Analisi della curva di crescita batterica e sue applicazioni ambientali

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

I batteri sono tra le forme di vita più abbondanti sulla Terra. Si trovano in ogni ecosistema e sono vitali per la vita di tutti i giorni. Ad esempio, i batteri influenzano ciò che le persone mangiano, bevono e respirano, e in realtà ci sono più cellule batteriche all'interno del corpo di una persona rispetto alle cellule di mammifero. A causa dell'importanza dei batteri, è preferibile studiare particolari specie di batteri in laboratorio. Per fare questo, i batteri vengono coltivati in condizioni controllate in coltura pura, il che significa che è in esame un solo tipo di batterio. I batteri crescono rapidamente in coltura pura e il numero di cellule aumenta drasticamente in un breve periodo di tempo. Misurando il tasso di aumento della popolazione cellulare nel tempo, si deve sviluppare una "curva di crescita". Questo è importante quando si mira a utilizzare o inoculare numeri noti dell'isolato batterico, ad esempio per migliorare la crescita delle piante, aumentare la biodegradazione di sostanze organiche tossiche o produrre antibiotici o altri prodotti naturali su scala industriale.

La riproduzione batterica avviene tramite fissione binaria, in cui una cellula batterica si divide e diventa due cellule (Figura 1). Il tempo necessario per la divisione cellulare è noto come tempo medio di generazione, o tempo di raddoppio, che è il tempo necessario affinché il numero di cellule raddoppi.

Figura 1. Divisione cellulare esponenziale. Ogni divisione cellulare si traduce in un raddoppio del numero di celle. A bassi numeri di cellule, l'aumento non è molto grande; tuttavia, dopo alcune generazioni, il numero di cellule aumenta in modo esplosivo. Dopo n divisioni, ci sono 2ⁿ celle.

Per comprendere e definire la crescita di particolari microrganismi, vengono posti in un pallone, dove vengono controllati l'apporto di nutrienti e le condizioni ambientali. Se il mezzo liquido fornisce tutti i nutrienti necessari per la crescita e i parametri ambientali favorevoli alla crescita, l'aumento del numero può essere misurato in funzione del tempo per ottenere una curva di crescita. Diverse fasi di crescita distinte possono essere osservate all'interno di una curva di crescita (Figura 2). Questi includono la fase di ritardo, la fase esponenziale o logaritria, la fase stazionaria e la fase di morte, ognuna delle quali è associata a specifici cambiamenti fisiologici (Tabella 1).

Tabella 1. Le quattro fasi della crescita batterica.

Figura 2. Una curva di crescita tipica per una popolazione batterica. Confronta la forma delle curve in base alle unità formanti colonie (CFU) rispetto alla densità ottica, in particolare nella fase di morte. La differenza è dovuta al fatto che le cellule morte provocano ancora torbidità, ma non possono formare colonie vitali in coltura.

Nel complesso, è spesso fondamentale determinare la cinetica di crescita batterica per un dato isolato batterico, al fine di conoscere il numero di cellule batteriche presenti nel mezzo liquido. Esistono diversi modi per misurare la crescita in un mezzo liquido, comprese le misurazioni della torbidità utilizzando uno spettrofotometro colorimetrico e la placcatura di diluizione seriale. Le misurazioni della torbidità si basano sul fatto che più cellule sono presenti nel mezzo liquido, più torbido diventa il liquido. La placcatura di diluizione seriale comporta l'analisi del numero di cellule nel mezzo liquido che possono formare colonie vitali su coltura solida, una misura nota come "unità formanti colonie" della coltura. Si noti, tuttavia, che tali saggi di placcatura possono essere utilizzati solo per batteri che sono, di fatto, coltivabili.

1. Raccolta delle aliquote di coltura batterica

1. Un giorno prima della raccolta dei punti temporali di crescita, inoculare 20 mL di brodo di soia triptasi (TSB) in un matraccio da 50 ml con E. coli.
2. Incubare durante la notte a 27 °C. Questo periodo di incubazione relativamente lungo si traduce in una popolazione in fase stazionaria di E. coli selvatico di circa 10⁹ CFU/ml.
3. Il giorno seguente, utilizzare 100 μL della coltura preparata per inoculare 250 mL di TSB (in un matraccio da 500 mL). Mescolare accuratamente.  Rimuovere un'aliquota di 5 ml e conservare immediatamente in frigorifero a 4 °C. Questo è T = 0 o T₀ punto temporale e dovrebbe contenere circa 4 x 10⁵ CFU / mL.
4. Collocare il matraccio del rimanente E. coli (245 ml) in un incubatore vibrante a 37 °C. Rimuovere aliquote di coltura da 5 ml ogni ora, fino a 8 ore. Conservare ogni aliquota a 4 °C. Designare queste aliquote da T₁ a T₈.

2. Diluizione seriale

1. Rimuovere le aliquote di E. coli dal frigorifero e metterle sul ghiaccio per il trasporto. Mantenere tutte le colture sul ghiaccio fino all'uso.
2. Impostare una serie di tubi di diluizione per ottenere varie diluizioni di ciascuna coltura di E. coli (Figura 3). I tubi microfuga sono convenienti per questa funzione. Ogni tubo di diluizione deve avere 900 μL di liquido di diluizione (soluzione salina sterile). È necessaria una serie di diluizioni per ogni coltura di E. coli (da T₀ a T_8); etichettare ogni tubo secondo la Tabella 2.
   
   Figura 3. Schema che mostra la procedura per la placcatura di E. coli.
3. Iniziare le diluizioni aggiungendo 100 μL di E. coli dal tubo etichettato T₀ (la coltura iniziale di E. coli) al tubo A, che è la diluizione 10^-1 di T₀. Vortice il tubo per 5 s.
4. Successivamente, aggiungere 100 μL di Tubo A al successivo tubo di soluzione salina, Tubo B, che è la diluizione 10^-2 di T₀. Continuare la serie di diluizione necessaria per ogni aliquota del punto temporale. Ricorda di vorticosare ogni tubo prima del trasferimento. È anche importante utilizzare una nuova punta della pipetta per ogni trasferimento.

Tabella 2. Serie di diluizione richieste per ogni coltura di E. coli.

3. Placcatura

1. Saranno placcate tre diluizioni per ogni aliquota del punto temporale di coltura di E. coli, secondo la Tabella 3. Etichettare le piastre con il punto temporale (da T₁ a T_8),il fattore di diluizione e il volume da aggiungere. Utilizzare piastre triplicate per ogni diluizione.
2. Aggiungere 100 μL di ogni diluizione alla piastra pipettando la quantità al centro della piastra di agar (Figura 3). Distribuire immediatamente l'aliquota utilizzando un'asta di vetro a forma di "L" sterilizzata a fiamma. Se l'aliquota non viene diffusa immediatamente, assorbe in situ sulla piastra, con conseguente crescita eccessiva batterica nel punto di inoculazione iniziale.
3. Ripetere la placcatura per ogni serie di diluizione per i punti temporali da T₁ a T₈. Ricordarsi di sterilizzare l'asta tra le piastre e soprattutto tra le diverse diluizioni.
4. Una volta che le piastre si sono asciugate per alcuni minuti, invertire e posizionare in un incubatore a 37 °C durante la notte. L'inversione delle piastre impedisce alla condensa di cadere sulla piastra di agar. Dopo l'incubazione notturna, le piastre devono essere conservate in frigorifero.

^* Le diluizioni più basse tengono conto delle popolazioni più basse a causa della fase di morte.

Tabella 3. Protocollo di placcatura per colture di E. coli.

4. Conteggio delle colonie e calcolo del tempo medio di generazione

1. Esaminare le piastre per l'uniformità delle colonie e la mancanza di contaminazione.
2. Per ogni punto temporale (da T₀ a T_8),scegli una diluizione che contiene tra 30 e 300 colonie e conta le piastre triplicate.
3. Utilizzando il fattore di diluizione, calcolare a ricalcolo il numero di cellule per mL di coltura originale nei punti temporali da T₀ a T₈. Ad esempio, se il numero di colonie risultanti da una diluizione^{10 -4} è 30, 28 e 32:
   Numero medio di colonie = 30 colonie
   Questi sono nati da 0,1 ml di una diluizione 10^-4
   Numero di colonie per mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Plot log₁₀ CFU/mL rispetto al tempo (in ore).
5. Dal grafico, identifica la fase esponenziale della crescita. Utilizzando 2 punti temporali all'interno della fase di crescita esponenziale e i numeri di cella corrispondenti in ogni momento, calcolare il tempo medio di generazione.

A seguito di un esperimento di placcatura di diluizione seriale, sono stati ottenuti i seguenti dati. All'inizio della crescita esponenziale qui designata come tempo t = 0, la concentrazione iniziale di cellule batteriche è di 1.000 CFU / mL. Al tempo t = 6 h, la concentrazione delle cellule è di 16.000 CFU/mL.

Ora, X = 2ⁿ x X₀

Dove: X₀ = concentrazione iniziale di cellule = 1.000 CFU/mL
X = concentrazione di cellule dopo il tempo t = 16.000 CFU/mL
n = numero di generazioni
16.000 = 2ⁿ x 1.000
2ⁿ = 16
log₁₀ 2ⁿ = log₁₀ 16
n x 0,301 = 1,204
n = 1,204 = 4
0.301

Sono trascorse quattro generazioni in 6 ore, quindi

Tempo medio di generazione = 6/4 = 1,5 h.

Figura 4. Un nodulo radicale che contiene batteri che fissano l'azoto.

La conoscenza della cinetica di crescita batterica e dei numeri batterici in un terreno di coltura è importante sia dal punto di vista della ricerca che da quello commerciale. Nella ricerca, è spesso fondamentale conoscere il numero di batteri in un campione, in modo che l'esperimento possa essere replicato, se necessario, con gli stessi identici numeri. Ad esempio, durante gli esperimenti in cui gli inoculanti batterici vengono aggiunti a un appezzamento di terreno, è necessario aggiungere un minimo di^{10 4} CFU per grammo di terreno per ottenere l'effetto desiderato, come una maggiore biodegradazione dei contaminanti organici tossici del suolo. Un altro esempio è il caso degli inoculanti rizobiali prodotti commercialmente, in cui un numero noto di rizobia (batteri che entrano in relazioni simbiotiche con le radici delle piante) sono impregnati in un mezzo di carbonio a base di torba (Figura 4). Il mezzo viene quindi utilizzato per inoculare i semi di legumi per migliorare la fissazione biologica dell'azoto(cioèla conversione dell'azoto molecolare in forme organiche che possono essere utilizzate dagli organismi come nutrienti).

La cinetica di crescita è anche utile per valutare se particolari ceppi di batteri sono adattati per metabolizzare determinati substrati, come i rifiuti industriali o l'inquinamento da petrolio. I batteri geneticamente modificati per ripulire le fuoriuscite di petrolio, ad esempio, possono essere coltivati in presenza di idrocarburi complessi per garantire che la loro crescita non sia repressa dagli effetti tossici del petrolio. Allo stesso modo, la pendenza e la forma delle curve di crescita prodotte da batteri cresciuti con miscele di prodotti di scarto industriale possono informare gli scienziati se i batteri possono metabolizzare la particolare sostanza e quante potenziali fonti di energia per i batteri possono essere trovate nella miscela di rifiuti.