Penium margaritaceumの実験的スクリーニングプロトコル、免疫細胞化学および顕微鏡ベースのイメージング技術

本報告では、単細胞連鎖球菌藻類 Penium margaritaceumの培養と実験的操作に用いた基本的な方法について述べる。また、モノクローナル抗体やその他の蛍光プローブによる生細胞の標識や走査型電子顕微鏡など、顕微鏡ベースのイメージングの基本的なプロトコルも提供します。

細胞壁は、発生中および環境非生物的および生物的ストレッサーに応答する際の植物細胞のシグナル受信/伝達の最初の構成要素です。細胞は、細胞壁の完全性を常に監視し、ストレスに応じて細胞壁を調節します。細胞壁で起こる特異的な構造的および生化学的調節を解明することは、特に多細胞植物とその器官/組織を使用する場合には困難な作業です。これは、複雑な多細胞ネットワークの一部である個々の細胞で解決できるものに関する制限によるものです。単細胞連鎖球菌藻類である Penium margaritaceumは、最近、ペクチンの動態、細胞壁に基づく表現型の可塑性、および藻類細胞生物学の複数の側面の研究に使用されています。その単純な表現型、陸上の植物細胞壁と特に類似した多くの成分を持つ明確な細胞壁、および免疫細胞化学的および実験的研究の容易さにより、植物細胞壁生物学における強力なモデル生物となっています。この研究の目標は、培養、実験的操作、および適用ストレッサーのスクリーニングのための基本的な技術を提供することです。免疫細胞化学、共焦点レーザー走査型顕微鏡イメージング、および細胞壁構造の走査型電子顕微鏡イメージングのためのスクリーニングプロトコル。同様に、記載されている技術の多くは、他の広範な細胞および分子研究のために変更され得る。

植物の細胞壁は、植物細胞¹の生涯において複数の役割を果たす複雑な高分子ネットワークです。細胞壁の完全性は、発生中および環境ストレスに応答して細胞によって常に監視され、それに応じて化学的および構造的に調節されます。 Penium margaritaceum は、最近、Streptophyte藻類(Streptophyta、陸上植物に最も密接に関連し、祖先である緑藻類のグループ⁾の研究に使用されている単細胞緑藻です2。

過去20年間、P. margaritaceumは、細胞壁と細胞外マトリックスのダイナミクス、膜内システムの活動、細胞形状の発現、および植物の進化の研究において重要な生物でした3,4,5,6,7,8,9,10,11 .この研究の目標は、植物細胞壁の研究者に、P. margaritaceumを培養し、マイクロプレートベースの技術を使用して実験的に操作し、生細胞免疫細胞化学的標識と光学顕微鏡および電子顕微鏡技術によるイメージングを使用してその細胞壁の構造をモニタリングする基本的な方法を提供することです。P. margaritaceumは、細胞壁の生化学において、陸上植物の初代細胞壁と多くの類似点があります。私たちは、この藻類のユニークな単細胞表現型を利用し、多細胞植物ではモニタリングが困難なことが多い細胞壁のダイナミクスを迅速に研究する手段を提供する複数のプロトコルを考案しました。これらの技術は、詳細な細胞壁ダイナミクスを解明したい植物細胞壁生物学者、特にペクチンを扱う生物学者にとって有用であり、植物および連鎖球菌の藻類細胞生物学を扱う研究の出発点として役立つでしょう。

注: Penium margaritaceum は、 Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University, SAGで取得されています。株#2640。

1. 文化の維持

1. 藻類を液体のウッズホール培地(WH¹²)に維持し、土壌水抽出物(つまり、培地1リットルあたり40 mL)を補給することもできます。16 h:8 h light:3.5 klux (74 μmol photons/m²/s) の冷白色蛍光灯による暗サイクルで、培養物を 20-25 °C に維持します。
2. 継代培養を毎週準備し、10〜14日齢の細胞培養物を使用します。 ペニウム 培養は6ヶ月間生存可能であり、この期間中に継代培養を開始するために使用できます。藻類は、1%-2%の寒天固化WHMでも成長します。
3. 定期的な細胞周期の同期のために、10〜14日齢の培養細胞を20〜25°Cで2〜6週間暗所に置きます。 この時間の後、新鮮なWHM(下記参照)で細胞を洗浄し、上記のように培養します。

2. モノクローナル抗体による細胞壁の標識

注: P. margaritaceum は、陸上植物の初代細胞壁¹¹に見られるのと同じ成分の多くを持つ初代細胞壁で覆われています。陸上植物細胞壁エピトープに対して産生されたモノクローナル抗体(mAb)の多くは、 P. margaritaceum 細胞壁の成分を認識します。これらの抗体の供給源には、ジョージア大学の複合炭水化物研究センター(ccrc@uga.edu)またはケラファスト(kerafast.com)が含まれます。細胞壁エピトープに特異的な一次モノクローナル抗体および蛍光色素標識二次抗体(FITC、TRITCなど)を用いて生細胞を細胞壁標識した後、細胞の健康状態や細胞壁の沈着に影響を与えることなく、細胞を培養に戻すことができます。細胞壁の蛍光標識は無期限に残り、新たに分泌された細胞壁は暗い(すなわち、標識されていない)ゾーンとして現れ、細胞増殖速度を測定するために測定したり、mAbや他のプローブで再度標識したりすることができます。

1. 活発に増殖している液体細胞培養液5mL(10〜14日齢)を取り出し、15mLのプラスチック遠心チューブに入れます。卓上型遠心分離機で1,000 x g で1分間遠心分離します。
2. 上澄みを注ぎ、捨てます。ペレットを5mLの新鮮なWHMに再懸濁します。キャップをしっかりと置き、チューブを10秒間激しく振ってペレットを再懸濁し、細胞壁表面から細胞外高分子物質またはEPSを除去します。
3. 1,000 x g で1分間遠心分離します。手順2.2を繰り返して遠心分離します。ペレットを1 mLの新鮮なWHMに再懸濁し、細胞懸濁液の200 μLアリコートを1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
4. チューブにキャップをし、1,000 x gのマイクロ遠心分離機で遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを400μLの新鮮なWHMに再懸濁します。
5. 懸濁液に20 μLのmAb(例:低メチルエステル化ホモガラクツロナンに特異性を持つラットmAb、JIM5、最終希釈はWHMで1/20)を加えます。チューブをボルテックスし、アルミホイルで包み、実験室の回転子に90分間置きます。最良の結果を得るには、90分間のインキュベーションステップ中にチューブを2回ボルテックスします。
6. 細胞懸濁液を1,000 x g で1分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを500μLの新鮮なWHMに再懸濁します。チューブにキャップをし、細胞懸濁液を10秒間ボルテックスします。
7. 手順2.6を2回繰り返します。遠心分離後、ペレットを400 μLのWHMおよび8 μLのヤギ抗ラットTRITCまたはFITCに再懸濁します(WHMで1/75に希釈)。ボルテックスし、チューブをアルミホイルで包み、実験室の回転子に90分間置きます。
8. 手順 2.6 と 2.7 を繰り返します。ペレットを100 μLの成長培地に再懸濁し、チューブにキャップをして、イメージングの準備が整うまでアルミホイルで包みます。
   注:No Fat Carnation、Instant milk(1%)、またはウシ血清アルブミン(1%)などのブロッキング剤を含むWHMで細胞をインキュベーションする前に、mAbsでインキュベートすることもできますが、私たちの経験では、品質や強度を示すものではありません。 ペニウム は、暗所で細胞壁を拡張したり、大量のEPSを生成したりしません。標識された抗体は、少なくとも3〜4日間は無傷のままです。そのため、イメージングをすぐに行う必要はありません。他のモノクローナル抗体もここで適用できますが、濃度を試験する必要があります。化学的および物理的スクリーニング研究では、数mLの細胞懸濁液を標識し、数日間暗所に保管し、マイクロプレート研究に使用することができます。また、処理前にのみ一次抗体で細胞を標識し、その後で二次抗体を標識することもできます。

3. 細胞壁と細胞増殖速度の経時的な測定

1. JIM5-TRITCで標識した細胞1 mLを取出し、1.5 mLの微量遠心チューブにWHM1 mLを入れます。1,000 x g で1分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを250μLのWHMに再懸濁し、ボルテックスして細胞を混合します。
2. 12ウェルのシャーレの各ウェルに、1 mLのWHMを加えます。このとき、特定の阻害剤および成長調節剤を各ウェルに添加することができる。この論文では、インキュベーション中にカルシウムレベルを増加させることの影響を示します。
3. 標識細胞懸濁液30 μLを取り出し(ステップ1)、マイクロプレートの各ウェルに加えます。プレートをやさしく回して混ぜます。透明フィルムでシールします。
4. 上記のように(ステップ1.1)24時間、48時間、または72時間のカルチャ。所定の時間に、各ウェルから250 mLの細胞懸濁液を取り出し、1.5 μLの微量遠心チューブに入れます。
5. 1,000 x g で1分間遠心分離します。上清を取り除きます。ペレットを50 μLの成長培地とボルテックスに再懸濁します。
6. 15 μLの細胞懸濁液をスライドガラスに置き、22 x 22のカバーガラス(厚さ1.5)で覆います。蛍光顕微鏡でTRITCフィルターを10倍〜20倍で観察します。
7. 少なくとも50〜100個の細胞の画像をキャプチャします。各細胞について、細胞の全長とダークゾーン(つまり、標識後のインキュベーション中に生成された新しい壁)の長さを測定し、記録します。
8. 培養中の新しい細胞壁の平均%を決定します。48時間後および72時間後に採取した細胞について繰り返し、経時的な細胞壁の拡大に関する情報を取得します。
   注:ステップ3.5〜3.8は、1つの視野で多数の細胞のイメージングを可能にする高密度の細胞懸濁液をもたらす。これにより、手動測定がはるかに便利になります。多くのカメラソフトウェアプログラムは、この藻類で使用できるセル寸法の便利で自動測定を提供します。また、細胞を採取し、上記のようにJIM5で標識することもできますが、二次抗体として抗ラットFITCを代用することもできます。共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用すると、FITCフィルターとTRITCフィルターの両方で細胞をイメージングできます。その後、蛍光シグナルを異なる疑似色に割り当てることができます。これにより、さまざまな処理中に生成された新しい細胞壁の構造(JIM5-FITCで標識)と事前標識された細胞壁(JIM5-TRITCで標識)を区別する手段も可能になります。

4. 細胞壁拡大のタイムラプスイメージング

1. 上記のように、細胞壁をJIM5-TRITCで標識します(ステップ2.1-2.8)。細胞をWHMで10倍に希釈し、カバーガラスまたはガラス底のシャーレに50μLの細胞滴を加えます。
2. 暗所で細胞をガラスに2分間接着させます。ガラスに付着していない細胞を1mLのWHMでやさしく洗い流します。マイクロピペットを使用して、WHMをグラスに慎重に滴下します。
3. ガラスに付着した細胞の上に30μLのWHMを加えます。WHM/細胞の液滴の上に30μLの温かい4%アガロース/WHMを加えます。アガロースを室温まで冷まし、固化させます。
4. ペトリ皿内のサンプルの場合は、アガロースに包埋された細胞を完全に覆うのに十分なWHMを追加します。カバースリップ上のセルの場合は、カバースリップを反転させ、WHMで満たされたくぼみスライドの上にそっと置きます。
5. 細胞を蛍光顕微鏡にマウントします。外部照明(ランプ)を設置したり、顕微鏡自体からの光を使用して細胞の成長と動きにエネルギーを供給することができます。オリンパスのIx83またはIx63顕微鏡では、トランスランプの5〜6Vの電力がうまく機能します。これには、システムの試行錯誤が必要になる場合があります。
6. 細胞壁の増殖を追跡するためにTRITCフィルターセットを使用して、10〜30分ごとに画像化します。ステップ3.8で使用したWHMに化学物質/酵素がある場合は追加します。

5. 細胞外高分子物質(EPS)の産生観察

1. 細胞の調製:10〜14日齢の培養物から5mLの細胞を採取し、上記のステップ1〜4のように洗浄します。
2. 蛍光ビーズの調製:1.5 mLの微量遠心チューブに、0.75 μm蛍光ビーズ(Polysphere)を1滴(約100 μL)加えます。チューブにWHM1 mLを加え、激しく振とうしてビーズを再懸濁します。10,000 x g で3分間遠心分離します。上清を取り除きます。ペレットにWHM1mLを加えて振とうします。10,000 x g で3分間遠心分離します。ペレットを500μLのWHMに再懸濁します。
3. ウェルの調製:12ウェルプレートのウェルに1mLのWHM培地を加えます。阻害剤または成長調節剤を目的の濃度まで追加し、穏やかに渦巻きます。ビーズ溶液10μLを加え、プレートを静かに撹拌してビーズを混合します。洗浄した細胞10μLを各ウェルに加え、プレートを穏やかに渦巻かせます。
4. 上記のように細胞のプレートを培養します(1.1)。24時間後、プレートをFITCフィルターを装備した倒立蛍光顕微鏡に静かに置きます(混ぜないように注意してください)。ビーズがEPSに付着し、EPSの放出パターンを明らかにします。細胞を4倍、10倍、または20倍で撮影します。

6. EPSトレイル形成のタイムラプスイメージング

1. 上記で調製した12ウェルプレート(ステップ3.2)で、または個々のペトリ皿でタイムラプスイメージングを行います。手順 1 から 4 に従います。蛍光灯の下で細胞を培養するのではなく、倒立型蛍光顕微鏡にマウントしながら細胞を増殖させることができます。
2. 細胞の動きを最もよく捉えるために、5〜10分ごとに細胞を画像化します。蛍光ビーズはFITCフィルターセットを使用して視認できますが、濃縮ビーズには明視野チャネルを使用します。外部照明(ランプ)を設置したり、顕微鏡自体からの光を使用して細胞の成長と動きにエネルギーを供給することができます。オリンパスのIx83顕微鏡では、トランスランプの5〜6Vの電力がうまく機能します。これには、システムの試行錯誤が必要になる場合があります。

7. 走査型電子顕微鏡(SEM)による細胞壁の相関構造解析

注:細胞特異的抗体で標識された生細胞で観察された細胞壁の変化した特徴は、SEMを使用して詳細な特徴を画像化することができます。この相関アプローチにより、蛍光データと比較できる超微細構造データを取得できます。

1. 1.5 mLの微量遠心チューブに1 mLの細胞懸濁液(コントロールまたは実験的に処理)を入庫します。4,000 x g で1分間遠心分離します。
2. 上清を捨てます。ペレットの入ったチューブを液体窒素に浸すか、利用できない場合は-80°Cの冷凍庫に入れます。凍結細胞は-80°Cで数ヶ月間保存できます。
3. 細胞壁処理の際には、チューブを冷凍庫から取り出し、15分間解凍します。ペレットを20 μLのWHMに再懸濁し、45 mm x 50 mmのカバーガラス上に緻密な細胞懸濁液を一滴垂らします。
4. ドロップの上に2枚目のカバースリップを置き、サンドイッチを作ります。実験室のテーブルの上に置き、サンドイッチを連続的に押し下げて細胞を破裂させます(例:30秒)。
5. ガラスカバースリップを慎重に分離し、破裂した細胞を15mLの遠心チューブに洗浄します。500 x g で1分間遠心分離します。
6. 上清を注ぎます。ペレットは白またはわずかに緑色でなければなりません。その後の画像で十分な数の細胞が破裂していないことが示された場合は、ここでペレットでステップ3を繰り返します。
7. 細胞壁を含むペレットをD-H₂Oに再懸濁し、手順7.4と7.5を繰り返します。ペレットを100 μLのD-H₂Oに再懸濁し、1.5 mLの遠心チューブに入れます。
8. ケンブリッジのスタブ(半径6mmまたは8mm)を入手し、その表面にカーボンテープ(EMS)を接着します。次に、再懸濁した細胞壁懸濁液(ステップ7)を5μL滴下してカーボンテープに置きます。解剖顕微鏡を使用して細胞壁の数を観察します。懸濁液が密度が高すぎる場合は、D-H2Oで希釈してください。
9. スタブを蓋付きの容器に入れ、乾かします(2時間から一晩)。パラジウムターゲットを使用してスタブを50秒間スパッタコーティングします(他のターゲットも使用できます)。二次電子検出器から10cmのところにある5kV、スポットサイズの細胞を観察します。
   注:カーボンテープに液滴を沈着させる前に細胞壁懸濁液を希釈すると、細胞壁が互いに沈着するのが制限されます。

P. margaritaceumの細胞壁を抗ペクチンモノクローナル抗体(JIM5など)で標識すると、カルシウム錯体繊維のネットワークと、規則的なパターンまたは格子を形成する突起が明らかになります(図1)。ペクチンは細胞中心または峡部に沈着し、そこで古いペクチンを極に向かって移動させます(図2)。異なるペクチン抗体様JIM7で標識すると、峡部の狭いバンドにおける高メチルエステル化ペクチンの初期分泌が強調されます(図3A、B)。細胞壁に位置する他のポリマーには、mAbで標識されたアラビノガラクタンタンパク質、JIM13が含まれます(図4)。大量のEPSが細胞壁の外部から分泌され(図5)、滑走と細胞凝集体の形成が可能になります。これらの標識技術のいくつかは、細胞壁の定量的検査や細胞増殖などの発生研究に統合できます(図6)。同様に、SEMイメージングを用いたペクチンの相関構造研究は、生細胞標識蛍光ベースの顕微鏡法と比較できる詳細な超微細構造情報(図7)を提供します。

提供されている方法は、 P. margaritaceum のような単細胞藻類をさまざまなタイプの分析に使用するための基本的なガイドを提供します。細胞壁の 生細胞 免疫標識を行い、その後の発生イベントを追跡する能力は、多細胞システムではしばしば認められない特別な利点です。 P. margaritaceum は、ペクチンが細胞壁の外側表面にある細胞壁も提供します(つまり、顕微鏡検査に直接アクセスできます)。マイクロウェルプレートのウェル内の細胞をイメージングして実験することで、データを迅速に収集するための便利な手段が得られます。最後に、CLSMデータとSEMデータを相関させる手段は、生細胞イベントと超微細構造情報を比較するための貴重な導管を提供します。

図1:モノクローナル抗体によるペクチン格子の標識。 JIM5抗体の特異性は、エステル化ホモガラクツロナンが低いです。セル壁面のはっきりとした突起 (白い矢印) に注目してください。拡張ゾーン(黒矢印)は、新しいセル壁材料が追加される場所です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:発生中の細胞のJIM5標識。 細胞は最初にJIM5-TRITC(オレンジと*)で標識され、培養に戻されました。24時間後、細胞を採取し、JIM5-FITC(緑と矢印)で標識した。このゾーンは新たな成長を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:高エステル化ペクチンのJIM7標識。 (A)高エステル化ペクチンのモノクローナル抗体JIM7(特異性:高エステル化ホモガラクツロナン)による拡張ゾーンでの標識。セル壁面の狭い層 (白い矢印) に注目してください。(B)細胞増殖中の細胞壁の高エステル化ペクチンと低エステル化ペクチンの共標識。細胞は最初にJIM5-TRITC(オレンジと*)で標識され、培養に戻されました。24時間後、細胞を採取し、JIM7-FITC(緑と矢印)で標識した。ラベル付きのゾーン間の暗いゾーンは、新しく追加されたペクチン (黒い矢印) を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:細胞壁のアラビノグラクタンタンパク質。 モノクローナル抗体JIM13による細胞壁表面アラビノガラクタンタンパク質(AGP)の標識。AGPと細胞壁との緩やかな関連付けに注意してください(矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:蛍光ビーズによる滑走軌跡のイメージング(A)細胞壁表面に付着した0.75μmの蛍光ビーズ(矢印)。(B)EPSトレイルの蛍光ビーズ結合。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:JIM5-TRITC標識後の細胞壁拡大の測定が可能 細胞を培養物に戻し、24時間、48時間、および72時間増殖させます。細胞のアリコートは、特定の期間に除去し、蛍光共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察することができます。新たな増殖の割合は、標識されていない細胞壁(白線)と細胞全体の長さ(黄色の線)を測定することによって決定されます。赤色の蛍光はクロロフィル自家蛍光です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:共相関研究 (A) 典型的な格子は、多くの場合、異なる突起で外部で終わる繊維のメッシュでできています(矢印)。(B)カルシウムを多く含むと、格子が不規則な堆積物(矢印)に変化する。JIM5 標識セル。(C) (B)のように細胞壁を扱い、SEMで調べると、まとまりのないペクチン(矢印)が詳細に観察されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

P. margaritaceumは、植物や連鎖球菌藻類の細胞壁発生とECM分泌の動態を解明するのに有効な生物です。主な特性には、単細胞の習慣と培養維持および実験的操作の容易さ、明確な外側のペクチン格子と他のポリマーを持つ初代細胞壁、その後の発生および/または実験的研究に間に合うように追跡できる細胞壁指向性mAbによる生細胞標識の容易さ、蛍光ビーズ1を使用してリアルタイムでモニターできる大量のEPSの産生が含まれます^。2、3、6。さらに、ほとんどのラベリング手法は、定量的測定のための簡単な手段を提供します。

P. maragaritaceum は、ここで説明するプロトコルに対するいくつかの控えめな変更に対応できる堅牢な生物です。ただし、a)免疫細胞化学および実験的操作には、21日未満の培養細胞を使用してください。b)28°C以下の温度で培養する。c)抗体の希釈液を規定どおりに維持します。蛍光JIM5-TRITCの標識は、細胞を暗所に置いておくと数日間持続します。JIM7標識細胞は、24時間以内にイメージングする必要があります。蛍光ビーズの標識では、細胞のイメージングは24時間以内が最適です。特定の実験、特にマイクロプレートアッセイを使用する実験では、まずさまざまな濃度の薬剤を試験して、最も活性の高い薬剤を見つける必要があります。また、回収実験を実施して、薬剤が単に細胞培養の生存率を変えたのではないことを確認することも重要です。

記載されたプロトコールに簡単な変更を加えるだけで、研究者の目標に合わせて簡単に行うことができます。 P. margaritaceumでまだ試されていない細胞壁を研究するために、他の多くの抗体が利用可能です。特定の実験、特にマイクロプレートアッセイを使用する実験では、まずさまざまな濃度の薬剤を試験して、最も活性の高い薬剤を見つける必要があります。蛍光抗体で標識された細胞のマイクロプレートイメージングは、顕微鏡法による個々のウェルのスクリーニングを使用して迅速に評価できます。また、薬剤が細胞培養の生存率を変化させなかったことを確認するために、回収実験を行うことも重要です。

利益相反は報告されていません。

この研究は、全米科学財団(NSF)の支援を受けました(MCB助成金番号2129443 DDまで)。