Imaging micro-CT di un midollo spinale di topo

Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università del Connecticut, Storrs, Connecticut

È un fatto poco noto che la scoperta e l'uso (involontario) dei raggi X ha ottenuto il primo premio Nobel per la fisica. La famosa immagine a raggi X della mano della moglie del Dr. Röntgen del 1895 che ha inviato onde d'urto attraverso la comunità scientifica assomiglia alla maggior parte delle moderne immagini a raggi X medici 2D. Sebbene non sia la tecnologia più recente, l'imaging ad assorbimento di raggi X è uno strumento indispensabile e può essere trovato nei migliori laboratori di ricerca e sviluppo e università del mondo, ospedali, aeroporti, tra gli altri luoghi. Probabilmente gli usi più avanzati dell'imaging ad assorbimento dei raggi X comportano il raggiungimento di informazioni come quelle che si trovano in una radiografia medica 2D ma realizzate in 3D attraverso una tomografia computerizzata (TC o micro-CT). Prendendo una serie di proiezioni a raggi X 2D, il software avanzato è in grado di ricostruire i dati per formare un volume 3D. Le informazioni 3D possono, e molto probabilmente includeranno informazioni dall'interno dell'oggetto sondato senza dover essere tagliate. Qui si otterrà una scansione micro-CT e verranno discussi i principali fattori che influiscono sulla qualità dell'immagine.

I raggi X possono essere visti come fotoni con un intervallo di energia di 0,1 - 100 keV o onde elettromagnetiche con lunghezze d'onda che vanno da 0,01 a 10 nm. I raggi X possono essere creati in diversi modi, ma qui la discussione è limitata all'imaging a raggi X a fascio cono a spettro continuo. Questi raggi X sono creati da un fenomeno noto come "Bremsstrahlung", che significa "radiazione frenante" in tedesco. Ciò si verifica quando una particella carica subisce un'accelerazione [1]. In una sorgente di raggi X, un elettrone caricato negativamente viene sparato in un tubo a vuoto e colpisce un materiale bersaglio (di solito tungsteno, molibdeno, rame o un altro metallo) e, attraverso la sua decelerazione, emette fotoni sulla scala di un raggio X. Uno spettro continuo di raggi X viene generato perché la decelerazione non è uniforme né istantanea, anche se ci sono picchi nella distribuzione centrati attorno alle energie caratteristiche del materiale bersaglio come visto in [2]. Ci sono diverse curve per diverse energie e materiali target. Questa è una cosa molto importante da considerare quando si esegue una scansione micro-CT e sarà discussa in una sezione successiva.

Un tipico sistema micro-CT presenta tre componenti principali, come mostrato in [3]. I componenti di base di questo sistema includono: a) sorgente di raggi X, b) stadio di rotazione per il montaggio del campione e c) schermo piatto o obiettivo ottico con rivelatori CCD. I raggi X lasciano la sorgente e vengono assorbiti, trasmessi o dispersi dal campione prima di arrivare al rilevatore. L'assorbimento è l'interazione predominante misurata in microCT, poiché diversi materiali nel corpo assorbono i raggi X in modo diverso. Ad esempio, le ossa contengono molto calcio atomico, che assorbe bene i raggi X. Pertanto, le ossa impediscono ai raggi X di raggiungere il rilevatore e finiscono per apparire nell'immagine come un'ombra. Il campione viene quindi ruotato in modo incrementale e il processo viene ripetuto fino a quando il campione non è stato ripreso per 360 ° o, in alcuni casi, 180 °. L'output della tomografia è una serie di proiezioni 2D a diversi orientamenti che possono essere ricostruite in un volume 3D.

La micro-TC è una forma di microscopia, che prende il nome dalla sua capacità di risolvere le caratteristiche su microscala. La limitazione della risoluzione per questa specifica categoria di micro-TC è regolata dalla dimensione dello spot della sorgente e dalla diffusione dell'energia, dal tipo e dall'efficacia del rivelatore; non dalla lunghezza d'onda dei raggi X. La migliore risoluzione possibile per questa categoria di micro-CT è di circa 500-700 nm in tre dimensioni. Tuttavia, è possibile rilevare caratteristiche di un decimo o centesimo di quella dimensione.

L'ingrandimento viene eseguito nella maggior parte dei sistemi CT mediante ingrandimento geometrico. L'immagine in [3] illustra l'idea di ingrandimento geometrico. È facilmente immagino come un effetto ombra. Più una fonte di luce è vicina a un oggetto; più grande sarà l'ombra dell'oggetto su un muro o uno schermo. Allo stesso modo, se quella parete o schermo dovesse allontanarsi dalla sorgente luminosa fissa e dal campione, l'ombra dell'oggetto aumenterebbe di dimensioni ma diventerebbe più debole. Ottimizzare le distanze di lavoro della sorgente di raggi X e del rivelatore è un compito molto impegnativo e mentalmente stimolante quando si desidera un segnale sufficiente, un'alta risoluzione e un breve tempo di scansione. Come per qualsiasi cosa, ci sono limitazioni all'ingrandimento geometrico, in cui l'idealizzazione di una sorgente puntica viene distrutta e le aberrazioni diventano prepotenti.

Una delle tante sfide nella micro-TC è che la qualità visiva del volume 3D sarà in qualche modo sconosciuta allo sperimentatore fino a quando la scansione non sarà terminata e ricostruita. Tuttavia, con sufficiente esperienza, un attento esame di alcune proiezioni 2D può fornire informazioni sufficienti per sentirsi sicuri di una scansione TC. Nelle sezioni seguenti, una serie di esercizi scoprirà gli effetti di diversi parametri di imaging su un set di dati e fornirà a uno scienziato la comprensione necessaria per ottenere un volume 3D pulito. Ai fini di questa indagine, i campioni biologici saranno sondati anche se la procedura non è limitata a un tipo di campione.

Montare un campione sembra un passaggio banale ma è uno dei più importanti e trascurati. Indipendentemente dall'applicazione, il campione deve essere montato nel modo più compatto possibile. Considerando l'immagine in [3], immagina se la gamma di posizioni della sorgente e del rivelatore fosse limitata perché il campione sporgeva in una direzione e come ciò influenzerebbe l'ingrandimento geometrico. Oltre alla distanza di lavoro, il montaggio influisce notevolmente sulla produttività. Se il campione fosse un'articolazione del ginocchio intatta di un ratto, avrebbe senso montare il campione in modo che la tibia e il femore stessero in posizione verticale. In questo modo, i raggi X passerebbero attraverso una breve distanza e ci sarebbe un segnale sufficiente al rilevatore. L'ultima cosa da considerare quando si monta un campione è la stabilità. Il più grande nemico della micro-TC è il movimento. Se l'entità del movimento del campione si avvicina alla risoluzione della scansione, probabilmente saranno dati inutili. Il movimento dovrebbe essere limitato dall'adesione sicura a un supporto e dal controllo del cambiamento di composizione del campione. Per i campioni biologici, ciò significa assicurarsi che non cambierà la morfologia attraverso l'evaporazione per tutta la durata della scansione. La sospensione in gel di acarosio o l'avvolgimento in un sottile strato di film di paraffina sono entrambi possibili approcci per evitare disidratazione e movimento.

L'energia dei raggi X avrà anche un grande effetto sulla qualità del volume 3D finale. L'obiettivo è quello di acquisire un segnale sufficiente al rivelatore pur avendo un'attenuazione sufficiente dal campione. L'attenuazione dei raggi X segue l'equazione (1), dove I è il numero finale di conteggi (intensità), I₀ è il numero iniziale di conteggi, μ è il coefficiente di assorbimento di massa che è unico per un dato materiale e l'energia dei raggi X (ampiamente pubblicato), ρ è la densità del materiale e x è la lunghezza del percorso dei raggi X.

 (1)

Idealmente, I/I₀ (ovvero il valore di trasmissione) dovrebbe essere compreso tra il 5 e il 95% per tutto l'orientamento del campione, con i migliori risultati intorno alla gamma media. Per verificare questo valore, prendere un'immagine del campione e quindi dividere i valori dei pixel dell'immagine per un'immagine dell'aria (cioè con il campione al di fuori del campo visivo). Questa normalizzazione si trova comunemente nei flussi di lavoro del software di sistema. Non è spesso che i campioni biologici richiedano l'uso del filtraggio a raggi X alla fonte, quindi non sarà trattato qui. Oltre ad avere un valore di trasmissione ideale, il numero ideale di conteggi per qualsiasi parte del campione è di 5000 conteggi. Per garantire ciò, potrebbe essere necessario aumentare il tempo di esposizione per proiezione. Ciò aumenterà il tempo di scansione complessivo. La Figura 1 mostra proiezioni 2D pulite.

Figura 1: Immagini 2D del midollo spinale del topo normalizzato contro l'aria a 0° (a sinistra) e 90° (a destra).

1. Montaggio di un campione (osso)

1. Per esaminare una rete di ossa, come una colonna vertebrale, sospendere la struttura in un gel di acarosio e consentire di polimerizzare in un tubo di plastica a pareti molto sottili (Figura 2). La sottigliezza del tubo è molto importante, influenzando notevolmente il throughput del segnale e la qualità complessiva dell'immagine. Questo a sua volta influisce sulla capacità di risolvere le funzionalità. Il valore di trasmissione del tubo dovrebbe essere il più vicino possibile al 100%.
2. Montare il tubo sul palco del campione con del nastro adesivo o creando un supporto personalizzato, assicurando in definitiva che il campione sia fermo e stabile quando lo stadio ruota.

Figura 2: Spina dorsale del topo sospesa in gel di agarose all'interno di un tubo di plastica a parete sottile seduto sullo stadio campione del sistema micro-CT.

2. Acquisizione di immagini

1. Accendere la sorgente di raggi X a un'energia intorno all'intervallo di 90 keV (90 kV e 10 W).
2. Dopo che la sorgente si è riscaldata e si è depositata sull'energia, acquisire un'immagine attraverso il software del sistema.
3. Controllare il valore di trasmissione normalizzando l'immagine rispetto a un'immagine di aria. Per l'acquisizione e l'applicazione automatica dei riferimenti, assicurarsi che il campione possa muoversi in una determinata direzione senza arresti anomali.
4. Se l'immagine ha una trasmissione troppo alta, abbassare l'energia in modo incrementale fino a quando il valore di trasmissione è sufficiente. Assicurati di aumentare il tempo di esposizione di conseguenza in modo che l'immagine non appaia rumorosa e sgranata. Se l'immagine ha una trasmissione troppo bassa, aumentare l'energia in modo incrementale fino a quando il valore di trasmissione è sufficiente.
5. Inizia a spostare la sorgente di raggi X più vicino al campione, facendo molta attenzione a non farli schiantare. Portare la sorgente il più vicino possibile al campione è un passo nella direzione di massimizzare la produttività e garantire la migliore risoluzione possibile.
6. Mentre questo viene fatto, perfezionare il campo visivo del campione spostando lo stadio del campione con i suoi attuatori lineari.
7. Il software mostrerà un parametro noto come dimensione dei pixel che viene trattato in modo simile alla risoluzione corrente (anche se è effettivamente diverso).
   1. Se il numero è ancora troppo grande e la sorgente è molto vicina, il rilevatore può iniziare ad allontanarsi dal campione.
   2. Se il numero è troppo piccolo, avvicinare con cautela il rilevatore al campione.
   3. Prova anche diversi obiettivi ottici e posizioni del rilevatore, ma fai attenzione alla complicazione che questo introduce quando cerchi di ottimizzare i parametri di scansione.
8. Controlla ogni orientamento del campione per assicurarti che non ci siano arresti anomali per trovare il miglior tempo di esposizione. Questa applicazione viene eseguita a causa della modifica della distanza di lavoro, delle dimensioni dei pixel e della posizione del campione.
9. Ruotare lentamente il campione con incrementi di 2 gradi mentre si monitora la sua posizione rispetto alla sorgente e al rilevatore tramite la telecamera in-cabinet. Assicurati di spostare la sorgente e il rilevatore se potrebbe verificarsi una collisione.
10. Trova la lunghezza del percorso dei raggi X più lunga che si traduce nel numero più basso di conteggi / valori di trasmissione e trova il tempo di esposizione necessario per garantire circa 5000 conteggi ovunque.

3. Presentazione e ricostruzione della tomografia

Il processo di ricostruzione dal punto di vista dell'utente non è più complicato di qualsiasi altra selezione di parametri effettuata nei passaggi precedenti. Tuttavia, la spesa di programmazione e computazionale per questo processo è in realtà piuttosto sostanziale. Gli utenti devono mirare a comprendere meglio cosa sta succedendo sotto l'interfaccia utente del software e in che modo le decisioni influiscono sul prodotto finale. Molti sistemi CT utilizzano algoritmi di ricostruzione algebrica iterativa in cui le proiezioni 2D vengono convertite in una serie di equazioni lineari che descrivono i valori dei pixel. Alcuni altri sistemi utilizzano algoritmi di retroproiezione filtrati in cui le trasformazioni di Radon convertono le proiezioni in un sinogramma e vengono quindi passate attraverso una serie di operazioni di integrazione della linea. Naturalmente, alcuni usano altri approcci e persino metodi ibridi. Al livello più basso di coinvolgimento con questi algoritmi, è noto che il numero di proiezioni e lo spostamento totale ruotato hanno un impatto sul volume finale ricostruito.

1. Innanzitutto, decidi se eseguire la scansione a 180 ° o 360 ° in base alle proporzioni del campione. Se il campione ha un rapporto di aspetto elevato in modo tale che la lunghezza del percorso dei raggi X sia circa 4 o più volte più lunga con l'orientamento a 90 ° rispetto all'orientamento a 0 ° rispetto a una scansione a 180 ° sarebbe una scelta intelligente. (L'argomento è che le informazioni raccolte sulla breve lunghezza del percorso dei raggi X non sono così diverse da una parte all'altra. Se è possibile dedicare più proiezioni agli orientamenti lunghi della lunghezza del percorso dei raggi X rispetto al set di dati. Lo spostamento angolare tra le proiezioni sarà inferiore e ci saranno più informazioni da quegli orientamenti difficili che vengono inseriti negli algoritmi di ricostruzione.) Se le proporzioni non sono così elevate, utilizzare scansioni a 360 °.
2. Quindi, scegli il numero di proiezioni e lo spostamento angolare totale, che determinerà l'angolo tra le proiezioni. Più piccolo è questo angolo, minore sarà l'interpolazione che verrà condotta e meno informazioni sulle feature fini verranno troncate. (È necessario stabilire un equilibrio perché più proiezioni significano un tempo di scansione più lungo, che è correlato a una finestra più grande in cui i campioni possono muoversi, meno tempo per scansionare altre cose e una durata della sorgente più breve. Una regola empirica è quella di avere almeno 800 proiezioni oltre i 360° e di non superare le 3200 proiezioni.
3. Invia la scansione.
4. Al termine della tomografia (di solito tra 4 e 16 ore), portare serie di immagini 2D nel software di ricostruzione del sistema (o di alcuni open source).
5. Selezionare la correzione ottimale dello spostamento centrale. Lo spostamento centrale è un parametro che allinea i progetti da allineare (pensa a un mazzo di carte mescolato approssimativamente che deve essere raccolto e allineato per sedersi come una pila ordinata). Questo valore è in genere compreso tra -10 e 10 pixel.
6. Selezionare il coefficiente di correzione ottimale per l'indurimento del fascio. La correzione dell'indurimento del fascio è una rimozione artificiale del contrasto prodotta dal filtraggio del campione. Se un campione è abbastanza spesso o contiene una gamma di materiali leggeri e pesanti, avrà un falso contrasto basato sull'attenuazione dei raggi X (morbidi) a bassa energia. Questo dovrebbe essere applicato in modo conservativo. Un valore medio è compreso tra 0 e 0,5.
7. Invia ricostruzione.

Le seguenti immagini forniscono una panoramica dei risultati che possono essere ottenuti utilizzando la micro-TC con la procedura sopra indicata. Misurazioni qualitative sull'assorbimento variabile possono essere notate direttamente sulla base di queste immagini. Dati quantitativi come la porosità del materiale, le dimensioni e la distribuzione delle caratteristiche, ecc. Richiederebbero un'ulteriore elaborazione delle immagini in un software diverso.

Figura 3: Volume 3D del midollo spinale del topo (a sinistra) e due sezioni di sezione trasversale digitali (a destra)

Questo esperimento ha esaminato i molti fattori che dovrebbero essere considerati quando si utilizza la micro-TC, in particolare per un campione biologico. Questo progetto è stato progettato per aiutare lo sperimentatore a capire come le loro decisioni avranno un impatto sui dati che la micro-CT può fornire. Come dimostrato, ci sono molti parametri dipendenti e sensibili che dovrebbero essere considerati, tra cui: montaggio, energia a raggi X, tempo di esposizione, posizionamento della sorgente e del rilevatore, numero di proiezioni e spostamento angolare totale della scansione. Questo esercizio è inteso come un'introduzione e graffia solo la superficie di controllo su un set di dati CT.

Questo esperimento si è concentrato sul dare un'introduzione alla micro-TC rispetto all'imaging di un campione biologico, ma l'applicazione della tomografia a raggi X 3D si estende ai mondi della microelettronica, della geologia, della produzione additiva, dei rivestimenti, delle celle a combustibile e molto altro ancora. Questi microscopi sono utilizzati per l'ispezione, l'analisi dei guasti, la caratterizzazione, il controllo qualità e persino i test non distruttivi. Poiché le informazioni reali 3D sono ora accessibili in modo non distruttivo, le geometrie estratte dalla TC possono essere importate in simulazioni in cui gli oggetti possono essere testati virtualmente.