פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ

דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של אנופלס אח מינים באמצעות PCR.

מדינות אנדמיות יותר ויותר לאמץ כלים מולקולריים להקלדה יעילה, זיהוי ומעקב נגד טפילי מלריה ויתושי וקטור, כחלק בלתי נפרד מתוכניות בקרת ^1,2,3,4,5. להקמת בר קיימא של גישות המדויקות אלה בפעולות מחקר כדי לחזק את שליטת מלריה ומאמצי חיסול, שיטות פשוטות ובמחיר סבירים, עם ריאגנט החסכן ודרישות ציוד חיוני ^6,7,8. כאן אנו מציגים טכניקה Chelex מבוססת פשוטה לחילוץ טפיל מלריה ודנ"א מדגימות יתושי וקטור שדה שנאספו.

אנו מורפולוגית זיהו 72 אנופלס gambiae sl. מ156 יתושים שנתפסו על ידי Pyrethrum התרסיס תופס בחדרי שינה נפרדת של משקי בית תוך ² קרבה 2,000 ק"מ של מכון המלריה בMacha. לאחר נתיחה כדי להפריד את הראש ובית החזה מהבטן לכל 72 אנופלס gambiae sl. יתושים, שני הסעיפים הונחו בנפרד ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל ושקוע ב20 μl מי deionized. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל מקטע יתוש homogenized בנפרד להשעיה אחידה במי deionized. של homogenate שהתפתח מכל קטע יתוש, 10 μl נשמר תוך 10 μl האחר הועברה לצינור מ"ל נפרד autoclaved 1.5. את aliquots הנפרד נחשפו למיצוי DNA או על ידי Chelex הפשוט או סטנדרטי המלחה החוצה חילוץ פרוטוקול ^9,10. פרוטוקול ההמלחה החוצה הוא מה שנקרא ושימוש נרחב משום שהיא מעסיקה ריכוז מלח גבוה במקום בממסים אורגניים מסוכנים (כגון פנול וכלורופורם) לצעד משקעי החלבון במהלך חילוץ דנ"א ^9.

תמציות שמשו כתבניות להגברת PCR באמצעות פריימרים מיקוד dehydroge פרוקי הרגליים המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotidenase (NADH) 4 גן המקטע (ND4) כדי לבדוק את איכות דנ"א ^11, PCR לזיהוי מיני אחי gambiae אנופלס ¹⁰ ו PCR מקונן להקלדה של זיהום Plasmodium falciparum ^12. PCR השוואה באמצעות איכות ה-DNA (ND4) הראתה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישה היחסית לפרוטוקול מבוסס המלחה החוצה Chelex. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור של דגימות נותנות אות amplicon עם Chelex או המלחה מתוך פרוטוקול קבוע בכל השלושה יישומי PCR. גישת Chelex נדרשה שלושה ריאגנטים פשוטים ו37 דקות כדי להשלים, תוך המלחה מתוך הפרוטוקול הכרוך 10 ריאגנטים שונים ו2 זמן העיבוד "47 דקות hr ו, כולל צעד בן לילה. התוצאות שלנו מראות הבשיטת Chelex דומה לחילוץ הקיים המלחה החוצה וניתן להחליף כגישה פשוטה וברת קיימא בהגדרות משאבים מוגבלים שבי שרשרת אספקת מגיב קבועה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה.

1. Dissection הכנת דגימות יתושים

1. יתוש מקום על חיתוך קטן של parafilm והר על ביתור מיקרוסקופ.
2. לכסות בטיפת מי deionized לרכך רקמות.
3. חתוך נבלת היתוש בדיוק במפרק בין בית החזה והבטן, ובכך סחבתי את הראש ובית החזה מסעיף הבטן.
4. העבר כל קטע יתושים גזורים לתוך צינור נקי autoclaved 1.5 מ"ל microcentrifuge prelabeled עם פרטי יתושי ת.ז וכראוי מסומן לציון סעיף גוף (לדוגמה: "מ '" לקטע באמצע בטן; "HT" לראש ובית החזה בסעיף).
5. השלך parafilm ולנגב במת מיקרוסקופ בזהירות עם 70% אלכוהול טבול Kimwipe לפני עיבוד היתוש הבא.

2. הפקת דנ"א מדוגמאות יתושים

1. 20 μl פיפטה של ​​מים לתוך צינור deionized מדגם עצת פיפטה שימוש לטחון סעיף היתוש השקוע באו"םהשעית iform.
2. הוסף 100 μl של פתרון סאפונין 1% לhomogenate מדגם ותמהיל ידי vortexing הרגעי העדין autoclaved 1X PBS /.
3. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
4. צנטריפוגה ב XG 20000 עבור 2 דקות וזורקים supernatant.
5. Resuspend גלולה בμl 1X PBS 100.
6. צנטריפוגה שוב ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant.
7. על ידי vortexing העדין (5 שניות), resuspend גלולה במי deionized סטרילי μl 75 ו 25 μl של 20% השעית w / v Chelex-100 שרף במי deionized.
8. חור פירס במכסה של צינור מדגם באמצעות מזרק 23 ז סטרילי flamed במבער בונזן.
9. השעית רתיחת מדגם באמבט מים במתקן צף (או בבלוק חימום) למשך 10 דקות.
10. צנטריפוגה ב XG 20000, עבור פתרון ה-DNA העברה התפתח 1 דקות ולתוך בקבוקון האחסון prelabeled לשימוש כתבנית ביישומי PCR.

3. Plasmodium falciparum genotyping ואנופלסspp. זיהוי מולקולרי

1. הוסף 2.5 μl של תמצית ה-DNA Chelex ב25 תגובות PCR μl כדי לבדוק את איכות דנ"א ^11, לזהות מיני אנופלס ¹⁰ ולגנוטיפ פ falciparum ¹² דלקות בלוטת אמצע בטן ורוק.
2. כדי למקסם את תשואת amplicon, במיוחד לפ איתור falciparum, כולל 1.5x אלבומין בסרום שור (BSA) בבדיקת PCR. הרכב התגובה הבא מומלץ: (2.5 תבנית μl, 0.25 פריימרים מיקרומטר, מגנזיום כלוריד מיקרומטר 1.5, 200 dNTPs מיקרומטר, 1X PCR חיץ, 1.5x BSA וDNA פולימראז 1.0U Taq, ב 25 כרכי μl).
3. כדי לבדוק לאיכות ה-DNA בתמצית, להגביר אזור דהידרוגנז פרוקי רגלי המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotide (NADH) מקטע 4 (ND4) גן (פריימרים ND4FW [5'-GTD יאט tta TGA TTR CCT ​​AA-3 '] וND4RV [5' CTT-CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; מצפה מוצר 400bp) ^11,13.
4. כדי לבדל אנופלס גמביהדואר SL. מיני אחים (An. gambiae ss ו. arabiensis בלבד), להגביר אזור איגוף SNPs באזור spacer intergenic (IGS), (פריימרים האו"ם [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; מצפה 390bp המוצר gambiae ss, 315bp arabiensis) ^10,11.
5. עבור ההקלדה פ פולימורפיזמים סמי התנגדות antifolate falciparum, לבצע PCR המקונן כדי להגביר אזור איגוף קודונים חומצת אמינו 108, 51, 59, 16 ו 164 בטפיל dihydrofolate רדוקטאז (DHFR) גן:
   עגולי פריימרים עיקריים: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] וM5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
   עגולים פריימרים שניים: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] עם F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
   או
   F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] עם M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
   גם להגביר אזור המכיל חומצת אמינו קודונים 436, 437, 540, 581 אnd 613 בפ synthetase גן falciparum dihydropteroate (DHPS):
   הסבב הראשוני פריימרים R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] עם R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
   פריימרים עגולים משניים
   J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] עם K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
   או
   K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] עם K /,
   או
   L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] עם L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] ^12.
6. 4 amplicon μl הכפוף לdigestions אלל הספציפי הגבלה באנזים 30 תגובות μl בעקבות הוראות היצרן, כדי לזהות פולימורפיזמים סמים antifolate התנגדות הקשורים ^12.
7. 5 μl הנושא של ה-PCR amplicon (או 15 μl הגבלת התקציר) לכל נתיב של 2% ג'ל ethidium רומיד המוכתם agarose לאלקטרופורזה (100 - 120V) ולדמיין להקות תחת קוף UV.

דוגמאות לתוצאות ממבחני PCR לאיכות תמצית ה-DNA יתוש (איור 1), זיהוי אנופלס arabiensis מולקולרי (איור 2) ופ falciparum זיהוי (איור 3) מראה ששיטת Chelex הפשוטה מניבה תוצאות דומות לרמת המלחה מתוך פרוטוקול ^10, למרות צעדים הרבה פחות (טבלה 1). עם איכות DNA דומה בתמציות בהתאמה, אין זה מפתיע כי שיעורים חיוביים לדוגמה ביחס ל. מיני אחי gambiae כמו גם שיעורי זיהום טפיל לא היו סטטיסטי המבוסס על בדיקת צ'י המרובעת של McNemar (איור 3) שונים.

רגישות (%) חושבת כTP / (TP + FN) * 100, שם מציין TP החיוביים אמיתית וFN מציין שליליים כוזבת. סגולי (%) נקבע כTN / (TN + FP) * 100, שם מציין TN תשלילים אמיתיים וFP מציין תוצאות חיוביות שגויות. איכות ה-DNA ( ND4) PCR הראה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישת Chelex השוואה להמלחה הוקם מתוך פרוטוקול כתקן זהב. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR.

התוספת של BSA לתערובות תגובה הביאה לעלייה כללית של התוצאות חיוביות PCR (איור 3) בשל הקלה של ה-PCR מעכבי ^14, לשניהם Chelex והסדיר פשט המלחה את הפרוטוקול. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטי, פרט לאיכות ה-DNA (ND4 PCR) על תמציות Chelex (p = 0.039). עיכול אנזים הגבלת אלל ספציפי בפ falciparum DHFR (או גן היעד אחר) amplicon מאפשר genotyping של זיהומי מלרית בלוטת אמצע בטן ורוק לאללים סמי התנגדות (איור 4; נתוני בלוטת רוק אינו מוצגים).

טבלת 1. הצעד אחר צעד השוואה של ריאגנטים ודרישות זמן לפרוטוקול Chelex פשוט ולעמודארד המלחה את השיטה להפקת דנ"א מדגימות יתושים.

איור 1. השוואת ND4 המיטוכונדריה PCR של DNA מאיכות הפשוטה Chelex "C" וסטנדרטי המלחה את התמציות "M" על דגימות שדה arabiensis אנופלס. NC שליטה, שלילית; M1 ו C1, C2 וM2, M3 ו-C3, ו M4 ו-C4 היא לזווג את ההמלחה ותמציות Chelex מאותה. דגימות יתושי arabiensis. L, סולם 100 נ"ב ה-DNA.

איור 2 המולקולרי זיהוי PCR לarabiensis אנופלס C1 ו M1, M2 וC2, C3 ו-M3, C4 ו M4 יסמנו amplicon המתאים מהמלחה החוצה "ז" ופשט תמציות Chelex "C" לאותן דגימות דנ"א יתושים;.. AR, אנופלס arabiensisביקורת חיובית; הליטר, 100 נ"ב סולם הדנ"א.

איור 3. איתור של תוצאות חיוביות על Chelex והמלחה החוצה תמציות DNA לדגימות שדה יתושים, עם מבחני PCR לזיהוי מולקולרי של אנופלס arabiensis (ע"ר) ^10, גן פרוקי רגלי NADH דהידרוגנז 4 (ND4) בדיקת איכות ה-DNA ^11, ו-P עמידות לתרופה antifolate . falciparum DHFR ¹² genotyping (F-M4). תוצאות מוצגות עבור מבחנים לרוץ עם או בלי BSA בתמהיל התגובה. מבחן צ'י המרובע של McNemar שמש כדי לקבוע אם ההבדלים בין אחוזי PCRs החיובי מהדנ"א שחולצו מן Chelex הפשוט והסטנדרטיים המלחה מתוך פרוטוקולים היו מובהקים סטטיסטי.

איור 4. יישום פשוט Chelex הפרוטוקול בgenotyping פ זיהומי falciparum ביתושים (נתוני אמצע הבטן מוצגים) עבור אללים עמידות לתרופה. אני עיכול BstN על amplicon איגוף קודון 108 לפ גן falciparum DHFR ¹² תערוכות מוטנטים S108T cycloguanil עמידים בדגימות יתושים (M1-M5; נתוני אמצע הבטן מוצגים). U, לא מעוכל 522 נ"ב amplicon; FCR3, המעבדה הסטנדרטית פ שיבוט falciparum חיובי שליטה נושא S108T; K1, פ falciparum מעבדה סטנדרטית שליטה שלילית שיבוט נושאה S108N cycloguanil רגיש; הליטר, 100 נ"ב סולם הדנ"א.

השיטה הפשוטה Chelex מוצגת כאן מאפשרת מיצוי של האיכות אנופלס spp ופ דנ"א falciparum מדגימות המתאימים ליישומים מגוונים PCR יתושים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת לזיהוי מולקולרי של יתושי מלרית וקטור ומעקב של פ העמיד לתרופות אללים falciparum ביתושים לתוכניות בקרת מלריה לאומיות. יתרונותיה של הטכניקה הפשוטה Chelex כוללים פשטות, ריאגנטים פחות ולכן עלות, בטיחות וזמן עיבוד קצר יותר (37 דקות) מפרוטוקולים סטנדרטיים כגון (47 דקות 2 שעות וצעד לילה, טבלת 1) המלחה את השיטה ^10. היתרונות הנ"ל והדרישות מינימאליות מגיבות (3 ריאגנטים) בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי (10 ריאגנטים, טבלת 1) ^11,15, להפיק את פרוטוקול Chelex הפשוט ידידותי במיוחד למעבדות במדינה אנדמית בי מגיבה מתמדתשרשרת אספקה ​​היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה. מגבלה של השיטה היא שכמו הפרוטוקול הסטנדרטי, זה היה גם נושא למעכבי PCR הידועים להתרחש בintegument יתושי ^16. עם זאת, זו היא קלה בקלות על ידי הוספה של BSA במבחנים. BSA גם הועסק בהצלחה כהגברה משפרת נגד מעכבים ביישומי PCR אחרים ^17,18.

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המחברים הם חבים לראשים, מוכתרים והקהילות של Macha לunwaveing ​​לשתף הפעולה במהלך אוספים לדוגמא שדה יתושים. ד"ר דאג נוריס ורבקה קנט הציע מומחיות רבה ערך על פרוטוקול ההמלחה החוצה. עבודה זו מומנה על ידי מערכת ג'ונס הופקינס מלרית מכון מחקר פיילוט המענק. סטנדרטי הטפיל DNA מעבדת יתושים ונתרמו באדיבות על ידי MR4 סוג, אמריקאי ואוספת תרבות.