ラットの脊髄圧迫により誘導されるニューロンアポトーシスモデル

ここでは、ラット脊髄圧迫モデルを生成し、その行動スコアを評価し、圧迫された脊髄領域を観察するためのプロトコルを紹介します。行動評価では、モニターの運動障害の減少が示されました。ヘマトキシリンとエオシンの染色と免疫染色により、脊髄の圧迫領域にかなりのニューロンのアポトーシスが明らかになりました。

重度の進行性変性疾患である頸椎症性脊髄症(CSM)は予後不良で、身体の痛み、こわばり、運動機能または感覚機能障害、および脊髄損傷とアクロパラリーシスのリスクが高いとされています。したがって、この慢性進行性疾患における効率的な脊髄再生を促進する治療戦略が緊急に必要とされています。CSMの根底にある複雑な生物学的メカニズムを理解するためには、効果的で再現性のある動物の脊髄圧迫モデルが必要です。ほとんどの脊髄損傷モデルは急性および構造的な破壊状態を反映していますが、CSMの動物モデルは脊髄の慢性的な圧迫を示します。この論文では、ラット脊髄圧迫モデルを生成するためのプロトコルを提示し、行動スコアを評価し、圧迫された脊髄領域を観察することにより、さらに評価しました。行動評価では、関節の動き、ステッピング能力、協調性、体幹の安定性、四肢の筋力など、モニターの運動障害の減少が示されました。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の染色と免疫染色により、脊髄の圧迫領域にかなりのニューロンアポトーシスが明らかになりました。

一般的な進行性変性疾患として、CSMはすべての頸椎症の5〜10%を占めています¹。CSM患者が自分の症状を無視し、適時かつ効果的な治療を怠ると、脊髄損傷や四肢麻痺などの重篤な合併症を引き起こし、加齢とともに悪化し、患者やその家族に大きな経済的・精神的負担をもたらす可能性があります^2,3。CSMの病因は複雑で、静的および動的要因、低酸素虚血理論、内皮細胞損傷、血液脊髄バリア破壊理論、および炎症およびアポトーシス理論4,5,6,7が関与しています。

脊髄の圧迫の静的および動的メカニズムは、臨床症状を引き起こします。突出した椎間板、変形した椎体、および石灰化した靭帯は、脊髄の圧迫を長引かせる可能性があり、これは徐々に脊髄の血液脊髄関門と脊髄の局所微小血管系に影響を与えます^4,8。次に、虚血、炎症、およびアポトーシスがニューロン、軸索、およびグリア細胞に影響を及ぼします^6,9。

脊髄損傷の実験動物モデルには、挫傷、圧迫損傷、牽引損傷、光化学誘発性損傷、虚血再灌流障害などがあります。これらのモデルのほとんどは、いくつかの急性および構造的な破壊条件(切断または化学的毒性)も反映しています。しかし、これらのCSMの動物モデルでは、脊髄に進行性のニューロンアポトーシスを示すことはできません。

この論文では、ラット脊髄圧迫モデルを生成するための詳細なプロトコルについて説明し、行動スコアを評価し、脊髄の圧迫領域を観察することにより、さらに評価しました。このラット脊髄圧迫モデルは、CSMに関与するメカニズムをさらに調査するための信頼性の高い動物モデルです。

以下の手順は、上海中医薬大学の動物管理委員会(IACUC)の承認を得て実施されました。すべての生存手術は、NIHのガイドラインで概説されているように、無菌条件下で行われました。疼痛と感染リスクは、適切な鎮痛薬と抗菌薬で管理し、良好な結果を確保した。この外科的処置は、生後12週齢、体重400gのSprague-Dawley(SD)非近交系雄ラットに最適化されています。

1. PVA-ポリアクリルアミドのヒドロゲルの調製

注: 図1G、1Hに示すように、PVA-ポリアクリルアミドヒドロゲルは吸水ポリマーシートです。自然な状態では、ゲルを細かく切るのは非常に困難です。調製方法は以下の通りです。

1. PVA-ポリアクリルアミドハイドロゲルを水に24時間入れて、水和後に切断しやすくします。
2. 自作の切削工具(図1H)を使用して、ヒドロゲル全体を2 mm x 2 mm x 2 mmのサイズに分割します。
3. これらのヒドロゲル片を60°Cのオーブンに12時間移し、移植材料として1mm×1mm×1mmの小片に脱水します。

2.麻酔と準備

注:滅菌外科手術プロセス全体を通して、サージカルキャップ、使い捨て医療用マスク、および滅菌外科用手袋を必ず着用してください。

1. ラットを加熱パッドに置き、麻酔中に直腸温が37±1°Cに維持されることを確認します。
2. ラットを3%イソフルランで満たされた麻酔室に3分間入れます。
3. ラットの手足とつま先をピンセットでそっとつまんで、離脱反応の喪失をテストし、麻酔が成功したことを示します。
4. ラットを手術台に腹臥位で固定し、ラットの手足と頭がしっかりと固定されていることを確認します。
5. 麻酔マスクをラットの顔に固定します。標準的なラット鼻マスクを介して酸素/空気混合物に2%イソフルランを投与し、脊椎圧迫手術中にラットに麻酔をかけます。.
6. ラットと手術台(図1A)の間に円筒形のガーゼパッド(約30 mm x 20 mm x 60 mm)を配置し、手術中に気道が遮られず、手術部位が完全に露出していることを確認します。
7. 電気シェーバーでラットの首の手術領域の周りの毛を剃ります。
8. 脱毛クリームを塗って残った毛を取り除き、肌を露出させます。
9. ヨードフォアで手術部位を消毒します。
10. 消毒した領域を滅菌タオルで覆い、穴を開けてラットの首の背側の手術領域のみを露出させます。.

3. 外科的アプローチ

1. 第2頸椎突起と第2胸棘突起を経皮的に位置決めした後、第2頸椎突起から第2胸棘突起までメスで背側正中線を縦方向に切開します。
2. 鈍く、止血鉗子で両側の筋肉を分離し、皮下組織と筋膜を層ごとに切断した後、C2-T2椎弓板を露出させます。
3. 頸部層流に穴(1 mm x 1 mm)を開けます(図1B)。
   注:脊髄の過度の損傷を避けるために、ラットの首が背側アーチ状態に維持され、頸椎板の間に十分なスペースが確保されていることを確認してください。
4. 顕微手術用鉗子を使用して、1 mm x 1 mm x 1 mmのサイズのPVA-ポリアクリルアミドヒドロゲルをつかみ、前に開けた穴に挿入します(図1C、1D)。
   注:一時的なけいれん性能は、脊髄圧迫モデルが正常に確立されたことを示しています。
5. 筋肉、筋膜、皮下組織、皮膚組織を、三角形の針と5-0縫合糸を使用して、層ごとに縫合します。
6. 消毒後、動物をケージに戻し、保温します。
7. ブプレノルフィン塩酸塩鎮痛剤(0.03mg/kg)を術後3日間、6時間ごとに皮下注射し、その後も必要に応じて注射します。

4. 術後管理

1. 100,000単位相当のペニシリンを1日1回ラットに腹腔内に注射して、術後感染を防ぎ、痛みを和らげます。
2. ラットを赤外線ランプで連続的に加熱された新しいケージに移し、術後の適切な保温を確保します。
   注意: 暖房を取り外すamp ラットの意識が回復した後
3. ラットの給餌ケージの衛生と換気を維持します。
4. ネズミが1日2回食べたり飲んだりするのを手伝ってください。必要に応じて、排尿機能が回復するまで排尿を助けるために膀胱マッサージを行います。

5. 行動評価

1. Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) 評価スケールを使用して、術後の行動を評価します。
   注:BBB評価尺度は、ラットの脊髄関連機能を評価するために使用されるゴールドスタンダード(表1)です。ラットの動きを、0(後肢の動きが観察されなかった)から21(歩行協調、つま先スペースの一貫性、全姿勢で平行な主爪位置、一貫した体幹の安定性、一貫した尾の高さ)までのスコアに従って評価します。

6.握力試験

1. 電子握力計を使用して握力を測定します。
2. ラットの下半分をつかんでラットを吊り下げ、フロントグリップメーターの金属棒をつかむようにします。
3. ネズミが金属棒をつかんだら、引き離して握力を記録します。
4. ラットごとに握力を3回測定し、最高スコアを記録します。

7.傾斜プレート試験

1. ラットを角度調整可能なゴム板の上に置きます。
2. ラットがバランスを取り、5秒間しっかりと立つまで、傾斜したプレートの角度を毎回5°ずつ徐々に上げます。
3. ラットが傾斜したプレート上でバランスをとることができる最大角度を記録します。
4. 各ラットの最大角度を3回測定し、最高スコアを記録します。

8.安楽死、脊髄分離、凍結埋込

注意: パラホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドガスから目、顔、および気道を保護するために、適切なアイゴーグルとフェイスシールド/マスクが着用されていることを確認してください。

1. 胸骨を開いて心臓を露出させる前に、ラットに麻酔をかけるために腹腔内に10%のクロラール水和物に相当するものを注入します。.
2. 心臓の頂点に灌流針を挿入し、止血鉗子で固定し、通常の生理食塩水をゆっくりと注入します。
3. きれいな正常な生理食塩水が右心房から流れ出るまで、右心房の付属器に穴を開けます。これは注入が成功したことを示します。
4. 肝臓が白くなったら、通常の生理食塩水灌流を停止します。
5. ラットの体が硬くなるまで、10%パラホルムアルデヒド相当量を注入します。
6. パラホルムアルデヒド灌流後、脊椎の周りの皮膚、筋肉、軟部組織を取り除きます。頸椎のC2-C7セグメントを分離します。そして、それを10%パラホルムアルデヒドに浸して一晩固定します。
7. 頸髄を脊椎から分離し、10%、20%、30%のショ糖溶液の濃度勾配に入れて、徐々に脱水します。
8. 高さ2mmの圧迫された脊髄をOCT包埋剤とともに-80°Cの冷凍庫に移します。
9. 厚さ7μmの切片に切片化して染色(H&E染色、dUTPニックエンドラベリング(TUNEL)/神経核(NeuN)、セクション9参照)した後、脊髄の病理組織を観察、神経細胞のアポトーシスをそれぞれ観察します。

9. TUNEL/NeuN免疫染色

1. 脊髄切片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に室温で10分間浸し、0.3%Triton X-100と5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS溶液で1時間ブロックします。
2. 脊髄切片をウサギポリクローナル抗NeuN抗体(1:200に希釈)と4°Cで一晩インキュベートします。
3. PBSで脊髄部分を3回すすぎます。その後、Alexa Fluor 594標識二次抗体と室温で2時間インキュベートします。
4. ワンステップのTUNELアポトーシスアッセイキット(緑色蛍光)を使用して、脊髄切片のアポトーシス核を染色します。

脊髄圧迫性損傷は、手足の神経筋障害を引き起こす可能性があります
ハイドロゲル片が徐々に膨張するにつれて、脊髄領域を長期間持続的に圧迫し、これは頸^{髄疾患8,10}によって引き起こされる前肢障害をシミュレートする。現在のモデルでは、モデルグループのほとんどのラット(9/10)でかなりの同側の前足拘縮が観察されました(図2A)。前足の長さと幅のさらなる測定と分析は、グリッド線付きの紙で行われました(図2B)。その結果、モデル群の同側の前足の長さと幅は、術後1日で顕著に減少したことが明らかになった(P < 0.01)。ただし、対照群とモデル群の間で、対側の前足に有意差は検出されませんでした(図2C)。

四肢の進行と神経筋障害を評価するために、手術後1日目、3日目、7日目、14日目、21日目、28日目の観察にBBB評価尺度、傾斜面テスト、および前肢グリップテストが使用されました。テューキーの検定による一元配置または二元配置の分析は、正規分布データを分析するために実行されました。ポストホック分析を用いたノンパラメトリックMann-Whitney U検定を、正規分布していないが等分散を含むデータに対して実行しました。データは平均±標準偏差(SD)で表されます。差はP < 0.05で統計的に有意であると考えられた。

その結果、モデル群のラットのBBBスコアは、手術後1日目と3日目に徐々に減少し、特に同側で初期段階で重大な機能障害を示したことが示されました(図2D、2E、2G)。脊髄圧迫の回復はモデル群と対照群の両方で観察されましたが、モデル群のラットは、手術後4週間で対照群と比較して、異常な前足機能とバランス能力の回復が遅れて不完全であることを示しました(図2E、 2G)。モデル群と対照群との間の有意差は、手術後28日目の傾斜面スコアと握力で維持されました。これらの結果から、この手術はラットにおいて頸髄に進行性の圧迫を誘発し、運動能力を低下させることが示されました。

脊髄の圧迫による組織学的変化と炎症
頸髄を分離した後、脊髄に深さ2mm、面積2mm×2mmの顕著なくぼみが観察されました(図3B)。形態学的変化を評価するために、脊髄切片を染色し、光学顕微鏡で観察しました。H&E染色により、免疫細胞の浸潤と脊髄の圧迫領域におけるニューロンの劇的な喪失が明らかになりました(図3C)。さらに、免疫染色により、モデル群の脊髄圧迫部位におけるニューロンのアポトーシスの劇的な増加が明らかになりました(図3D、3E)。一部の細胞または組織では、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼの活性レベルが高く、非特異的な蛍光が生じる可能性があります。したがって、これらの酵素が偽陽性を引き起こすのを防ぐために、抽出された直後に組織を固定化しました。TUNEL染色は非特異的であり、細胞死またはニューロン死の場合に使用できます。NeuNは、ニューロンの特異的染色マーカーです。その結果、TUNEL染色とNeuN染色の融合画像を用いて、ニューロンのアポトーシスを実証しました。

図1:外科的処置の概略図(A)手術中にラットの気道がきれいであることを確認するために、ガーゼパッドをラットの下に置いた。(B-D)頸部脊柱管へのヒドロゲル移植の外科的処置。黄色の矢印はC6の椎骨板に開けられた小さな穴を指し、緑色の矢印は脱水されたヒドロゲルブロックを示しています。(E)外科的処置の概略図。(F)脊髄圧迫の3次元概略図。(G)PVA-ポリアクリルアミドヒドロゲルの吸水特性。(H)脊髄圧迫のためのハイドロゲルブロックの調製。略語:PVA=ポリビニルアルコール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:BBBスケール、握力試験、傾斜板試験による前足の形態と行動観察 (A)手術後3日目の対照群(左)ラットとモデル群(右)ラットの同側前足の典型的な特徴。(B)ラットの前足の幅と長さを測定した。横の赤い矢印は最初の指から4番目の指まで、縦の赤い矢印は最も長い指の先から手のひらの付け根までです。(C)モデル群と対照群における同側の前足の長さと幅の定量分析。(D) 手術後 1、3、7、14、21、および 28 日後の同側側と対側の両方の BBB スコア。(E)同側および反対側の前肢の握力1、3、7、14、21、および28日後、握力テストで評価。(F)傾斜板試験の概略図。(G)手術後1、3、10、20、および28日後の同側側と反対側の両方の肢の強度とバランス、傾斜プレートテストで評価。±*P < 0.05 および **P < 0.01 対対照群;n = 10 /グループ。略語:BBB = Basso、Beattie、およびBresnahan評価スケール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:頸髄圧迫の長期化後の形態学的変化と炎症反応(A)脊髄圧迫の3次元概略図。(B)脊髄上の深さ2mm、面積2mm×2mmのくぼみ。(C)圧迫およびH&E染色後28日目の脊髄組織切片。免疫細胞の浸潤と脊髄の圧迫領域におけるニューロンの劇的な喪失。赤い長方形、同側。緑の長方形、反対側。青い矢印、免疫細胞。黄色の矢印、ニューロン。(D)モデル群と対照群の脊髄圧迫部位切片のNeuN(赤)/TUNEL(緑)の二重染色。スケールバー = 20 μm. (E) NeuNおよびTUNELダブルポジティブ細胞の定量。P <対照群と比較して 0.001;n = 10 /グループ。略語:H & E =ヘマトキシリンとエオシン。NeuN = ニューロン核;TUNEL = dUTPニックエンドラベリング。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:Bassoらの21点の機能評価尺度。^9、11。

この外科的処置の目標は、ラットの脊髄に再現性のある長期にわたる神経アポトーシスを生成することでした。このモデルの主な利点は、拡張可能なハイドロゲルインプラントが脊髄に長時間の圧迫を提供し、それによって進行性の神経アポトーシス応答(図2C)を引き起こすことです。これは、CSMの病理学的プロセスと一致します。現在の研究では、脊髄損傷による死亡率は非常に低かった (50 人中 ~2人) でしたが、このモデルの再現性は 50 人中 45 人>でした。手術中にハイドロゲル片のサイズが間違っていることや激しい移植は、脊髄に急性損傷を引き起こす可能性がある^12,13。

未発表の研究¹⁴ では、350%の拡大率で移植すると、数週間にわたって進行性の回復を伴う一時的および急性のCSMが発生したことがわかりました。200%の拡張率は、インプラントが脊髄よりも硬かったため、CSMモデルでゆっくりと進行性の麻痺を引き起こしました。しかし、このモデルでは、埋め込まれた材料の硬さには興味がなく、この埋め込みの最終的なサイズにのみ興味がありました。4週間後、脊髄のくぼみ(図3A、3B)が観察されましたが、これは脊髄の持続的な収縮、神経炎症の悪化、およびニューロンのアポトーシスを反映しています。

現在、インプラントのサイズについてはコンセンサスが得られていません。いくつかの研究では、厚さ0.5-1 mm^15,16,17,18の吸収性シートを使用し、脊椎圧迫による機能障害が報告されていた。別のラット脊髄圧迫研究¹⁹では、無傷の白質の喪失と劇的な臍帯の平坦化は、重度の臍帯圧迫(厚さ2.6mm)によって誘発されることが示されました。したがって、軟らかく拡張可能な材料で製造された大型インプラントは、脊髄の長時間の圧迫に適している可能性があります。

現行モデルでは、特大インプラントによる急激な脊髄損傷や突発的な力による事故死を避けるために、脊椎板上のハイドロゲル片とドリルのサイズは1mm×1mm×1mmのサイズに厳しく制限されていました。48時間の水和後、ハイドロゲルブロックは2 mm x 2 mm x 2 mmのサイズに拡張しました。臨床的には、CSM患者の症状の悪化は、脊髄の突然の圧迫に関連しており、これは脊髄の継続的な椎間板ヘルニア圧迫と、その後の炎症と浮腫によって誘発される低い代償適応によるものです^4,7。これは、片側性ヒドロゲル炎症性浸潤が両側の神経学的機能障害につながる理由を説明する可能性があります²⁰。

この動物モデルの1つの制限は、ラットがあらゆる損傷に対して強い適応を示すことであり²¹、これにより迅速な回復が促進される。いくつかの研究は、圧迫手術^{15、16、17、18、21、22}後の経時的な神経機能の継続的な改善を示していますが、悪化傾向を報告した研究はごくわずかです。さらに、ほとんどのCSM患者は、脊髄の一貫した圧迫下で神経機能の段階的な回復または悪化を示します²³。現在のモデルでは 4 週間後に運動機能に有意差がなかったため、行動評価を中止し、ラットを安楽死させてさらなる組織学的調査を行いました。要約すると、この研究は、ラットの脊髄圧迫によって誘発される神経アポトーシスモデル、CSMおよび脊髄再生に関連する細胞および分子メカニズムを研究するための実用的な動物モデルを示しています。

著者は、開示する利益相反はなく、この研究で使用されたすべての資料への完全なアクセスに制限はないと述べています。

この研究は、National Key R&D Program of China(2018YFC1704300)、National Natural Science Foundation of China(81930116、81804115、81873317、81704096)、Shanghai Sailing Program(18YF1423800)、Natural science Foundation of Shanghai(20ZR1473400)の支援を受けました。このプロジェクトは、上海中医薬大学(2019LK057)の支援も受けました。