Method Article
The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.
The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.
ERG는 광에 응답하여 망막에 의해 발생하고, 눈의 각막 표면으로부터 기록 전위이다. 기록 조건을 신중하게 관리하는 경우, ERG 망막 기능을 평가하기 위해 다양한 방법으로 사용될 수있다. 여기서 우리는 '플래시 ERG', 망막 Ganzfeld 배경에 제시된 간단한, 밝은 플래시에 노출되었을 때 발생하는 전위를 기록하는 방법을 설명했다. Ganzfeld는 균일하게 빛을 분산 빛의 플래시가 약 균일하게 전체 망막에 도달한다. 망막을 기록하기 전에 어두운 적응되며, 동물의 기록을 위해 준비 될 때 어두운 적응이 유지되는 경우, ERG 두로드와 콘 감광체에 의해 생성된다 얻어진.
어두운 적응 플래시 에르그는 두 가지 방법으로 분석 된 특성 파형을 가지고 있습니다. 먼저, ERG 파형의 초기와 후기 컴포넌트 구별하고 뉴런의 시퀀스와 관련되어왔다망막 알 활성화. 최초의 구성 요소는 짧은 대기 시간에 음의 가능성, 파 (그림 1)입니다. 이것은 양의 진행 가능성이 뒤에, B 파를했다. B 파의 상승 단계는 별도의 구성 요소 (진동 전위 또는 OPS) 간주되는 진동을 보여줍니다. 파장은 감광체에 의해 생성 된 것으로 간주되며, 무 축삭 세포에 의한 1 층의 내측 핵 세포 및 OPS 의한 B 표면파.
자극 강도에 기초하여, 매우 희미 깜박에 응답 암순응 임계 반응이 가능하다 불린다. 암순응 임계 응답은 망막 신경절 세포 2-4에서 생성하는 것으로 이해된다. 둘째, 플래시 ERG 빛 적응에 의해 분리 될 수 있고, 또는 두 플래시 프로토콜에 의해 일단이 상기 조작 패널과 원뿔 중심 성분으로, 후술. 포토 픽 조건 하에서, 콘 인구가 낮기 때문에, 전파는 쥐에서 검출되지이지만 OPS와 B 파장은5 취소합니다. 그의 망막 높은 콘 인구가 영장류에서, 일단이 상기 조작 패널과 원뿔 경로 모두 검출 파 (6)를 생성합니다.
종종 플래시 ERG로부터 추출 두 유용한 대책 감광체 인구가 위험한 점 밝은에 노출, 예를 들면, 감소도 2에 도시 된 전형적인 플래시 응답.와도 1에서와 같이 측정 A- 및 B- 파의 진폭, 아르 빛, 망막 전위도의 모든 구성 요소가 감소된다. 원격 허혈 (RIP)와 같은 신경 개입, A-와 B 파 (그림 3)의 진폭의 보존에 의해 검증 될 수있다. 요약하면, ERG의 분석은 건강 손상 가볍고 neuroprotected 망막 간의 비교를 가능하게한다.
이 프로토콜은 시드니 대학의 동물 관리 가이드 라인을 따른다.
1. 만들기 전극
가벼운 자극 및 망막 전위도 셋업 2. 연결 및 교정
망막 전위도 실험에 3 일 이전
에르그 실험의 4 일
5. 원격 허혈
6. 가벼운 손상
7. 망막 전위도 데이터 추출 및 분석
프로토콜은 생체 내 쥐의 망막 시각 기능을 측정 할 수있다. 전파, 광 수용체의 기능을 측정하고, B-파도 내측 망막 기능의 측정은,도 1에 주석 첨부된다.
도 2a에 도시 된 바와 같이 증가하는 빛 자극과로드 지배 ERG 신호 증가. 파장이 0.4 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 2.5 로그 스코틀랜드의 cd.sm에서 포화 될 때까지 파의 진폭이 증가 -2 (미도시)에서 ~ 명백해진다. 트윈 플래시 패러다임은도 2b에서와 같이, 콘 및로드 단리 응답 혼입 ERG 신호를 분리하는데 사용되어왔다.
이 에르그 기록 기술은 신경 개입을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 기준 기록은 빛 손상 이전에이 그림 3a에 볼 수 있습니다 일주일에 완료했다. 그림에서 보여 파 및 b 파의 진폭을 모두 감소 등의 손상,URE의 3B. 원격 허혈은도 3c에 도시 된 바와 같이, ERG 진폭의 손실을 저감 할 수 있었다. 원격 허혈 기술은 "무릎"위의 지혈대의 올바른 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 그림 3D에서와 같이 지혈대의 잘못된 응용 프로그램은, 망막에 빛의 손상을 방지하지 않습니다.
그림 1 :. 시간 표시 T0에서 주어진 빛의 밝은 플래시로 어두운 적응 눈의 각막에서 기록 된 바와 어두운 적응 에르그 추적에서 파 및 b 파의 측정. 파의 진폭은 제 트로프 (적색 화살표)에 대한 기준선을 측정한다. B 파의 진폭은 다음과 같은 긍정적 인 피크 (파란색 화살표)에 파의 저점을 측정한다. 암시 시간 (대기 시간)이 자극으로부터 측정되는추적에 관심 지점에 인공물 (T0), 같은 파 (대괄호)의 저점으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 증가 플래시 강도와로드와 콘의 답변 분리 어두운 적응 에르그의 개발 빛의 섬광의 증가에 어두운 적응 눈의 각막에서 기록 된 바와 흔적.. 파 밝은 강도에 나타납니다. 스콧 cd.sm -2, 피크 B 파가 포화하지만 파장은 성장을 계속했다 1.4에 비해 0.4 로그 (A). (B)에, 쌍둥이 깜박 중첩된다. 두 개의 2.0 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 깜박은 500 밀리 초 ISI에 의해 분리된다. 첫 번째 플래시는 혼합을 생성응답 (블랙), 및 제 플래시 원뿔 만 응답 (점선)를 생성한다. 콘 응답을 빼면하면 고립로드 응답 (회색)를 산출한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 :. ERG는 주제 파형, RIP에 의해 (C) 망막 컨디셔닝 손상 광에 노출되기 전에 (A) 정상 망막 망막 광 손상, (B)를 위해 여기에 도시되어 망막 기능의 척도를 제공하고, (D) 망막은 비효율적 RIP에 의해 조절하고 손상을 빛에 노출. 동일한 플래시 에너지는 각각의 레코드 (2.0 로그의 cd.sm -2)를 사용 하였다. D의 레코드 압력 커프를 들어뒷다리에 잘못 넣고 허혈이 설정되지 않았습니다. 가벼운 손상이 망막 전위도 (B)의 진폭을 줄이고 RIP는 감소를 완화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. ERG 전극을 닫습니다 전극이 왼쪽에서 오른쪽으로, 도시 건설 될; 양극, 음극은 입 후 옆구리 피하에 삽입되는 바늘에 접속 악어 클립들로 구성되어 상기 기준 전극에 위치하는 각막에 문의한다. 여기를 클릭하세요 큰 버전을 볼 이 그림의.
위에서 설명한 어두운 적응 플래시 에르그 방법은 쥐의 망막 기능을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법이다. 파 및 b 파 모두 빛의 손상에 의해 감소되었다. 원격 허혈 양상은 파 및 b 파의 광 손상에 의한 감소를 완화. 망막 기능이 보존 원격 허혈 양상은 저산소증, 허혈 및 운동 8-10으로 보호 전처리의 다른 형태를 닮은 신경을 유도 것을 제안합니다. 녹화 설정, 광 자극의 파라미터, 및 동물의 상태 - 기록 ERG 신호는 세 세트의 요인에 의해 결정된다.
녹화 설정
전극이 잘못 배치되는 경우 ERG는 진폭이 감소 또는 제조가 불완전 11 접지된다. 주변 전기 장치의 접지 상태가 기록 노이즈를 줄이기 위해 중요하다; 큰 소음은 패러 드를 계속하는 경우님 케이지를 사용할 필요가 있습니다. 정극 확실 ERG 전체 필드 프로토콜을 시작하기 전에 완료 될 때 체크 및 위치 확인과 각막의 중앙에 위치한다. 그것은이 전극 접촉부 만 각막 중요하다; 눈꺼풀에 문의하거나 심지어 수염은 신호 진폭을 줄일 수 있습니다. 느슨한 면사는 양극에 접촉을 방지하기 위해 눈꺼풀이 프로토콜에서 사용되었다. 일부 연구자는 안정적인 접촉 눈꺼풀 접촉 (12)의 방지를 보장하기 위해 포함 된 양극으로 콘택트 렌즈를 개발했다.
빛의 자극 설정
우리가 사용하고 자극은 LED 광원에서 광범위한 스펙트럼 백색광을 제공한다. 다른 광원은 크세논 스트로브 조명 및 할로겐 조명, 빛의 자극 (11) 사이의 비교에 웨이 머스와 Vingrys를 참조로 빛 자극으로 적합하다. LED 조명의 장점은, 그러나,각각의 플래시 및 에너지의 지속 기간은 쉽게 프로그래밍이 빠르게 광 강도의 넓은 범위에서 다시 설정이야. 우리는 임계 값에서 어두운 적응 설치류 범위에서 포화에 (최대 반응을 생산) (방금 검출 응답을 생산) 등급을 매긴 에너지의 섬광, 세트를 개발했다.
시행 착오를함으로써, 우리는 플래시에 대한 응답의 진폭이 같은 강도의 선행 플래시 독립적인지 확인 간격 (ISIS) interstimulus 설립했다. 플래시 밝게, 더 이상 ISI이 독립을 위해 필요합니다.
또한, 시행 착오에 의해 우리는 깨끗한 신호를 제공하도록 각각의 에너지를 요구 응답의 최소 개수를 확립했다. 평균 이상의 응답은 항상 깨끗한 신호를 제공 할 것입니다. 에너지 시리즈는 (우리의 프로토콜 11 분에) 신속하게 완료 할 수 있도록 우리는 최소값을 사용; 빠른 완성은 동종 때문에 마취 상태의 변화에 변화를 감소필요한 경우 다른 변수에 대한 WS 시간을 공부합니다.
동물의 상태
동물의 생리의 여러 매개 변수를 최적화하고 얻은 에르그 녹음을 표준화하는 것이 중요합니다.
온도
전파 신호는 외부 세그먼트 G 단백질 결합 phototransduction 캐스케이드의 빛 - 유도 활성화로부터 생성되고; 이 폭포의 역학은 모든 효소 반응 등, 온도에 따라 13, 14. 마취 설치류 저체온증하는 경향과 기록 걸쳐 37.5 ℃의 코어 온도를 유지하도록 외부 가열을 필요로한다. 체온보다 1-2 ℃로 떨어지면, 파장 및 B- 파의 진폭은 감소하고 그들의 대기 시간이 15을 증가시킨다.
마취
안정 에르그 녹음 움직임으로 동물을 필요로한다. 신경 근육 차단제와 anaesthetIC 에이전트는 의식과 움직임 상태를 달성하기 위해 망막 전위도 실험에 사용됩니다. 만 쥐 16-20에서 깨어 에르그 녹음의 다섯보고가 있었다. 이러한 연구에서, 전극 수술 두개골에 미리 주입하고, 이러한 연구는 두 ERG 17,20에 마취 효과를 시험 하였다.
에르그 녹음에 사용되는 가장 일반적인 마취가 케타민과 자일 라진의 조합이었다 (우리의 실험에서 케타민과 5 mg을 60 ㎎ / ㎏ / 자일 라진 kg을 사용한다). 이 가스 마취 등의 이소 플루 란과 할로 탄보다 망막 전위도 덜 영향을, 높은 회수율 17,21,22으로, 상대적으로 비 독성 입증했다. 이 접근법은 ~ 40 분 동안 움직이지 동물 유지; 절반 량은 비슷한 기간 동안 기록 조건을 확장하기 위해 사용될 수있다. 장에 의한 연구는 직접적으로와 마취없이 망막 전위를 비교 케타민 - 자일 라진이 잴 A-와 B-의 진폭과 대기 시간을 교란 않는 것으로 나타났다파도 (17). 대부분의 연구자들은 마취 조건을 표준화하고 실험적인 매개 변수를 테스트; 마취제의 일부 효과는 완전히 할인 할 수 없습니다.
안구 환경
눈의 생리 기능을 최적화하고 ERG 기록을 표준화, 유지 보수를 필요로한다. 학생들은 표준 크기 여야합니다; 이것은 눈이 최대 팽창을 달성하기 위해, 상품으로서 도포, 동형 달성된다. 설치류, 아트로핀 또는 페닐 (23)를 사용한다. 각막 수화가 기록에 앞서, 카보 머 중합체의인가에 의해 유지된다; 이 또한 양극과 각막 사이의 전기 전도도를 안정화시킨다. 각막 탈수가되면, 각막 반흔 및 백내장 형성 (24)를 발생할 수 있습니다. 백내장은 쥐 25에서 일반적이며, 각막 수화를 유지하는 여러 방법이 수성 유체 또는 일정한 흐름을 포함 마우스 ERG 녹음에 사용 된맞춤 접촉 스타일 전극 각막 표면 (12)에 그 트랩 수화.
망막의 적응 상태
이 주요 변수이다. 상기 제공된 프로토콜은 망막의 가장 민감한 상태로, 어두운 적응되는 것을 보장하도록 설계된다. 이상적으로, 색소 쥐, 완전히 어두운 적응 등의 스프 돌리 쥐와 같은 비 색소 동물, 동안으로 어두운 주택의 3 시간을 필요 5 시간 (26)의 최소 필요합니다. 그것은 암순응 망막 전위도 녹음 12 시간 동안 밤새 동물을 적응하기위한 표준 방법입니다. 광에 부분적 또는 완전한 적응 쉽고 빠르게 Ganzfeld 자극기의 표준 강도 배경 점등에 의해 달성 될 수있다. 빛 적응 한 후, 그러나, 전체 어두운 적응은 달성하기 위해 시간이 걸립니다; 따라서 극단주의의 제안은 눈을 녹음하기 전에 빛에 실수로 노출되지 않도록합니다.
에르그 기록 기술은에 의해 제한된다결정 요인 (즉, 망막 전위도 및 자극 셋업)과 망막 전위도 검사에서 연구자의 능력 이상. 경험이 연구원은 변수 에르그 녹음을 할 가능성이있다. 차이는 시각적 기능의 감소 또는 이득 등 결과를 비교하기 위해 충분히 큰 샘플 크기를 생성함으로써 감소 될 수있다. 또한, 르 녹음은 기본 녹음 및 후 처리 녹음 사이에 정상화 될 수있다. 정규화 된 데이터는 그룹화되고 분석 될 수있다. ERG 데이터를 제시 할 때, 그룹 데이터 대표적인 파형을 표시하는 표준 관행이다.
위의 모든주의 깊게 제어되는 경우, ERG의 진폭은 망막의 기능 상태의 척도이다. ERG 일관 광 손상 또는 변성 27,28 유도 유전자에 의한 감광 층의 고갈에 의해 진폭이 감소된다. 반대로, 이러한 RIP 같은 개입의 보호 효과는 AMPL에서 검출 될 수있다망막 전위도 (29)의 itude. 망막 전위도 망막 8-10,30에 허혈, 저산소 전처리, 운동,식이 사프란의 보호 효과를 입증에 사용되어왔다.
운동 모델링 광 수용체에 phototransduction 알려진 생리 학적 이벤트를 기반으로하지만 로돕신의 phototransduction 캐스케이드의 역학에 대한 지식이 성장하고, 망막의 시냅스 연결, 에르그 세대 모델의 개발, 정교한 ERG 파형 분석을 격려했다하는 것은 가능하다 , 및 내부 망막 회로 (31)에 대한 우리의 이해. 예를 들어, 파장 운동 모델 phototransduction 동안 발생 및 모델을 피팅하는 것은 이러한 피크 응답, 타이밍 및 지연 감도 (14) 모델 파라미터의 비교를 가능하게 생화학 적 단계에 기초한다.
모델의 단점은 망막 circuitr 대한 가정에 의존한다는 것이다Y는만을 가정 할 수만큼 유익 할 수있다. 이러한 단점에 비추어, 파 운동 모델은 최근 파에게 역학 (32)를 지나치게 단순화에 대한 비판을 받아왔다. 감광체 변성 연구에서 ERG 파형 분석은 일반적으로 다른 이유로 수행되지 않는다. 광 수용체의 변성은 시각 기능 결과적으로, 파 및 b 파 매개 변수의 추가 분석이 보증되지 8,9,27,30에서 극적인 손실의 결과로, 종종 심한. 에 관계없이, 파 및 b 파의 ERG 모델링 많은 설치류 연구 및 망막 전위도 모델링에 대한 자세한 내용은 표준 관행으로 채택 된, 파를 들어, B 파 및 OPS는 후드, 검토에 의해 연구에서 찾을 수 있습니다 웨이 머스 및 Vingrys, Frishman 및 Wachtmeister 11,32-34에 의해 기사.
요약하면, 암순응 ERG 방법은 신경 보호와의 간섭없이 S 망막 변성 측정 간의 차이를 기록 할 수 제시원격 허혈 양상으로 UCH. 신뢰성 ERG 녹음 필수적인 요소 기술되었다. 광 수용체 및 내부 망막 기능의 망막 전위도의 측정은 망막의 변성을 공부하는 연구자 및 시각 기능에 다양한 유전자 바이오 의약품 및 약리 개입의 효과에 유용하다.
조나단 스톤 CSCM Pty 주식 회사의 이사
저자는 설치류 모니터링, 처리 및 실험에서 부인 샤론 SPANA의 도움에 감사합니다. 박사 자금 지원은 비전에서 우수 시드니 대학과 호주 연구 센터에 의해 제공되고있다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PC computer | |||
Powerlab, 4 channel acquistion hardware | AD Instruments | PL 35044 | Acquistion of ERG |
Animal Bio Amp | AD Instruments | FE 136 | Amplifier for ERG |
Lab chart | AD Instruments | Signal collection software | |
Ganzfield | Photometric solutions | FS-250A | Light stimulus |
Ganzfield operating system | Photometric solutions | ||
Research Radiometer | International light technologies | ILT-1700 | calibrate light series |
Lux meter | LX-1010B | check red light illumanation | |
Excel | Microsoft | ||
Lead wires | AD Instruments | Connect postive, negative ground electrodes to amplifier | |
Lead wires - alligator | AD Instruments | ground ganzfield and acquistion hardware to computer | |
Platinum wire 95% | A&E metals | postive electrode | |
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet | SDR | E205 | negative electode |
26 G needle | BD | ground electode | |
Water pump | |||
Water bath | |||
Tubing | |||
Homeothermic blanket system with flexible probe | Harvard Appartus | 507222F | |
Atropine 1% w/v | Bausch & Lomb | topical mydriasis | |
Proxmethycaine 0.5% w/v | Bausch & Lomb | topical anaesthetic | |
Visco tears eye drops | Novartis | carbomer polymer | |
Thread | retract eye lid | ||
Tweezers | |||
Reusable adhesive | Blu tac | Dim red headlamp. Affix electrodes | |
Absorbent bedding | |||
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml | Troy Laboratories Pty Ltd | dissociative | |
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml | Troy Laboratories Pty Ltd | muscle relaxant | |
Scale |
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