היווצרות של מבני Biomolecular הוזמנו על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים קצרים

מאמר זה מתאר את היווצרותם של מבנים מבוססי פפטיד הורה מאוד על ידי התהליך הספונטני של הרכבה עצמית. השיטה מנצלת פפטידים זמינים מסחרי וציוד מעבדה משותפת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של פפטידים ועשויה להוביל לגילוי של מכלולים המבוסס על פפטיד חדשים.

בטבע, מבנים פונקציונליים מורכבים נוצרים על ידי ההרכבה העצמית של ביומולקולות בתנאים קלים. הבנת הכוחות השולטים בהרכבה עצמית ומחק את התהליך הזה במבחנה תביא להתקדמות גדולה בתחומי מדע וננוטכנולוגיה חומרים. בין אבני הבניין ביולוגי זמין, יש לי פפטידים מספר יתרונות כפי שהם מציגים גיוון משמעותי, הסינתזה שלהם בקנה מידה גדולה היא פשוטה, והם יכולים בקלות להיות שונה עם גורמים ביולוגיים וכימיים ^1,2. כמה כיתות של פפטידים נועדו כגון פפטידים מחזוריים, פפטידים amphiphile ופפטיד conjugates עצמי להרכיב לתוך מבנים מסודרים בתמיסה. dipeptides Homoaromatic, הוא קבוצה של פפטידים עצמי התאספו קצרים המכילים את כל המידע המולקולרי הנחוץ ליצירת מבנים מסודרים כגון צינורות, כדורים וסיבים ^3-8. מגוון גדול של פפטידים אלה הוא זמין באופן מסחרי.

class = "jove_content"> מאמר זה מציג הליך שמוביל להיווצרות של מבנים מסודרים על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים homoaromatic. הפרוטוקול דורש רק חומרים כימיים מסחריים וציוד מעבדה בסיסי. בנוסף, העיתון מתאר חלק מהשיטות הזמינות לאפיון של מכלולים המבוסס על פפטיד. שיטות אלה כוללות אלקטרונים ומיקרוסקופ כוח אטומי ופורות-Transform אינפרא אדום ספקטרוסקופיה (FT-IR). יתר על כן, את כתב היד מדגימה את המיזוג של פפטידים (coassembly) והיווצרות של "חרוזים על חוט" מבנה דמוי על ידי תהליך זה. ⁹ הפרוטוקולים שהוצגו כאן ניתן להתאים לסוגים אחרים של פפטידים או אבני בניין ביולוגי ויכולים באופן פוטנציאלי להוביל לגילוי של מבנים מבוססי הפפטיד חדשים ולשליטה טובה יותר של ההרכבה שלהם.

צורות טבע מסודרות ופונקציונליות מבנים על ידי התהליך של הרכבה עצמית biomolecular. הבנת הכוחות ששולטים בתהליך ספונטני זה עלולה להוביל ליכולת לחקות הרכבה עצמית במבחנה וכתוצאה מכך להתקדמות גדולה בתחום מדעי חומר ^10,11. פפטידים, במיוחד, לקיים הבטחה גדולה כאבן בניין biomolecular, מאחר שהם מציגים מגוון מבני גדול, קלות של סינתזה כימית, והוא יכול בקלות להיות פונקציונליות עם ישויות ביולוגיות וכימיות. תחום ההרכבה עצמית פפטיד היה חלוץ ידי Ghadiri ועמיתיו, שהוכיחו את ההרכבה העצמית של צינורות פפטיד על ידי פפטידים מחזוריים לסירוגין עם D ו-חומצות אמינו ^L-12. גישות אחרות מוצלחות לעיצוב של מכלולי פפטיד כוללות פפטידים יניארי bolaamphiphile ^5, amphiphiles (AP) ^6, פפטידים עצמי משלים nonconjugated יוניים ^13, פפטידים כמו פעילי שטח- ^{4,14, וdiblock copolypeptides 15.}

גישה מאוחרת יותר כרוכה בהרכבה העצמית של פפטידים ארומטיים קצרים, כינה dipeptides homoaromatic. פפטידים אלה מהווים חומצות אמינו רק שתי עם טבע ארומטי (למשל Phe-Phe, dicarbonate טרט בוטיל (BOC)-Phe-Phe) ^7,8,16-21. המבנים שהוקמו על ידי פפטידים homoaromatic אלה כוללים מבנים צינוריים, כדורים, מכלולים כמו גיליונות וסיבי ^{6,8,15,21-32.} הסיבים ובמקרים מסוימים ליצור רשת סיבית כי תשואות הידרוג'ל ^33-37. מכלולים אלה נוצלו עבור יישומים של biosensing, אספקת סמים, אלקטרוניקה מולקולרית, וכו '. ^38-45

מאמר זה מתאר את שלבי הניסוי דרושים על מנת להתחיל את ההרכבה העצמית הספונטנית של פפטידים homoaromatic. בנוסף, הוא מציג התהליך של פפטיד coassembly. תהליך זה כרוך בהרכבה העצמית של יותר מסוג אחד של פפטידמונומר.

ההפגנה שלנו כוללת coassembly של שני פפטידים זמינים מסחרי: פפטיד diphenylalanine (NH _{2-Phe-Phe-COOH)} ו בוק המוגן אנלוגי (BOC-Phe-Phe-OH). כל אחד מהפפטידים העצמיים מרכיב לתוך מבנה supermolecular: צורות פפטיד diphenylalanine מכלולי צינורי ועצמי מרכיב פפטיד BOC-Phe-Phe-OH לשני תחומים או סיבים בהתאם ^ל7,17,46 הממס. אנחנו מעורבב שני פפטידים ביחסים מסוימים ומאופיינות המכלולים הביאו על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, כוח מיקרוסקופיה וספקטרוסקופיית FT-IR. השיטות הוכיחו את היווצרות של מבנה המבוסס על פפטיד שמורכב מאלמנטים כדוריים בקוטר של כמה מיקרונים (1-4 מיקרומטר) שמחוברים על ידי אסיפות מוארכות בקוטר של כמה מאה ננומטרים (ננומטר ~ 300-800) . המכלולים דומים למחרוזות חרוזים במורפולוגיה שלהם, כמו המבנים כדוריים נראים שהושחלו עלמכלולים מוארכים. לפיכך, אנו מכונים המכלולים האלה "שרשרות biomolecular". "שרשרות biomolecular" עשויות לשמש כחומר ביולוגי חדש, כסוכן משלוח סמים או כפיגום ליישומים אלקטרוניים. יתר על כן, ההליך שמוביל להרכבה העצמית של פפטידים עשוי להיות מנוצל עם כיתות אחרות של פפטידים וביומולקולות. זה עלול להוביל להבנה טובה יותר של הכוחות מעורבים בהרכבה עצמית והיווצרות מבנים מסודרים חדשים.

1. הרכבה עצמית של Dipeptides Homoaromatic

1. לשקול את הפפטיד הרצוי בצורתו lyophilized (למשל NH _{2-Phe-Phe-OH,} BOC-Phe-Phe-COOH) ולהכין פתרון מניות על ידי המסת פפטיד ב1,1,1,3,3,3-hexafluoro -2-propanol (HFP) לריכוז המתאים (למשל 100 מ"ג / מיליליטר לNH _2-Phe-Phe-OH וBOC-Phe-Phe-COOH) ^7,17,46.
2. מערבבים את הפתרון באמצעות מערבולת ומקום על הספסל עד פפטיד הוא נמס לגמרי והפתרון נראה ברור (כמה דקות).
3. לדלל את פתרון מניות פפטיד, בממס מתאים, לריכוז המתאים (לדוגמא: 2 מ"ג / מיליליטר של NH _2-Phe-Phe-OH במים מזוקקים משולשים (TDW) להיווצרות של צינורות; על ידי הוספת 2 μl של הפפטיד פתרון מניות ל98 TDW μl, 5 מ"ג / מיליליטר של BOC-Phe-Phe-COOH באתנול להיווצרות של מבנים כדוריים).
4. שמור את הפתרון בRT ל24שעות.
5. על מנת להימנע מכל preaggregation, להכין פתרונות מניות טריים עבור כל ניסוי.

2. Coassembly של שתי Homoaromatic Dipeptides

1. הכן פתרון של 50% אתנול על ידי ערבוב כמויות שווה של TDW ואתנול מוחלט. השתמש מערבולת לערבב שני פתרונות.
2. שוקל 2 מ"ג של פפטיד NH _2-Phe-Phe-OH ו1 מ"ג של פפטיד BOC-Phe-Phe-OH. ממיסים כל פפטיד בHFP לריכוז של 100 מ"ג / מיליליטר.
3. מערבבים את פתרונות מניות פפטידים באמצעות מערבולת ומניח אותם על הספסל עד שפפטידים נמסו לגמרי ואת הפתרונות שנראים ברורים.
4. ערבב פפטידים פתרונות מניות ליחס הרצוי. בניסוי הספציפי הזה למזג 10 μl של הפפטיד NH _2-Phe-Phe-OH עם 6 μl של הפפטיד BOC-Phe-Phe-OH (ליחס סופי של 5:03 בהתאמה). בשל התנודתיות הגבוהה של ממס HFP, מומלץ להכין כמות גדולה של מניות פתרון זה (בלאהst 10 μl).
5. השתמש מערבולת לערבב פתרון מניות פפטידים קבלת תערובת האחידים.
6. לדלל את פתרון מניות פפטידים מעורבב עם אתנול 50% לריכוז הסופי הרצוי. בניסוי הספציפי הזה, על מנת לקבל ריכוז סופי של 5 מ"ג / מיליליטר לNH _2-Phe-Phe-OH ו 3 מ"ג / מיליליטר לבוק-Phe-Phe-OH בהתאמה, להוסיף 8 μl של פתרון מניות פפטידים מעורבב ל92 μl של פתרון אתנול 50%. השתמש פיפטה לערבב את הפתרון בעדינות.
7. שמור את הפתרון בRT ל24 שעות.
8. יש לציין כי בשל האופי ההפכפך מאוד של הממס, הניסויים רגישים לשינויים קטנים בריכוז של פפטידים. לכן, פתרונות מניות טריים צריכים להיות מוכנים לכל ניסוי.

3. אפיון של מבנים העצמי מורכב באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM)

1. לאחר 24 שעות של דגירה, תחול ירידת 10 μl של פתרון פפטידים על מפרצון זכוכיתתלוש r ויבש ב RT.
2. מעיל המדגם על הזכוכית בשכבה דקה של זהב (ננומטרים ספורים) באמצעות coater גמגום ל90 שניות.
3. תמונת המכלולים באמצעות SEM הפועל ב10-20 ק.

4. אפיון של מבנים העצמי מורכב באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM)

1. מניחים ירידת 10 μl של פתרון פפטידים על רשת נחושת 200 רשת מכוסות בהפחם והתייצבה על ידי תמיכת סרט פולימר.
2. לאחר 1 דקות להסיר את הנוזלים העודפים באמצעות נייר סינון.
3. הכן פתרון של 2% אצטט uranyl בTDW. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר.
4. כדי להכתים את המדגם (מכתים שלילי), במקום ירידה של 10 פתרון אצטט uranyl μl על הרשת.
5. לאחר 30 שניות להסיר את הנוזלים עודפים באמצעות נייר סינון. יש לציין כי למרות שמכתים שלילי משפר את החדות של התמונות, זה לא הכרחי בכל המקרים.
6. תמונת המדגם על הרשת דואר על ידי TEM פועלת ב120 KV.

5. אפיון תלת ממדי של הרכבות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)

1. הכן מדגם לניתוח AFM באמצעות ההליך המתואר בסעיף 3.1.
2. לנתח את המדגם על הזכוכית באמצעות מכשיר AFM עובד במצב AC. השתמש בזיזי סיליקון עם קבוע קפיץ של 3 N / m ותדר תהודה של 75 קילוהרץ.
3. התחל על ידי סריקת שטח גדול של הרשת, במטרה למצוא את המבנה הרצוי. לאחר מכן להתמקד באזור מסוים קטן יותר ולסרוק אותו (גודל הסריקה היה 2.5 מיקרומטר x 2.5 מיקרומטר עבור התמונה שנכלל בכתב היד הזה).

6. אפיון המבנה המשני על ידי FT-IR

1. החל ירידת 30 μl של פתרון פפטידים לחלון בית הקפה _2.
2. אפשר הפתרון לייבוש ב RT.
3. ספיחת מים בספקטרום IR היא ב1,650 ^-1 סנטימטר.שיא זה הוא במרכז אמיד שהלהקה של אג"ח פפטיד. זהו גם שיא אופייני למבני α-סליל של פפטידים וחלבונים ^47. על מנת להתגבר על בעיה זו ולמנוע את האות של מים, יש לבצע חילופי מימן לדאוטריום. מניחים ירידה של תחמוצת דאוטריום (D ₂ O) על מדגם פפטיד המיובש. הירידה צריכה להיות גדולה מספיק כדי לכסות את הפקדת פפטיד על החלון לחלוטין.
4. לאפשר המדגם לייבוש תחת ואקום.
5. חזור על שלבים 6.3 ו6.4 2x כדי להבטיח תמורת המימן לדאוטריום מקסימלי. שמור את הדגימה תחת ואקום עד לניתוח שלה.
6. רשום את ספקטרום FT-IR באמצעות סולפט triglycine deuterated גלאי (DTGS). מערכת FT-IR כוללת מחולל גז טיהור, כדי למנוע לחות בסביבה של המדגם. לקבלת דוגמיות של פפטידים קצרים, עדיף לסרוק המדגם 2,000 x ברזולוציה של 4 ^-1 סנטימטר. הערכים מינימאלי העברה יכולים להיקבע על ידי כךftware שסופק עם המכשיר.

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת מבנים מסודרים על ננו ומיקרומטר בקנה מידה על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים. כדי להדגים תהליך פשוט זה אנו מציגים ולאפיין coassembly של שני פפטידים ריחניים פשוטים (איור 1). אחד מהפפטידים הוא פפטיד _2-Phe-Phe-OH (diphenylalanine) NH, אשר יכול עצמי להרכיב בתמיסה מימית לתוך מבנים צינורי חלולים עם ממדים ננומטריים ^7. פפטיד האחר הוא האנלוגי שלה בוק מוגן, BOC-Phe-Phe-OH. פפטיד זה יכול ליצור מבנים סיבי בתמיסות מימיות והרכבות כדוריות ^ב17,46 אתנול. הנחנו כי הפפטידים האלה היינו coassemble לתוך מבנה שמשלב שני האלמנטים שהוזכרו. באמצעות ניתוח SEM, אנחנו גילו כי פפטידים מעורבב נוצרו ארכיטקטורה של מכלולים כדוריים בקוטר של כמה מיקרונים מחוברים על ידי מבנים מוארכים בקוטר של כמה hundrננומטרים ed (איור 2). בשל גבוה הדמיון במורפולוגיה למחרוזות חרוזים, אנו כינו את המבנים האלה "שרשרות מולקולריות". ניתוח AFM של מבנים אלה בבירור ההסדר תלת ממדים שלהם (איור 3). בנוסף, ניתוח SEM של אזורים השונים של דגימות שונות מצביע על כך שתהליך זה התרחש עם תשואה גבוהה (איור 2b).

ניתוח FT-IR סיפק מידע על המבנה המשני של מכלולי פפטידים. ספקטרום הספיגה של האמידה הלהקה של המכלולים כדוריים שהוקמו על ידי פפטיד BOC-Phe-Phe-OH (5 מ"ג / מיליליטר, אתנול 50%) הראה אמיד אני שיא יחיד ב1,657 ^-1 סנטימטר המצביע על קונפורמציה סליל α. המבנים צינורי שהוקמו על ידי פפטיד NH _2-Phe-Phe-OH (2 מ"ג / מיליליטר, אתנול 50%) הראו שני שיאים ייחודיים, אחד ב1,613 ^-1 סנטימטר והשני ב1,682 ^-1 סנטימטר. פסגות אלה מתואמים שנינות חה β גיליון מבנה משני. ספקטרום FT-IR של שרשרות biomolecular, שהוקמו על ידי coassembly של שני פפטידים, שונה מהמשימה לכל פפטיד בודד כפי שהוא כלל שתי פסגות: שיא אחד ב1,653 ^-1 סנטימטר שמתכתב עם מבנה סליל α ושיא נוסף ב1,684 ^-1 סנטימטר המתייחס לקונפורמציה β-תורו (איור 4) ^48. ההבדל בין הספקטרום השונים מצביע על מבנה ייחודי לשרשרות biomolecular.

איור 1. Coassembly של פפטידים NH _2-Phe-Phe-OH וBOC-Phe-Phe-OH. איור סכמטי של תהליך coassembly.

ב" עבור: src = "" /> / "= src" / files/ftp_upload/50946/50946fig2.jpg files/ftp_upload/50946/50946fig2highres.jpg
איור 2. ניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים של השרשראות מולקולריות; מיקרוסקופ TEM ג);) ו-B) micrographs SEM.

איור 3. תמונה תלת ממדית AFM טופוגרפיה של השרשראות מולקולריות.

איור 4. ניתוח FT-IR של מבנים עצמי התאספו השונים. ספקטרום FT-IR המתקבל מהמדגם של הספירות שהוקמו על ידי BOC-Phe-Phe-OH (אדום), ו מבנים צינורייםormed ידי NH _2-Phe-Phe-OH (ירוקה) והשרשרות מולקולריות שהוקמו על ידי coassembly של שני פפטידים אלה (סגולים).

לסיכום, מאמר זה מדגים את הקלות שבה יכולים להיווצר מכלולים מבוססי פפטיד במבחנה. התהליך כרוך פפטידים וממסים זמינים מסחרי, והיא מתרחשת באופן ספונטני בתנאי סביבה, על התוספת של ממס קוטבי למבחנה. זה חיוני כדי להשתמש HFP כממס של פפטידים, בשל המסיסות הנמוכה של פפטידים בממסים אורגניים אחרים. כמו כן, בשל התנודתיות הגבוהה של HFP יש צורך להכין פתרון מניות טרי עבור כל ניסוי. יתר על כן, את עוצמת הקול של פתרון המניות צריכה להיות גבוה יותר מאשר 10 μl וההעברה של הפפטיד מומס לתוך הממס הקוטבי (מים) צריך להיעשות במהירות.

יש לציין כי שיטה זו לsolvation והרכבה עצמית של פפטיד היא גישה אפשרית אחת, משמשת בדרך כלל לפפטידים ארומטיים אלה. גישות אחרות, לעומת זאת, הן אפשריות. בנוסף, הריכוז של המניות solut יון של הפפטיד בHFP הוא גבוה בניסויים אלה כדי למזער את הריכוז של HFP בפתרון הסופי.

כתב יד זה גם מציג כמה הטכניקות העיקריות לאפיון של מבנים הפפטיד מבוסס, כגון AFM, TEM, SEM, וFT-IR. באמצעות שימוש בטכניקות מיקרוסקופית זה אפשרי כדי להשיג מידע על המורפולוגיה של המכלולים. מאז הממדים של מכלולים אלה נעים בין מאות ננומטרים לכמה מיקרונים, זה מספיק כדי להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סטנדרטי לאפיון שלהם. מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה במיוחד יהיו שימושיים עבור מבנים שהם בקוטר של פחות מ 100 ננומטר וכאשר הדמיה ללא ציפוי מוליך (למשל זהב) היא רצויה. במקרים מסוימים, הטעינה של המבנים על ידי קרן האלקטרונים של מיקרוסקופ האלקטרונים עלולה להתרחש בשל האופי האורגני של המבנה. זה יכול להיפתר על ידי הפחתת המתח של מערכת ההפעלה.

יחדיו, הגישה המוצגת כאן להרכבה העצמית של פפטידים יכולה להיות מותאמת לסוגים אחרים של פפטידים ועשויה להוביל להבנה טובה יותר של הכוחות ואינטראקציות בזמן התהליך. בנוסף, זה גם יכול להוביל להיווצרות של מכלולי biomolecular חדשים.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עבודה זו נתמכה על ידי מארי קירי הבינלאומי שילוב מחדש גרנט ועל ידי הקרן הגרמנית לישראל. אנו מכירים במר יאיר Razvag לניתוח AFM.