짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

이 논문은 자기 조립의 자연 프로세스에 의해 주문한 높은 펩타이드 기반 구조의 형성을 설명합니다. 이 방법은 시판 펩티드 및 일반적인 실험실 장비를 이용한다. 이 기술은 펩티드의 큰 다양성에 적용 할 수 있으며, 새로운 펩티드 어셈블리의 발견으로 이어질 수있다.

자연에서, 복잡한 기능적 구조는 온화한 조건 하에서 생체 분자의 자기 조립에 의해 형성된다. 자기 조립을 제어하는 힘을 이해하고 체외에서이 과정을 흉내 낸 것은 재료 과학 및 나노 기술 분야에서 큰 진보를 가져올 것입니다. 그들은 상당한 다양성을 선물로서 사용할 생물학적 빌딩 블록들, 펩티드는 대규모에서의 합성이 간단, 여러 가지 장점을 가지고, 그들이 쉽게 생물학적 및 화학적 실체 ^1,2로 변형 될 수있다. 이러한 환상 펩티드, amphiphile 펩타이드 및 펩타이드 복합체 용액에 주문 구조로 자기 조립으로 설계 펩티드의 여러 클래스. Homoaromatic 디 펩티드는, 예컨대 나노 튜브, 분야와 브릴 ^3-8으로 주문할 구조를 형성하는 데 필요한 모든 정보를 포함하는 분자 짧은 자기 조립 펩티드의 클래스이다. 이 펩티드의 큰 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 9 여기에 제시된 프로토콜은 잠재적으로 수 펩티드 또는 생물학적 빌딩 블록의 다른 클래스에 적응 될 수 있고 새로운 펩타이드 기반 구조의 발견과 그 어셈블리의 더 나은 제어로 이어집니다.

자연 형태의 생체 분자 자기 조립의 과정에서 구조를 주문하고 기능. 이 자연 과정을 지배하는 힘을 이해하는 것은 체외에서 자기 조립을 모방 결과적으로 재료 과학 ^{10, 11의} 지역의 주요 진보 할 수있는 능력으로 이어질 수 있습니다. 펩티드는, 구체적으로, 그들은 큰 구조의 다양성, 화학 합성의 용이성을 제공하기 때문에, 생명 빌딩 블록으로 큰 약속을 잡고, 쉽게 생물학적 및 화학적 실체로 작용 될 수있다. 펩티드 자기 조립의 필드는 Ghadiri 및 D-및 L-아미노산 ^(12)을 교대로 환형 펩타이드 의해 펩타이드 나노 튜브의 자기 조립을 증명 그의 동료에 의해 ​​개척되었다. 펩타이드 어셈블리의 디자인에 다른 성공적인 접근 방식은 선형 bolaamphiphile 펩티드 ^5, 양친 (AP) ^6, 비공 자체 보완 이온 펩타이드 ^13, 계면 활성제와 같은 펩타이드를 포함 ^{4,14, 및 디 블록은 15 copolypeptides.}

보다 최근의 접근 방식은 짧은 방향족 펩티드의 자기 조립을 수반 homoaromatic 디 펩티드를 칭했다. 이 펩티드는 방향족 특성 (예를 들면의 Phe-Phe가, t-부틸 디 카보네이트 (BOC)의 Phe-Phe가) ^7,8,16-21와 두 개의 아미노산을 포함한다. 이러한 homoaromatic 펩타이드에 의해 형성되는 구조는 관 구조, 분야, 시트와 같은 어셈블리 및 섬유 ^{6,8,15,21-32 있습니다.} 일부 경우에서 섬유는 하이드로 겔 ^33-37을 산출 브릴 메시를 생성한다. 이러한 어셈블리는 바이오 센서, 약물 전달, 분자 전자 공학 등의 응용 프로그램에 대한 악용되었다. ^38-45

이 논문은 homoaromatic 펩티드의 자발적인 자기 조립을 시작하기 위해 필요한 실험 단계에 대해 설명합니다. 또, coassembly 펩티드의 과정을 제시한다. 이 프로세스는 펩티드의 하나 이상의 유형의 자기 조립을 포함모노머.

diphenylalanine 펩티드 (NH _2의 Phe-Phe가-COOH)와 BOC는 아날로그 보호 (BOC-반페 - 반페-OH) : 우리의 데모는 두 개의 상업적으로 이용 가능한 펩티드의 coassembly이 포함되어 있습니다. supermolecular 구조로 펩타이드의 자기 조립의 각 : 어느 분야 나 섬유에 diphenylalanine 펩타이드 형태의 관 어셈블리 및 BOC-의 Phe-Phe가-OH 펩타이드 자기 조립 용매 ^7,17,46에 따라. 우리는 일정한 비율로 두 개의 펩티드를 혼합 및 전자 현미경, 현미경 및 FT-IR 분광법에 의해 생성 된 어셈블리를 특징으로한다. 방법은 수백 나노 미터의 직경을 갖는 기다란 조립체에 의해 연결되는 여러 미크론의 직경 (1-4 μM)와 구형 요소 (300-800 ~ NM)로 구성된다 펩티드 구조의 형성을 증명 . 구형 구조에 스레드 것 같습니다으로 어셈블리는, 자신의 형태에 의하여 구슬로 장식 된 문자열과 유사연장 된 어셈블리. 따라서 우리는 이러한 어셈블리 "생명 목걸이"라고. "생명의 목걸이는"약물 전달 에이전트 또는 전자 애플리케이션을위한 발판으로, 새로운 생체​​ 재료의 역할을 할 수도 있습니다. 또한, 펩티드의 자기 조립에 이르게 절차 펩티드 및 생체 분자의 다른 클래스로 이용 될 수있다. 그것은 자기 조립과 새로운 주문 구조의 형성에 관여하는 힘의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.

1. Homoaromatic 디 펩티드의 자기 조립

1. 해당 동결 건조 된 형태 (예, _NH-2의 Phe-Phe가-OH,-BOC의 Phe-Phe가-COOH)에서 원하는 펩타이드를 달아 1,1,1,3,3,3 - 헥사 펩티드에 용해시켜 스톡 용액을 준비 - 2 - 프로판올 ^7,17,46 (NH _2의 Phe-Phe가-OH 및 BOC-반페 - 반페-COOH 예 : 100 ㎎ / ㎖) 적절한 농도 (HFP).
2. 펩타이드가 완전히 용해 액이 (몇 분) 분명해 보인다 때까지 벤치에 소용돌이와 장소를 사용하여 솔루션을 섞는다.
3. 적절한 농도 (나노 튜브의 형성에 트리플 증류수 NH _2의 Phe-Phe가-OH (TDW)의 예 2 ㎎ / ㎖로, 적당한 용매, 펩티드 원액을 희석; 펩티드의 2 μl를 첨가함으로써 98 μL TDW, 구형 구조의 형성을위한 에탄올 BOC-반페 - 반페-COOH의 5 ㎎ / ㎖)에 원액.
4. 24 대한 RT에서 용액을 유지시간.
5. 어떤 사전 집계를 피하기 위해, 각 실험을위한 신선한 원액을 준비한다.

2. 두 Homoaromatic 디 펩티드의 Coassembly

1. TDW과 무수 에탄올 같은 부피를 혼합하여 50 % 에탄올 용액을 제조. 두 용액을 혼합하는 소용돌이를 사용합니다.
2. NH _2의 Phe-Phe가-OH 펩타이드 및 BOC-의 Phe-Phe가-OH 펩타이드의 1 MG의 2 밀리그램 무게. 100 ㎎ / ㎖의 농도로 HFP 각 펩티드를 용해.
3. 소용돌이를 사용하여 펩티드 원액을 혼합 및 펩티드가 완전히 용해 및 솔루션을 분명히 보일 때까지 벤치에 배치합니다.
4. 펩티드에게 원하는 비율 원액을 혼합. 이 특정 실험에서 (각각 5:3 최종 비율) BOC-의 Phe-Phe가-OH 펩타이드의 6 μL와 NH _2의 Phe-Phe가-OH 펩타이드의 10 μl를 혼합. 인해 HFP 용매의 높은 휘발성으로, 그것은 (이것은 스톡 용액을 다량 준비하는 추천 레아에서세인트 10 μL).
5. 혼합 펩티드 원액을 혼합하는 소용돌이를 사용합니다.
6. 원하는 최종 농도 50 % 에탄올을 혼합 펩티드 원액을 희석. 이러한 특정 실험에서, 각각 BOC-의 Phe-Phe가-OH에 대한 NH _2의 Phe-Phe가-OH 및 3 ㎎ / ㎖에 대한 5 mg / ml의 최종 농도를 얻기 위해, 혼합 된 펩티드 원액의 13 μL를 추가 50 % 에탄올 용액 92 μL에. 부드럽게 솔루션을 혼합 피펫을 사용합니다.
7. 24 시간 동안 실온에서 용액을 유지한다.
8. 이 때문에, 용매의 휘발성이 높은 특성으로 실험 펩티드의 농도의 작은 변화에 민감 주목해야한다. 따라서, 신선한 주식 솔루션은 각 실험에 대한 준비를해야합니다.

3. 주사 전자 현미경 (SEM)을 이용하여 자기 조립 된 구조물의 특성화

1. 배양 24 시간 후, 유리 코브 펩타이드 용액 10 ㎕의 방울을 적용RT에서 R 슬립 건조.
2. 외투 90 초 동안 스퍼터 코터를 이용하여 금의 박막 (몇 나노 미터)를 가진 유리 샘플.
3. 이미지 SEM은 10 ~ 20 kV의에서 작동하여 어셈블리.

4. 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용하여 자기 조립 구조의 특성

1. 탄소 덮여 및 폴리머 필름의 지원에 의해 안정화 200 메쉬 구리 그리드에 펩티드 용액을 10 ㎕의 드롭 놓습니다.
2. 1 분 후 여과지를 사용하여 여분의 액체를 제거합니다.
3. TDW의 2 % 우라 닐 아세테이트의 솔루션을 준비합니다. 0.22 μm의 필터 장치를 이용하여 용액을 고를.
4. 샘플 (음 염색) 염색하기, 그리드에 10 μL의 우라 닐 아세테이트 용액 한 방울을 배치합니다.
5. 30 초 후 종이 필터를 사용하여 여분의 액체를 제거합니다. 그것은 부정 얼룩이 화상의 콘트라스트를 개선하지만, 모든 경우에 필수적이지는 것을 주목해야한다.
6. 이미지 일에 샘플120 kV의에서 작동 TEM에 의한 전자 격자입니다.

5. 원자 힘 현미경 (AFM)에 의한 어셈블리의 3 차원 특성

1. 3.1 절에 설명 된 절차를 사용하여 AFM 분석을 위해 샘플을 준비한다.
2. AC 모드에서 작업 AFM 악기를 사용하여 유리에 샘플을 분석합니다. 3 N / m의 스프링 상수와 75 kHz의 공진 주파수와 실리콘 캔틸레버를 사용합니다.
3. 원하는 구조를 찾기 위해, 격자의 큰 영역을 스캐닝함으로써 시작. 그런 다음 특정 작은 영역에 집중하고 (스캔 크기는 이미지의 X 2.5 μm의 2.5 ㎛,이 원고에 포함)를 검사합니다.

6. FT-IR에 의한 이차 구조의 특성

1. _CaF2를 창으로 펩티드 용액을 30 ㎕의 드롭을 적용합니다.
2. 이 솔루션은 실온에서 건조하도록 허용합니다.
3. IR 스펙트럼에서 물의 흡착 1,650센티미터에 ^-1입니다.이 피크는 펩티드 결합의 아미드 I 밴드의 중심에있다. 또한, 펩타이드 및 단백질 ^47의 α-나선 구조의 전형적인 피크이다. 이 문제를 극복하고 물 신호를 피하기 위하여, 수소 - 투 - 중수소 교환이 수행되어야한다. 건조 된 펩타이드 샘플에 중수 한 방울 (D ₂ O)을 놓습니다. 드롭은 완전히 창에서 펩타이드 보증금을 충당 할 수있을만큼 충분히 커야합니다.
4. 샘플은 진공 상태에서 건조하도록 허용합니다.
5. 반복 최대 수소를 중수소 교환을 보장하기 위해 6.3 및 6.4 배 단계를 반복합니다. 그 분석까지 진공에서 샘플을 저장합니다.
6. 중수 소화 triglycine 황산 (DTGS) 검출기를 사용하여 FT-IR 스펙트럼을 기록합니다. FT-IR 시스템은 샘플의 환경에서 습도를 방지하기 위하여, 퍼지 가스 발생기를 포함한다. 짧은 펩티드의 샘플의 경우, ^4cm-1의 해상도로 샘플 2,000 X를 스캔하는 것이 가장 좋습니다. 최소 투과율 값은 그렇게함으로써 결정될 수있다ftware 악기와 함께 제공.

이 논문은 펩티드의 자기 조립에 의하여 나노 및 마이크로 스케일에서 정렬 구조의 형성 방법을 설명한다. 우리는 선물이 간단한 과정을 설명하고 두 가지 간단한 방향족 펩티드의 coassembly (그림 1)의 특성을하기 위해. 펩타이드 중 하나는 나노 미터 크기 ⁷ 빈 관 구조로 수용액에 자기 조립 수있는 NH _2의 Phe-Phe가-OH (diphenylalanine) 펩타이드이다. 다른 펩타이드는 BOC 보호 아날로그, BOC-의 Phe-Phe가-OH이다. 이 펩티드는 에탄올 ^17,46의 수용액 구형 어셈블리 섬유의 구조를 형성 할 수있다. 우리는이 펩티드가 언급 한 두 가지 요소를 결합하는 구조로 coassemble 것이라고 가정한다. SEM 분석을 사용하여, 우리는 혼합 된 펩티드 몇 hundr의 직경을 가진 가늘고 긴 구조로 연결된 수 미크론의 직경을 가진 구형 어셈블리의 구조를 형성하는 것이 밝혀에드 나노 미터 (그림 2). 때문에 구슬로 장식 된 문자열 형태의 높은 유사성, 우리는 이러한 구조 "분자 목걸이"라고. 이러한 구조의 AFM 분석 깨끗이 그들의 입체 배열 (도 3)를 보여 주었다. 또한, 다양한 샘플 다른 지역의 SEM 분석은이 과정은 높은 수율 (그림 2b)에 발생한 것으로 나타났다.

FT-IR 분석은 펩티드 어셈블리의 2 차 구조에 관한 정보를 제공 하였다. 펩티드 BOC-의 Phe-Phe가-OH (5 ㎎ / ㎖ 50 % 에탄올)에 의해 형성된 구형 어셈블리의 아미드 I 밴드의 흡광도 스펙트럼 α 나선 형태를 나타내는 1천6백57cm ^-1에서 단일 아미드 I 피크를 보여 주었다. NH _2의 Phe-Phe가-OH 펩티드 (2 ㎎ / ㎖, 50 % 에탄올)에 의해 형성된 튜브형 구조는 두 개의 독특한 봉우리, 1천6백82센티미터에서 1,613cm 하나 ^-1과 다른 ^-1 보여 주었다. 이 봉우리는 위트의 상관 관계 하 β-시트 이차 구조. 1,653cm ^-1 α 헬릭스 구조와 다른 피크에 대응에 하나의 피크 : 2 개 피크를 구성 등이 펩티드 coassembly 의해 형성된 생체 분자 목걸이의 FT-IR 스펙트럼은, 각각의 펩타이드에 대한 할당 달랐다 1,684cm ^-1 β-턴 형태 (그림 4) ^(48)에 관한시. 다양한 스펙트럼의 차이는 생명 목걸이 대한 독특한 구조를 나타낸다.

그림 1. 펩티드 NH _2의 Phe-Phe가-OH 및 BOC-반페 - 반페-OH. coassembly 과정의 개략도의 Coassembly.

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그림 2. 분자 목걸이의 전자 현미경 분석, A) 및 B) SEM 현미경, C) TEM 현미경 사진.

그림 3. 분자 목걸이의 3 차원의 AFM 이미지.

그림 4. 다른 자기 조립 구조의 FT-IR 분석. BOC-반페 - 반페-OH (적색), 관상 구조 F에 의해 형성되는 분야의 샘플에서 얻은 FT-IR 스펙트럼NH _2의 Phe-Phe가-OH (녹색), (보라색)이 두 펩티드의 coassembly에 의해 형성되는 분자 목걸이로 ormed.

요약하면, 본 논문은 펩타이드 기반 어셈블리를 체외에서 형성 될 수있는 용이성을 보여줍니다. 프로세스는 시판 펩티드 및 용매를 포함하고,이 시험관에 극성 용매의 첨가시, 주위 조건하에 자발적으로 일어난다. 이 때문에, 다른 유기 용매에 펩티드의 낮은 용해도 때문에, 펩티드의 용매로서 HFP를 사용하는 것이 중요하다. 또, 인해 HFP의 높은 변동성으로는 각 실험을위한 신선한 원액을 준비하는 것이 필요하다. 또한, 스톡 용액의 부피는 10 μL 이상과 극성 용매 (물)에 용해 된 펩타이드의 전사 빠르게 수행되어야 할 것이다.

이것은 펩티드의 용 매화 및 자기 조립을위한이 방법은 일반적으로 이러한 방향족 펩티드에 사용 가능한 하나의 접근 방법이라는 것을 주목해야한다. 다른 방법은, 그러나, 가능하다. 또, 재고 한 solut의 농도 HFP에있는 펩티드의 이온은 최종 용액 HFP의 농도를 최소화하기 위해 이러한 실험 높다.

이 원고는 또한 AFM, TEM, SEM 및 FT-IR 등의 펩타이드 기반 구조의 특성에 대한 주요 기술을 제공합니다. 현미경 기술을 사용하여 그것이 어셈블리의 모폴로지에 대한 정보를 얻는 것이 가능하다. 이러한 어셈블리의 치수는 수백 나노 미터에서 수 마이크론의 범위 때문에, 그들의 특성에 대한 표준 전자 현미경을 사용하는 것으로 충분하다. 초 고해상도 현미경은 100보다 작은 직경 nm의 경우 전도성 코팅 (예를 들면 금)없이 이미지가 필요할 수 있습니다 구조에 유용 할 것입니다. 어떤 경우에는, 전자 현미경의 전자선에 의한 구조의 충전 구조의 유기 성질로 인해 발생할 수있다. 이는 운영 체제의 전압을 낮춤으로써 해결 될 수있다.

종합적으로, 펩티드의 자기 조립을 위해 여기에 제시된 방법은 펩티드의 다른 클래스에 적용 할 수 있고, 공정 중에 힘과의 상호 작용의 이해로 이어질 수있다. 또, 또한 새로운 생체​​ 분자 어셈블리의 형성을 초래할 수있다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 작품은 마리 퀴리 국제 재 통합 그랜트와 독일 - 이스라엘 재단에 의해 지원되었다. 우리는 AFM 분석을 위해 씨의 Yair Razvag을 인정합니다.