 대규모 혈소판 생산의 개발에 도움이 됩니다. 체 외에서 생산 기능 혈소판의 혈소판 부족을 방지 하 고 내 화 환자에 혈소판 수혈을 허용 것 이라고. MK 차별화 및 혈소판 생산에서 체 외에 는 모두 병 적인 조건 및 혈소판 형성을 이끌어 내는 생리 적인 메커니즘의 이해와 연구에 대 한 중요 한 도구.

저자는 공개 없다.

저자 (그랜트 1012409 제너 시스에 링크 된 프로젝트) 호주 보건 및 의료 연구 위원회의 지원을 인정 한다.