マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca²⁺ signaling using two-photon microscopy.

外傷性脊髄損傷（SCI）は、SCの感覚と自律神経機能に影響を与える壊滅的な臨床症状です。 SCIを生き残った患者は、多くの場合、大幅に日常活動や生活¹の品質に影響を与える対麻痺を衰弱が残されています。実験SCIモデルはSCIの病態生理と関連する神経修復プロセスを理解するために、科学的な調査で必要不可欠なツールとなっています。これらのモデルはまた、機能回復を目的とする種々の実験の神経保護的介入の前臨床効力を試験するために使用されています。現在、実際にSCIモデルの大部分は、機械的に破壊し、SCを傷つけるために物理的な鈍力の使用を採用しています。これらの方法は、SC ²の挫傷、圧縮、転位や離断を含みます。ことが示唆されている主要な機械的な損傷、負傷したSC内における虚血セットの形での二次損傷後 3,4。二次虚血の原因は、大規模な組織変性、実質内出血、時には組織浮腫^5-7による血管の閉塞によって含まれています。 SCの整合性がさらに影響される二次的損傷の結果として、ニューロンとグリア細胞がひどく機能および生存度が損なわれ、虚血性ペナンブラ脳卒中後の成長に類似した損傷の慢性期の間に成長を梗塞につながるアポトーシスを受けます^8,9。興奮毒性、フリーラジカル生成、および炎症などのいくつかのメカニズムは、SCI ^10,11次の虚血性細胞死の原因であることが報告されています。また、SCの虚血は、多くの場合、患者^12,13に対麻痺を引き起こす胸腹部大動脈瘤修復手術の重篤な合併症です。このような高い臨床的影響にもかかわらず、高い再現性脊髄虚血の非常にいくつかのモデルは、現在利用可能です。

現在の研究の目的は、マウスにおけるSC虚血の簡単かつ再現性の高いモデルを開発することです。我々は、マウスにおけるSC虚血のPTモデルの手順を説明しました。組織学および免疫染色の結果から、PTが効果的にSC梗塞、神経細胞脱落と反応性神経膠症を誘発することができることを実証しました。

注：マウス（C57BL / 6J、オス）高齢者 10から12週目は、この研究で使用しました。すべての手順は、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って行われ、ミズーリ州制度動物実験委員会（IACUC）の大学によって承認されました。

1.手術前

1. 日手術のオートクレーブの前に、すべての手術器具を滅菌します。乾燥の30分^（121°Cの 、15 PSI、30/30サイクル）、続いて30分間、15 psiで^121°Cので楽器やオートクレーブを包みます。さらに使用するまで清潔で無菌環境で機器を配置します。
2. 新鮮なローズベンガル（RB）溶液（滅菌生理食塩水中の20 mg / mlの）手術の前にするたびに準備します。完全にRBを溶解し、ボルテックスチューブをアルミニウム箔19 W.ラップ管の出力電力と50/60 Hzで5分間超音波処理に続いて、さらにシュール中に使用されるまで、光から保護しますGeryの。
3. 滅菌生理食塩水にケタミン/キシラジンの混合物を準備します。麻酔薬混合物の最終容量1mlを作るために：（100 mg / mlのストック濃度）および滅菌生理食塩水550μlのとketmaineの325μL：キシラジン125μlの（20 mg / mlのストック濃度）を追加します。
4. 恒温加熱パッドを事前に温めます。
5. ランプ電力を安定させるために30分間、メタルハライドランプ（FN1エピ蛍光顕微鏡用の光源）を事前温め。
6. 10倍対物レンズと直立FN1落射蛍光顕微鏡で視野絞りを調整することにより、レチクルを使用して1mmの直径に照明領域のサイズを調整します。

2.手術手順

1. ケタミンの用量でマウスを麻酔（130ミリグラム/ kgのBの重量。）およびキシラジン（10mg / kgのBとの重量）。マウスのB.重量g当り1.3、4μlのカクテルに基づきます。必要とされています。アルコール綿棒で注射部位を消毒し、内を通って麻酔薬を投与します-peritoneal（IP）ルート。動物の誘導と回復を遅らせることになる。このような血管や筋肉に麻酔薬を注入しないように注意してください。
2. 乾燥を防止し、低体温症を防ぐために加熱パッドの上に動物を配置するために、マウスの両眼に人工涙軟膏を適用します。
3. 動物の作製
   1. つま先のピンチ応答を使用して、適切な外科的レベルの麻酔のために動物を確認してください。
   2. 動物が麻酔の外科的レベルに達したら、電気ヘアトリマーを使用して、動物の正中線の周りの背側表面の毛をクリップ。ベータダイン液で3回、続いて70％エタノールで手術部位を洗浄。次のステップまで、滅菌外科用ドレープを持つサイトをカバーしています。
4. 薄い骨の外科的処置は、脊髄を露出させます
   1. 手術用プラットフォーム（ 図1A）の恒温加熱パッドの上にうつ伏せにマウスを置きます。適切にマウスを確保細長いネック領域（ 図1A、B）を維持するために鼻のクランプを用いて姿勢。
   2. T12に胸椎T9から延びる背半ば線に沿って手術用はさみを使用して（約1センチ）の切開を行います。手術領域を露出するために皮膚を脇に移動します。
   3. メスを使用して、慎重にT9で背棘を公開するために筋肉をクリア - T12椎骨を。滅菌綿棒で穏やかな圧力を適用することにより、各ステップにおいて出血を止めます。別々のT10 -周辺の筋肉からT12椎骨と安定させ、任意の移動を防止するために椎骨クランプを使用して固定します（ 図1A、B）。
   4. T10やT11の椎骨の背側表面（ 図1C）SCの背面に脊椎静脈および他の小血管を可視化するために慎重に、ゆっくりと薄く、ドリルビット研磨骨と高速ドリルを使用します。
   5. 間引き手順中に発生する熱による熱損傷を防止するために、破片を除去するために一定の吸引と一緒に通常の生理食塩水の穏やかで一定のストリームを適用します。
   6. 主血管がはっきりと見えるまでメスを使用すると、慎重に骨の表面を滑らかに。このプロセスの間に、脊髄を損傷しないように注意してください。
   7. 血管が可視化されると、インスリン注射器を用いて眼窩洞を介して経路を30mg / kg（体重）の用量でRBを投与します。
   8. RB注射後3分後、レーザードップラー流量計を使用して血流を測定する必要に応じて（ 図2A、B）。全体の手順の間に無菌状態を維持します。

PTの3誘導

1. ラボ·ジャックの高さを調整することができる上にXY位置調整可能なステージ上に動物を置きます。 T11脊髄の露出領域を直接FN1エピ蛍光顕微鏡（ 図3A）の10倍の目的の下にあるように、マウスの位置を調整します。
2. 李の電力を設定12％でGHTソースと（注：この領域は脊椎静脈およびその他の毛細血管を含む）、薄型化、脊髄の中央に0.75ミリメートルの直径を有するT11領域を照射する緑色光（波長540と - である、580 nmの2分間の10倍の対物レンズを介して顕微鏡でフィルターキューブ）により達成しました。照射（ 図3B、C）の最初と最後に画像を撮影し、この時点では実験の時間を記録します。
3. 必要であれば、2.4.8（ 図2A、B）のような脊髄上記と同じ位置に、レーザードップラープローブを配置することにより、10分間、再び血流を測定します。
4. 任意の出血のための照射確認後と場合いずれも、動物を縫合に進んで見つかりませんでした。吸収性縫合糸または4-0サイズの絹縫合糸を用いて、脊髄の両側の筋肉と一緒に浅筋膜を縫合。露出されたSCを傷つけないように注意してください。 4-0絹縫合糸で皮膚を縫合。ベタジンまたはヨウ素を適用します。縫合後の皮膚の縁に。

4.手術後のケア

1. 縫合した後、回復のための加熱パッド上に動物を配置します。回収後の両方の後肢の動きを観察することによって神経学的欠損の徴候のために動物を確認してください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人動物を放置しないでください。
2. ホームケージに動物を転送します。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。
3. 一定の間隔で動物を確認してください。重度の神経学的欠損の場合には、膀胱の避難、鎮痛薬の投与（ - 0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン、0.05）のように適切なケアを提供しています。脱水のためにチェックし、重度の場合には、通常の生理食塩水を皮下に投与します。通常、ブプレノルフィン（0.1 mgの/ kg）は、手術部位の痛みを軽減するために縫合した後に投与されるであろう。
4. 動物はすぐにされていない場合動物は簡単に食べ物に到達することができますので、手術後に安楽死させ、我々は、ケージの床の上に、高含水量の食事を配置します。

5. Transcardial灌流、ニッスル染色および免疫染色

1. 先に説明したように^17-20経動物を灌流。
   1. 以前のプロトコルで説明したように、動物を麻酔し、経PBS中の氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）中で灌流。
   2. 灌流後、脊髄（SC）を除去し、4°CO / NでPBS中4％PFAでそれをポストは、固定してください。 30％のショ糖を含むPBSに固定SCを転送し、2のためにそれを維持する - それはチューブの底に沈むまで3日。
   3. クライオスタットを使用することで、厚さ30μmの切片に脊髄を切断し、ゼラチンコートしたスライドガラス上に、または0.01 M PBSで48ウェルプレートにシリアルに配置します。
2. ニッスル染色：ニッスルstainiを行うPTによって引き起こされる損傷を検査します以前^17-20に記載されているように、脊髄切片にngの。
   1. 簡単に説明すると、0.25％クレシルバイオレットで五回ごと脊髄ガラススライド上のスライスや汚れを収集します。染色した切片（ 図4）の画像を撮影します。
3. 免疫染色：浮動セクション法^17,18,20を用いて前述したように。
   1. ウサギ抗のNeuN抗体（1：300）、およびウサギ抗：簡潔には、ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）ポリクローナル抗体（300 1）を用いて4℃でO / Nインキュベートすることにより脊髄切片を染色IBA1抗体（1：500）ロバ抗ウサギアレクサ568コンジュゲートのIgG（1：400）、続いて室温で4時間二次抗体。蛍光顕微鏡（ 図5）を入れて撮影します。

本研究の目的は、PTモデルを用いて、マウスにおける脊髄虚血を生成することでした。脊髄（T10 - T12）上記骨の所望の領域の後薄くした、ローズベンガルは眼窩洞経路で注入し、虚血はPTによって誘導された、図1A、Bは内に配置マウスを示してカスタムメイドの外科。手術中のプラットフォーム。マウスは、鼻クランプにより所定位置に保持され、2つの調整可能脊椎動物は、脊髄を安定化させるためにクランプ図1Cは、T10の脊髄上記の薄くなったウィンドウを表示- 。T12を。主血管とその枝が明確に可視化することができます。虚血の誘導を確認するために、血流量の変化の前と後のPTレーザードップラー流量計を用いて測定した（ 図2A、B）。分析のために、血流の％の減少は、光血栓の前にベースラインの血流を用いて計算しました。血流はワットと比較してすぐに光照射後の〜20％に低下しました照射前に基礎レベルi番目。 図3Bは、Cが始まりとPTの終了時に脊髄血管の蛍光画像を示します。レーザードップラー流量計の測定値と一致して、虚血の誘導を、示唆している血管（ 図3C）で2分誘導された血液凝固のための照明、。 PTによって引き起こされる損傷を検査するために、マウスを、PT及びニッスル染色を行った3日後に屠殺しました。ニッスル染色後撮影した画像は、明らかにPT（ 図4）後の脊髄組織の損傷および細胞死を示し、周囲の領域から区画することができ、梗塞領域を示しました。免疫染色のNeuN、GFAPおよびIBA1を行いました。 GFAP発現は（も箱入りの領域を参照して、 図5（b））、虚血性コアの境界に上昇させながらのNeuN +ニューロンは、虚血性コア（ 図5A）の灰色の問題で失われました。 IBA1 +ミクログリアは球様のMORを示しましたphology増加IBA1式（ 図5C）と一緒に（ すなわち 、より短く、より少ないプロセスと拡大細胞体は、箱入りの領域を参照してください）。組織損失がフローティング部染色による虚血性コア領域にあったものの、全体の梗塞周囲領域におけるGFAP及びIBA1発現の増加が明確に観察することができます。これらの結果は、SCの虚血後の半影におけるニューロンの死と反応性神経膠症を示しています。一方、実質的な機能欠損は、後肢の麻痺を（ 動画参照 ）を示し、PTの後、すなわち 、無効後肢運動1日、負傷したマウスで観察されました。

脊髄図1. PT誘発性虚血モデル。（A）脊髄PTの手術台の写真。挿入図：拡大椎クランプ。（B）マウスは、鼻クランプにより、ステージ上の2つのカスタムメイド椎クランプによって行われました。骨はT10で薄くしたことに注意してください- T12領域と二つの金属の椎骨のクランプが脊髄を安定させるために使用されたためT10-11で脊髄上記間引き骨と領域を示した（C）Aズームアップ画像。 PTの誘導。主血管とその枝に注意してください。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2脊髄血流測定。 （A）プローブを配置するために、レーザードップラー流量計および定位装置を用いて、脊髄表面血流測定のセットアップ、（B）PTの前と後の脊髄の血流を測定しました。この実験において、PTは、12％の電力出力で2分間の光源を照射することによって誘導しました。照射面の直径は0.75ミリメートルであり、脊髄の中間にありました。血流は、PT前PT後10分まで安定した信号を得るために5分まで記録しました。各マウスからのデータは、前の光照射に値に対して正規化しました。グラフは、3匹のマウスからのデータの平均値を示しています。矢印は、PTの開始を示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3脊髄虚血をPTは、誘導された。（A）写真マウスは、脊髄における誘導PT用顕微鏡に置きました。マウスの位置は、XYステージグライディングとラボ·ジャックを使用して立体的に調整することができます。 10倍の対物レンズからの光が、脊髄の表面に焦点を合わせた。（BC）の注射後（C）の照明（B）の前と後の脊髄における血管の蛍光画像は、ベンガルローズ。照射の2分後（C）の血液凝固を（矢印を参照）に注意してください。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

脊髄の図4.ニッスル染色。通常（セクションを含む吻側ツー尾側脊髄の横断切片の一連のニッスル染色画像1,6）とPT誘発性震央（セクション2から5）。マウスを3日後に屠殺したPT。各脊髄セクションでは、厚さ30μmです。二つのセクション間の間隔は750μmです。 3 ^番目の画像の破線は、梗塞領域の概要を示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

のNeuN、GFAPおよびIBA1の図5.免疫染色 。のNeuN（A）の蛍光画像は、通常のGFAP（上のパネル）から（B）とIBA1（C）と染色（下のパネル）脊髄切片PTは、負傷しました。負傷したマウスは、3日後に屠殺したPT。破線は、正常組織からの梗塞領域を分離します。箱入りの領域は、50のスケールバーとGFAPとIBA1発現の高解像度の画像を表示しますミクロン。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ムービー 。脊髄のPTは、行動障害を誘発した。映画は、通常のケージでPT損傷マウスの動きを示しています。後肢（対麻痺）の麻痺を示し、慣れ脊髄とマウスの両方の後肢のドラッグを注意してください。映画は、損傷したマウスにおいてPTの24時間後に採取しました。

本研究では、SCの虚血の光血栓モデルを説明しました。遺伝工学の進歩が可能SCにおける虚血性病態生理に関与する特定の遺伝子の影響を研究するために作られた市販のトランスジェニックマウスの急増がありました。研究の目的は、脊髄虚血の再現可能なマウスモデルを開発することでした。ここでは、マウスでSCIを誘導するために皮質PTモデルを適応しました。手術後のT11胸椎のレベルで脊椎静脈およびマウスの背側面の毛細血管を暴露しました。そして、RB、市販の光活性染料は、所望の血管分布を達成するために眼窩洞経路で注射しました。露出された血管は、その後、梗塞後に血栓の形成を誘発し、緑色光を照射しました。組織学的および免疫染色法の我々の結果は、PTは、脊髄とをReactiにおける梗塞を誘導したことを示しました梗塞領域にグリオーシスVEの。後肢麻痺などの神経学的欠損も観察されました。これらのデータは、PTが、SCI後の病態生理学および細胞死のメカニズムを研究するための適切なモデルであることを示唆しています。プロトコルにおける重要なステップは、SCの背側表面上の血管の可視化のために椎骨の薄い表面に高速ドリルを使用することです。このステップは、慎重にドリルが脊髄空洞に入り、SCを損傷することがあります過剰な圧力のアプリケーションとして実行する必要があります。一方、不均一な薄膜化が不適切な照明をもたらす可能性があり、不規則な梗塞を生成することができます。この問題に対処するために、掘削の各短工程の後、顕微鏡下での骨の表面の頻繁な検査は、骨の厚さを評価するために、さらにドリルの使用を評価することをお勧めします。滅菌生理食塩水の使用は、露出面のより良い視覚化のためだけでなく、ゴミを洗い流すことをお勧めします。短所を維持全体の外科的処置中に無菌TANT、動物の適切な術後ケアは、動物生存率を改善し、実験の成功率を高めることができます。

PTの我々の現在のモデルは、（例えば、水銀ランプ、メタルハライドランプ、または488 nmの波長のレーザーのような）光源と落射蛍光顕微鏡が装備されている任意の実験室のような任意の高価な機器の購入を必要としないことができこの手順を実行します。また、この技術は複雑であり、ある大動脈の組み合わせ閉塞、左鎖骨及び内胸動脈²⁵および修飾大動脈クロスクランプ法²⁶などの他のSC虚血モデルと比較して、開口部の大きさを調整することにより、梗塞の大きさの制御を提供します極めて侵襲。我々のモデルでは可視化のための椎骨の薄い背面への高速ドリルが椎弓切除、SCIを誘導する多くの研究室による選択の方法に代わるものとして選ばれました。椎弓切除術は、椎骨血管の切断に起因する過度の出血を引き起こす可能性があり、これは撮影のためにフィールドを不明瞭かもしれない椎骨の切断を伴います。いくつかのプロトコルは、椎弓切除術の間に過度の出血をクリアするために綿棒を使用することをお勧めしていても、それは、SCへの追加の損傷を引き起こす可能性が圧縮になることがあります。また脊髄の露出面は、血液​​およびその構成要素、ならびに実験に不要な変動を追加することができますカット骨の鋭いエッジと直接接触することができます。現在PTモデルを使用して、異なる大きさ及び深さの梗塞は、光源、露出面の露出面積との継続時間の強度を簡単な操作により生成することができます。現在の研究は、SCにT11の中央領域に虚血を生成しますが、この方法はまた、吻側ツー尾に沿った異なる位置での梗塞ならびに脊髄、MIGの横方向を生成することができますHT対麻痺の虚血の地域固有の効果を理解するメリットがあります。照明は、脊髄の表面上にあるが、一方、光が組織内の特定の深さまで浸透する可能性があり、損傷はまた灰白質に誘導することができます。ローズベンガル全体循環系に分布するように動物種が同じであり、年齢および体重が類似している場合、我々は一貫性病変がPTによって誘発される皮質虚血のように生成することが期待します。

PT誘発性虚血の他の主要な利点は、動物の非常に低い死亡率です。低死亡率は長期生存の研究は、生存と運動機能回復の虚血性傷害の時間的効果の解明に有用であるかもしれない行うことができることを意味します。また、このモデルでは、通常、傷害^14,19,27-29の慢性期の後期に起こる細胞修復メカニズムの理解を助けることができます。このモデルは、Bもでき、かなりの運動機能障害を生成しますeは機能回復の神経保護剤の有効性を評価するために使用されます。また、このモデルはまた、軸索変性と再生、ニューロンおよびアストロサイトのCa ²⁺シグナル伝達と二光子顕微鏡を用いて、生きたマウスでの過負荷などのSCI後の病理学的変化の研究を可能にします。

他のすべてのSCIモデルと同様に、PTは欠点を欠いではありません。この手法の欠点は、皮質PTで見られるものと同様です。欠点のいくつかは、多くの神経保護薬の標的である、解剖学的に明確な虚血性ペナンブラの欠如、および再灌流の不在を含みます。これはよく再灌流後の虚血を大きく反応性酸素種の産生、炎症細胞の浸潤および増加したサイトカイン産生^30-32などの変化によって特徴付けられることが知られています。 PTでの再灌流の欠如は、SCで再灌流障害に関連した変更は、このモデルを用いて研究することは困難ままにすることを意味します。しかし、PT誘発される虚血を使用する利点は欠点を上回ると、この技術は、マウスでSCIを生成する実行しやすく、再現性の高いモデルと研究者を提供します。

The authors have nothing to disclose.

この作品は、国立衛生研究所[助成金なしでサポートされていました。 R01NS069726]と援助グラントのアメリカ心臓協会グラント【グラントありません。 13GRNT17020004] SDへ。