からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル

蚊の標本から品質マラリア原虫とベクターDNAを抽出するために迅速かつ現実的な方法が記載されている。 Chelex樹脂のキレート特性を生かし、簡単な方法は、マラリア蚊の中腸及び唾液腺の段階で寄生虫と同様の分子同定の遺伝子型が可能ハマダラカ同胞種。

流行国は、ますます彼らの制御プログラム^1,2,3,4,5の不可欠な部分として、マラリア原虫と媒介蚊に対する効果的なタイピング、識別および監視のための分子ツールを採用しています。けちな試薬や機器の要件を持つこれらのマラリア制御と排除の取り組みを強化するためのオペレーションズリサーチの正確なアプローチ、シンプルで手頃な価格の方法の確立のために持続可能な^6,7,8不可欠です。ここでは、フィールド収集蚊の標本からマラリア原虫とベクターDNAを抽出するためのシンプルなChelexベースの手法を提案する。

私たちは、形態学的に72 ハマダラカSLを同定した。除虫菊スプレーによってキャプチャ156蚊から抹茶でマラリア研究所の2000キロ²近傍内の世帯の部屋を寝にキャッチします。全72 ハマダラカGAMの腹部から頭部と胸部を分離するために解剖した後biae SL。蚊は、2つのセクションが個別に1.5 mlのマイクロチューブに入れ、脱イオン水20μlに浸漬した。滅菌ピペットチップを用いて、各蚊セクションは別々に脱イオン水で均一な懸濁液に均質化した。他の10μlを別オートクレーブした1.5​​ mlチューブに移しつつ、各蚊セクションから続くホモジネートを、10μlを保持した。別のアリコートを簡略Chelexまたは抽出プロトコル^9,10塩析標準のいずれかの方法でDNA抽出を行った。それはDNA抽出⁹時の蛋白質沈殿工程のために有害な有機溶媒（例えば、フェノール、クロロホルムなど）の代わりに高い塩濃度を採用しているため、塩析プロトコルは、いわゆる、広く使われています。

抽出物は、節足動物ミトコンドリアニコチンアミドアデニンジヌクレオチドdehydrogeを標的としたプライマーを用いたPCR増幅のための鋳型として用いたnase（NADH）サブユニット4遺伝子（ND4）は、 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染の ¹²のタイピングのためのDNAの質^11、 ハマダラカの同胞種¹⁰の識別のためのPCRとnested PCR法を確認することができます。 DNAの品質（ND4）を使用して比較すると、PCRが確立された塩析プロトコルに対する相対Chelexアプローチのための93％の感度と82％の特異性を示した。感度と特異度の対応する値は Pのために、それぞれの兄弟種同定、PCRと92％と80％を使用して、それぞれ100％と78％であった熱帯熱マラリア原虫検出PCR。 Chelexまたはすべての3つのPCRアプリケーション間でプロトコルを塩析レギュラーとリコン信号を与える検体の割合に有意差は認められなかった。 Chelexアプローチは、3つの簡単な試薬、完了までに37分を要し、一方、一晩工程を含む、10種類の試薬および2時間と47分 '処理時間を伴プロトコルを塩析。我々の結果は、番目を表示Chelex方法で、既存の塩析、抽出に匹敵し、一定の試薬のサプライチェーンは頻繁に維持することが困難である資源の限られた設定で、シンプルかつ持続可能なアプローチとして代用できます。

1。モスキート試料の準備解剖

1. 顕微鏡を解剖にパラフィルムとマウントの小さなカットの上に置いて蚊。
2. 組織を柔らかくするために、脱イオン水の滴でカバー。
3. こうして腹部セクションから頭部と胸部をオフニッキング、胸部と腹部の間の接合部に正確に蚊の死骸を切開。
4. 蚊ID番号の詳細や適切ボディ部を（;頭部と胸部セクションの"HT"中腸セクション用などの"m"）を示すようにマークと標識したクリーンなオートクレーブ滅菌1.5 mlマイクロチューブに各解剖蚊のセクションを転送します。
5. パラフィルムを破棄して、慎重に次の蚊を処理する前に70％アルコールで湿らせたキムワイプで顕微鏡ステージを拭いてください。

2。モスキート検体からのDNA抽出

1. サンプルチューブに脱イオン水をピペットを20μlと国連に沈め蚊部を研削するためにピペットチップを使用iformサスペンション。
2. 穏やかな瞬間的なボルテックスでサンプルホモジネートとのミックスにオートクレーブ滅菌1×PBS / 1％サポニン液100μlを加える。
3. 20分間室温でインキュベートする。
4. 2分間20,000 xgで遠心し、上清を捨てる。
5. 100μlの1X PBSでペレットを再懸濁します。
6. 2分間20,000 xgで再び遠心分離し、上清を捨てる。
7. 穏やかにボルテックス（5秒）、75μlの滅菌脱イオン水でペレットを再懸濁し、そして脱イオン水で20％（w / v）のChelex-100樹脂の懸濁液の25μlによって。
8. ブンゼンバーナーの炎にあて滅菌23G注射針を使用して、サンプルチューブの蓋にピアスの穴。
9. 10分間フローティングラックに水槽（または加熱ブロック内）の試料懸濁液を沸騰させます。
10. PCRアプリケーションのテンプレートとして使用するための標識したストレージバイアルに1分と転送続くDNA溶液のため、20,000 xgで遠心分離します。

3。熱帯熱マラリア原虫とハマダラカジェノ属。分子的同定

1. ハマダラカ種^10を特定し、遺伝子型Pに、DNAの質^11をチェックするために、25μlのPCR反応においてChelex DNA抽出物2.5μlを加え熱帯熱マラリア原虫 ¹²中腸及び唾液腺の感染症。
2. 特にPのアンプリコンの収量を最大にするには熱帯熱マラリア原虫の検出は、PCRアッセイで（BSA）は1.5Xウシ血清アルブミンが含まれています。下記の反応組成物をお勧めします（2.5μlのテンプレート、0.25μMプライマー、1.5μMの塩化マグネシウム、200μMのdNTP、1×PCRバッファー、1.5XのBSAおよび1.0U Taq DNAポリメラーゼ、25μlの巻）。
3. 抽出物中のDNAの品質をチェックするために、節足動物ミトコンドリアニコチンアミドアデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ（NADH）サブユニット4（ND4）遺伝子（プライマーND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT​​ AA-3 ']とND4RV [5'の領域を増幅CGD-CTT CTT CCW ADW CGT TC-3 '];製品^{400bp）11,13を}期待^{しています} 。
4. ハマダラカガンビアを区別する電子SL。同胞種（An.ハマダラカssと。arabiensisのみ）は、遺伝子間スペーサー（IGS）領域、（のSNPに隣接する領域を増幅するプライマー国連[5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 ']、ジョージア州[5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 ']、AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3'];製品390bpを期待ハマダラカSS、315bp ^{arabiensis）10,11。}
5. タイピングPの熱帯熱マラリア原虫葉酸の薬剤耐性遺伝子多型は、寄生虫ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子のアミノ酸コドン108、51、59、16、164に隣接する領域を増幅したnested PCRを行います。
   一次ラウンドプライマー ：M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 ']とM5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   二次ラウンドプライマー：M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] F /で[5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   または
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']を使用）。
   また、アミノ酸のコドン436、437、540、581を含む領域を増幅Pの中にND 613 熱帯熱マラリア原虫 dihydropteroateシンセターゼ（DHPS）遺伝子：
   一次ラウンドプライマー R2は[5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] R /と[5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
   二次ラウンドプライマー
   J：[5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']と
   または
   K：K /で[5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 ']、
   または
   L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] ^12。
6. 製造元の指示に従って30μlの反応における対立遺伝子特異的な制限酵素消化に従うことを条件として、4μlのアンプリコンは、葉酸拮抗剤耐性関連遺伝子多型^12を検出します。
7. テーマ5は、電気泳動にエチジウムブロマイド染色した2％アガロースゲルのレーンあたりPCRアンプリコンの液（または制限消化の15μl）（100 - 120V）およびUV透視下でバンドを可視化。

蚊のDNA抽出質（ 図1）、 ハマダラカarabiensis分子の同定（ 図2）とPのためのPCRアッセイからの結果の例簡略化されたChelex法ははるかに少ない手順（ 表1）にもかかわらず、プロトコル^10を塩析標準と同様の結果が得られることを熱帯熱検出（ 図3）を表示します。それぞれの抽出液に匹敵するDNAの品質で、それは驚くべきことではないことに対するサンプル陽性率。ハマダラカ同胞種だけでなく、寄生虫感染率はマクネマーのカイ二乗検定（ 図3）に基づいて、統計的に差は認められなかった。

感度（％）は次のように計算されたTP /（TP + FN）TPは真の陽性を示し、FN​​は偽陰性を示している* 100。特異性（％）は、TN /のように決定したTNは真の陰性を示し、FPは偽陽性を示し（TN + FP）* 100、。 DNAの品質（ND4）PCRは、設立されるようにプロトコルを塩析金本位制に比べChelexアプローチのための93％の感度と82％の特異性を示した。感度と特異度の対応する値は Pのために、それぞれの兄弟種同定、PCRと92％と80％を使用して、それぞれ100％と78％であった熱帯熱マラリア原虫検出PCR。

反応混合物にBSAの添加は、簡略化さChelexと正規両方のプロトコルを塩析するため、PCR阻害物質による¹⁴の救済へのPCR陽性（ 図3）の一般的な増加をもたらした。しかし、この増加はChelex抽出した（p = 0.039）上のDNAの質（ND4 PCR）を除いて統計的に有意ではなかった。 P上の対立遺伝子特異的制限酵素消化熱帯熱マラリア DHFRは（または他の標的遺伝子）アンプリコンは、薬剤抵抗性対立遺伝子（;唾液腺のデータは示されていない図4）の中腸及び唾液腺マラリア感染症の遺伝子タイピングを可能にします。

表1。シンプルChelexプロトコル用試薬および時間要件のステップ比較によりステップとスタンドARDは蚊の標本からDNAを抽出するための方法を塩析。

ハマダラカarabiensisフィールドサンプルの"M"の抽出物を塩析簡略化Chelex "C"と標準からのDNAの質の1。ND4ミトコンドリアPCRの比較図 。ノースカロライナ、ネガティブコントロール、M1とC1、C2、M2と、M3とC3、およびM4とC4は、塩析と同じからChelex抽出対になっています。 arabiensisの蚊の標本。 L、100 bpのDNAラダー。

。。ハマダラカarabiensis C1とM1、C2とM2は、C3とM3、C4およびM4は同じ蚊の標本のために"M"と簡略化しChelex "C"のDNA抽出物を塩析からそれぞれのアンプリコンを示すために、図2分子の同定、PCR、AR、 ハマダラカarabiensisポジティブコントロール、L、100 bpのDNAラダー。

図3 Chelexとハマダラカ^{arabiensis（AR）10、}節足動物NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子4（ND4）DNAの品質テスト^11、葉酸薬剤耐性Pの分子同定のためのPCRアッセイと、蚊フィールドサンプルのDNA抽出、塩析で陽性の検出。熱帯熱マラリア DHFR遺伝子タイピング^{12（F-M4）。}反応混合物中のBSAの有無にかかわらず実行するアッセイのために示された結果。マクネマーのカイ二乗検定は、DNAからポジティブPCRのパーセントの違いが簡素Chelexとプロトコルを統計学的に有意であった塩析標準から抽出されたかどうかを判断するために使用されていました。

図4：タイピングPに簡略化されたChelexプロトコルの応用薬剤抵抗性対立遺伝子のために蚊の原虫感染症（中腸のデータが示されている）。 Pのコドン108に隣接するリコンにBstN私は消化熱帯熱マラリア DHFR遺伝子^12は蚊サンプル（;半ば腸データは示さM1〜M5）でcycloguanil耐性S108T変異体を示しています。 U、未消化の522 bpのアンプリコン; FCR3、実験室標準P. S108Tを運んで熱帯熱マラリア原虫陽性対照クローン、K1、P.熱帯熱マラリア原虫実験室標準cycloguanilセンシティブS108Nを保有するクローンネガティブコントロール、L、100 bpのDNAラダー。

ここに提示され単純化されたChelex法は品質ハマダラカ属およびPの抽出を可能にする多様なPCRアプリケーションに従順蚊検体から熱帯熱マラリア原虫の DNA。この手法は、薬剤耐性Pの分子のマラリア媒介蚊の同定および監視のために使用することができる国家マラリア対策プログラムの蚊の原虫対立。簡略化されたChelex技術の利点は、シンプルさ、より少ない試薬および塩析法^10（2時間47分、一晩ステップ、 表1）などの標準プロトコルより故にコスト、安全性、短い処理時間（37分）が含まれています。現在の標準プロトコルと比較して、前述の利点と最小限の試薬 ​​の要件（3試薬）（10試薬は、 表^{1）11,15 は} 、一定の試薬 ​​風土病国の研究所に特に優しい簡素Chelexプロトコルを作るサプライチェーンは、多くの場合、維持することは困難です。メソッドの制限は、標準プロトコルのように、それはまた蚊外皮¹⁶で発生することが知られているPCR阻害物質の支配下にあったということです。しかし、これは容易にアッセイにおけるBSAを含めることによって緩和される。 BSAはまた首尾よく他のPCRアプリケーション^17,18におけるインヒビターに対する増幅エンハンサーとして採用されている。

特別な利害関係は宣言されません。

著者らは、首長、首長と蚊フィールドサンプルコレクション中に彼らの協力unwaveing​​用抹茶の社会の世話になっています。博士ダグ·ノリスとリベカケントは塩析プロトコルに非常に貴重な専門知識を提供した。この作品は、ジョンズホプキンスマラリア研究所パイロットグラントシステムによって賄われていた。蚊や寄生虫のDNA実験室の基準は親切にMR4、アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションから寄贈された。