A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من

يوصف وسيلة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج نوعية طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض. الاستفادة من خصائص مخلبية من راتنج Chelex، وطريقة بسيطة تمكن من التنميط الجيني طفيليات الملاريا في البعوض مراحل الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية، وكذلك تحديد الجزيئي لل الأنوفيلة الشقيق الأنواع من PCR.

البلدان الموبوءة يتم اعتماد متزايد الأدوات الجزيئية لكتابة كفاءة، وتحديد ومراقبة ضد طفيليات الملاريا والبعوض الحامل للمرض، باعتبارها جزءا لا يتجزأ من برامج سيطرتهم ^{1،2،3،4،5.} لإنشاء هذه النهج المستدام للدقة في عمليات البحث لتعزيز جهود مكافحة الملاريا والقضاء، وطرق بسيطة ومعقولة التكلفة، مع كاشف بالبخل والاحتياجات من المعدات ضرورية ^6،7،8. هنا نقدم بسيطة Chelex المستندة إلى تقنية لاستخراج طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض مجال جمع.

حددنا 72 شكليا الأنوفيلة الغامبية SL. من 156 البعوض التي استولت عليها عاقر قرحا رذاذ المصيد في غرف النوم من الأسر داخل المنطقة المجاورة ² كم من 2000 معهد الملاريا في ماشا. بعد تشريح لفصل الرأس والصدر من البطن حركة اتشيه الحرة لجميع الأنوفيلة 72biae SL. البعوض، وضعت بشكل فردي القسمين في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge والمغمورة في 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. تلميح باستخدام ماصة معقمة، والمتجانس بشكل منفصل لكل قسم البعوض على تعليق موحد في الماء منزوع الأيونات. من جناسة الناجمة عن البعوض كل قسم، تقرر الإبقاء على 10 ميكرولتر بينما تم نقل الآخر إلى 10 ميكرولتر منفصلة تعقيمها أنبوب مل 1.5. تعرضت مأخوذة منفصلة لاستخراج الحمض النووي من قبل Chelex إما المبسطة أو معيار التمليح من استخراج بروتوكول ^9،10. البروتوكول هو التمليح من ما يسمى ويستخدم بشكل واسع لأنه يعمل تركيزات عالية من الملح بدلا من المذيبات العضوية الخطرة (مثل الفينول وكلوروفورم) لهطول الأمطار خلال البروتين خطوة استخراج DNA ^9.

واستخدمت مقتطفات كقوالب لتضخيم PCR باستخدام بادئات استهداف المفصلية الميتوكوندريا dehydroge نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيدnase (NADH) الوحيدات 4 الجين (ND4) للتحقق من جودة DNA ^11، لPCR لتحديد الأنواع الأنوفيلة الغامبية ¹⁰ و الأخوة وPCR المتداخلة لكتابة الإصابة المنجلية ^12. مقارنة باستخدام نوعية الحمض النووي (ND4) أظهرت حساسية PCR 93٪ والنوعية 82٪ للنهج Chelex نسبة إلى بروتوكول التمليح من المنشأة. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة العينات إعطاء إشارة AMPLICON مع Chelex أو التمليح العادية من البروتوكول في جميع التطبيقات PCR الثلاثة. النهج Chelex حاجة إلى ثلاث الكواشف بسيطة و 37 دقيقة لإكمال، في حين أن. التمليح من البروتوكول ينطوي 10 الكواشف المختلفة و 2 ساعة 47 دقيقة والوقت "معالجة، بما في ذلك خطوة ليلة وضحاها نتائجنا تظهر الفي طريقة مماثلة لChelex استخراج التمليح من القائمة ويمكن أن تكون بديلا عن مقاربة بسيطة ومستدامة في الأماكن المحدودة الموارد حيث إمدادات ثابتة كاشف سلسلة غالبا ما يكون من الصعب الحفاظ عليها.

1. التحضيرية تشريح العينات البعوض

1. البعوض مكان على قطع صغيرة من parafilm وجبل على تشريح المجهر.
2. تغطية في قطرة ماء منزوع الأيونات لتليين الأنسجة.
3. شق الذبيحة البعوض على وجه التحديد في المشترك بين الصدر والبطن، وبالتالي من الخدش الرأس والصدر من قسم البطن.
4. نقل كل قسم تشريح البعوض إلى تعقيمها نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge prelabeled مع البعوض التفاصيل عدد ID وضعت بشكل مناسب للدلالة على القسم الجسم (مثل "M" في منتصف القناة الهضمية القسم؛ "حزب التحرير" لرئيس قسم الصدر و).
5. تجاهل parafilm والقضاء بعناية مرحلة المجهر مع Kimwipe 70٪ مبلل بالكحول قبل معالجة البعوض المقبل.

2. استخراج الحمض النووي من عينات البعوض

1. ماصة 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب العينات واستخدام تلميح ماصة لطحن قسم البعوض المغمورة في الأمم المتحدةيفورم التعليق.
2. إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS تعقيمها / 1٪ إلى حل سابونين جناسة عينة ومزيج من vortexing حظة لطيف.
3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
4. الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف.
5. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر 1X PBS.
6. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف.
7. من vortexing لطيف (5 ثانية)، إعادة تعليق بيليه في 75 ميكرولتر المياه المعقمة منزوع الأيونات و 25 ميكرولتر من التعليق 20٪ Chelex-100 W / V الراتنج في الماء منزوع الأيونات.
8. بيرس ثقب في غطاء أنبوب عينة باستخدام إبرة تحت الجلد العقيمة 23G ملتهب في الموقد بنسن.
9. يغلي التعليق العينة في حمام مائي على الرف العائمة (أو في كتلة التدفئة) لمدة 10 دقيقة.
10. الطرد المركزي في 20000 XG ل1 دقيقة والحل نقل الحمض النووي التي تلت ذلك في قارورة التخزين prelabeled لاستخدامها في تطبيقات PCR قالب.

3. المتصورة المنجلية والتنميط الجيني الأنوفيلةSPP. تحديد الجزيئية

1. إضافة 2.5 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي في 25 Chelex ردود الفعل PCR ميكرولتر الحمض النووي للتحقق من جودة ^11، تحديد الأنواع الأنوفيلة ¹⁰ و التركيب الوراثي لP. ¹² المنجلية التهابات الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية.
2. لتعظيم العائد AMPLICON، وخاصة بالنسبة للP. كشف المنجلية، وتشمل الزلال 1.5X مصل بقري (BSA) في مقايسة PCR. ويوصى تكوين رد الفعل التالي: (2.5 ميكرولتر قالب، 0.25 ميكرومتر الاشعال، 1.5 ميكرومتر كلوريد المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر dNTPs، 1X العازلة PCR، وBSA 1.5X 1.0U البلمرة DNA طق، في 25 مجلدا ميكرولتر).
3. للتحقق من الجودة في استخراج الحمض النووي، تضخيم منطقة المفصلية نازعة الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الميتوكوندريا (NADH) الوحيدات 4 (ND4) الجين (الاشعال ND4FW [5'-YAT GTD TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 '] وND4RV [5' CTT-رودمان CTT CCW ADW CGT TC-3 ']، ونتوقع المنتج 400bp) ^11،13.
4. للتمييز الأنوفيلة غامبياه الأنواع SL الأخوة. (An. الغامبية SS والانوفلس. فقط)، تضخيم المنطقة المحيطة النيوكلوتايد في التبادل بين الجينات (IGS) المنطقة، (الأمم المتحدة الاشعال [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 ']، GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 ']، AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']، ونتوقع ان المنتج 390bp SS الغامبية، ومن 315bp الانوفلس) ^10،11.
5. لكتابة P. المنجلية المقاومة للأدوية مضاد الفولات الأشكال، نفذ PCR المتداخلة لتضخيم المنطقة المحيطة الكودونات الأحماض الأمينية 108، 51، 59، 16 و 164 في اختزال dihydrofolate الطفيلي (DHFR) الجينات:
   الاشعال الجولة الأولي: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] وM5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   الاشعال الجولة الثانوية: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] مع F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   أو
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] مع M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
   كما تحتوي على تضخيم المنطقة الكودونات الأحماض الأمينية 436، 437، 540، 581 منوالثانية 613 في P. المنجلية dihydropteroate مخلقة (DHPS) الجينات:
   الجولة الأولي الاشعال R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] مع R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3']؛
   جولة الاشعال الثانوي
   J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] مع K / ['5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3]
   أو
   K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] مع K /،
   أو
   L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] مع L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] ^12.
6. 4 ميكرولتر AMPLICON الموضوع إلى أليل محددة انزيم الهضم قيود في 30 ميكرولتر ردود الفعل باتباع إرشادات الشركة المصنعة، للكشف عن المخدرات مضاد الفولات المرتبطة الأشكال المقاومة ^12.
7. الموضوع 5 ميكرولتر من AMPLICON PCR (أو 15 ميكرولتر من تقييد هضم) في حارة من بروميد الملطخة agarose هلام إيثيديوم 2٪ إلى الكهربي (100 - 120V) وتصور العصابات تحت تضوء UV.

أمثلة على نتائج فحوصات PCR من DNA لجودة استخراج البعوض (الشكل 1)، الأنوفيلة تحديد الجزيئية الانوفلس (الشكل 2) وP. كشف المنجلية (الشكل 3) تبين أن الأسلوب Chelex مبسطة تعطي نتائج مماثلة على مستوى التمليح من البروتوكول ^10، على الرغم من الخطوات أقل من ذلك بكثير (الجدول 1). مع نوعية DNA مماثلة في كل مقتطفات فإنه ليس من المستغرب أن معدلات إيجابية العينة فيما يتعلق آن. وكانت الأنواع الأخوة الغامبية وكذلك معدلات الإصابة الطفيلي لا تختلف إحصائيا استنادا إلى اختبار خي مربع McNemar في (الشكل 3).

تم حساب حساسية (٪) كما TP / (TP + FN) * 100 حيث TP يدل على ايجابيات صحيح ويدل على FN السلبيات كاذبة. تم تحديد خصوصية (٪) كما TN / (TN + FP) * 100 حيث يدل TN السلبيات الحقيقية وFP يدل على ايجابيات كاذبة. نوعية الحمض النووي ( وأظهرت ND4) PCR حساسية وخصوصية 93٪ 82٪ للنهج Chelex مقارنة لمعيار الذهب التمليح أنشئت من البروتوكول و. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR.

أدى إضافة إلى BSA مخاليط رد فعل في زيادة عامة من ايجابيات PCR (الشكل 3) بسبب تخفيف من مثبطات PCR ^14، لChelex على حد سواء وتبسيط العادية التمليح من البروتوكول. ومع ذلك، كان هذا الارتفاع ليس إلا دلالة إحصائية للحصول على جودة DNA (PCR ND4) على مقتطفات Chelex (P = 0.039). أليل محددة انزيم الهضم قيود على P. DHFR المنجلية (أو غيرها من الجينات المستهدفة) AMPLICON تمكن من التنميط الجيني منتصف الأمعاء والغدة اللعابية الإصابات بمرض الملاريا المقاومة للأدوية لالأليلات (الشكل 4، والبيانات الغدة اللعابية لا تظهر).

الجدول 1. الخطوة بالمقارنة خطوة من الكواشف ومتطلبات الوقت لبروتوكول Chelex بسيطة والوقوفارض التمليح من طريقة لاستخراج DNA من عينات البعوض.

الشكل 1. ND4 مقارنة PCR الميتوكوندريا الحمض النووي للجودة من "C" مبسطة Chelex ومستوى التمليح من "M" مقتطفات على عينات الأنوفيلة مجال الانوفلس. ووقع منتخبا M1 وC1، C2 M2 و، M3 وC3، C4 وM4 والتمليح ومقتطفات من Chelex من نفسه؛ NC، ومراقبة سلبية. عينات البعوض الانوفلس. L، 100 سلم DNA BP.

الشكل 2 الجزيئية PCR لتحديد بعوض الانوفلس ارابينسيس C1 وM1، M2 وC2، C3 وM3، M4 C4 ودلالة كل منها AMPLICON من التمليح من "M" وتبسيط Chelex مقتطفات "C" DNA لعينات البعوض نفسه؛. AR، الأنوفيلة الانوفلسإيجابية السيطرة؛ L، BP 100 DNA سلم.

الشكل 3. الكشف عن ايجابيات والتمليح على Chelex من مقتطفات الحمض النووي لعينات البعوض مجال، مع المقايسات PCR لتحديد الجزيئي للبعوض الانوفلس ارابينسيس (AR) ^10، نازعة المفصلية الجينات NADH 4 (ND4) DNA اختبار جودة ^11، ومضاد الفولات P مقاومة العقاقير . التنميط الجيني المنجلية DHFR ¹² (F-M4). النتائج أظهرت فحوصات لتشغيل مع أو بدون BSA في مزيج التفاعل. وقد استخدم McNemar في اختبار خي مربع لتحديد ما إذا كان الاختلافات بين في المئة من تقارير إنجاز المشروعات إيجابية من الحمض النووي المستخرج من Chelex مبسطة ومستوى التمليح من البروتوكولات كانت ذات دلالة إحصائية.

الشكل 4. تطبيق بروتوكول مبسطة Chelex في التنميط الجيني P. المنجلية الإصابات في البعوض (منتصف القناة الهضمية البيانات معروضة) لالأليلات المقاومة للأدوية. BstN I الهضم على AMPLICON المرافقة كودون 108 من P. DHFR الجينات المنجلية ¹² يظهر المسوخ S108T سيكلوغوانيل مقاومة في عينات البعوض (M1-M5؛ منتصف القناة الهضمية البيانات معروضة). U، عسر الهضم 522 BP AMPLICON؛ FCR3، والمختبرات القياسية P. استنساخ المنجلية مراقبة إيجابية تحمل S108T؛ K1، P. مختبر التحكم القياسية المنجلية استنساخ سلبية تحمل سيكلوغوانيل حساسة S108N؛ L، BP 100 DNA سلم.

طريقة مبسطة Chelex المقدمة هنا يمكن استخلاص نوعية الأنوفيلة SPP وP. المنجلية DNA من عينات البعوض قابلة للتطبيقات PCR متنوعة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الجزيئية من البعوض ناقل الملاريا ومراقبة المقاوم للأدوية P. المنجلية الأليلات في البعوض عن البرامج الوطنية لمكافحة الملاريا. مزايا تقنية مبسطة تشمل Chelex بساطة، أقل تكلفة، وبالتالي الكواشف والسلامة وزمن أقصر (37 دقيقة) من البروتوكولات القياسية مثل التمليح من طريقة ¹⁰ (2 دقيقة 47 ساعة وخطوة ليلة وضحاها، الجدول 1). المزايا المذكورة أعلاه ومتطلبات الحد الأدنى من كاشف (3 الكواشف) مقارنة بروتوكول المعيار الحالي (10 الكواشف، الجدول 1) ^11،15، وجعل البروتوكول Chelex مبسطة ودية خاصة إلى المختبرات البلاد الموبوءة حيث كاشف ثابتسلسلة التوريد في كثير من الأحيان من الصعب الحفاظ عليها. وجود قيود على الطريقة التي مثل بروتوكول قياسي، فإنه يخضع أيضا لمثبطات PCR المعروف أن يحدث في إهاب البعوض ^16. ومع ذلك، يخلص بسهولة عن طريق إدراج BSA في المقايسات. كما تم استخدامها بنجاح كما BSA محسن التضخيم ضد مثبطات في تطبيقات PCR الأخرى ^17،18.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الكتاب مدينون لجهاء وشيوخ والمجتمعات من ماشا لunwaveing ​​في التعاون خلال البعوض مجموعات عينة المجال. تقدم الدكتور دوغ نوريس وكنت رفقة الخبرات لا تقدر بثمن على بروتوكول التمليح بها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جونز هوبكنز الملاريا معهد بحوث نظام المنح الرائدة. تم التبرع بها البعوض والطفيليات التكرم معايير المختبر حسب نوع DNA، MR4 الأمريكية والتحصيل الثقافة.