Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Corneali cellule epiteliali (PEC) sono continuamente capannone in film lacrimale, mentre sono allo stesso tempo sostituite da cellule del limbus e corneali strati basali epiteliali. ¹ vari fattori di stress estrinseci possono indurre l'apoptosi e desquamazione della CEC. ² Le proteine da shock termico (HSP) sono altamente conservati e possono essere suddivisi in due famiglie secondo dimensione molecolare. ³ la più grande famiglia HSP comprende HSP90, HSP70 e HSP60, e la famiglia più piccola comprende HSP27. ⁴ la fosforilazione di HSP27 è noto a svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare ed è necessario per la migrazione delle cellule a causa del ruolo di questa proteina in actina rimodellamento. ^5-7 Pertanto, abbiamo cercato di verificare il ruolo potenziale di HSP27 fosforilazione nella migrazione CEC e l'apoptosi in un modello in vitro di cellule epiteliali guarigione della ferita.

RNA interference (RNAi) utilizzando sia piccoli o brevi RNA interferenti (siRNA) ha geinteressi nerated sia in biologia di base e applicata, in quanto consente potenzialmente l'espressione di un gene di interesse da abbattuto. ⁸ In ^questo, abbiamo usato specifici siRNA-HSP27 per valutare il contributo di HSP27 a CEC guarigione della ferita e l'apoptosi. i metodi tradizionali per RNAi gene knock-down in cellule utilizzano duplex RNA sintetici, tra cui due non modificati oligonucleotidi 21-mer che possono essere assemblati per creare siRNA. La RNAi siRNA che abbiamo usato in questo studio è un metodo semplice e molto efficace trasfezione le cellule, e questo reagente funziona con varie linee cellulari immortalizzate. In questo studio, abbiamo dimostrato i metodi utilizzati per questa analisi, tra cui un saggio di zero-indotta ferita direzionale, western blotting, saggio di transfezione siRNA, test di immunofluorescenza e citometria a flusso.

1. Cell Line

1. Culture 10 ⁶ umani corneali cellule epiteliali telomerasi-immortalata (HCECs) in un 6-pozzetti (densità: 1039,9 cellule / mm ²⁾ in un incubatore a 37 ° con un'atmosfera 5% di CO ₂ con terreno di crescita dell'epitelio bronchiale (BEGM) fino raggiungono il 95% di confluenza.

2. Analisi Western Blot dopo aver creato epiteliali Ferite Scratch

1. Streak uno sterile 200 ml punta della pipetta sulla superficie di un pozzo di confluenti HCECs coltivate quattro volte al piatto in un armadio di sicurezza biologica (Classe II, Tipo A2) e incubare HCECs separatamente in un incubatore a 37 ° con un CO ₂ atmosfera 5% per 1, 5, 10, 30, 60 e 120 min.
2. Utilizzare una piastra da 6 pozzetti per sei campioni differenti a seconda del tempo di incubazione dopo corneale ferimento epiteliale.
3. Lavare feriti monostrati HCEC tre volte con PBS 1x e quindi aggiungere 2,0 ml BEGM in ogni pozzetto.
4. Staccare HCECs utilizzando 2ml 0,25% di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml.
5. Sospendere HCECs con 1 ml di PBS 1x e trasferirli in una provetta da 1,5 ml.
6. Centrifuga HCECs a 10.000 xg per 15 sec e aspirare 1x PBS utilizzando una pipetta 1 ml.
7. Risospendere HCECs in 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF], inibitori della proteasi [1 micron pepstatina A, 1 pM leupeptina, e 0,1 pM aprotinina] e 0,5% Triton X-100 [pH 7]) e mescolare bene.
8. Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare.
9. lisati centrifugare a 4 ° C a 10.000 xg per 15 minuti, e poi il trasferimento a surnatanti freschi provette da 1,5 ml (90 aliquote microlitri) e conservarli a -80 ° C.
10. Determinare le concentrazioni di proteine ​​totali di lisati cellulari che utilizzano il pr Bradfordsaggio otein. ⁹
11. Carico 30 mg proteine ​​cellulari totali in un gel di acrilammide 10% o 12% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE) e quindi elettroforesi trasferimento separate bande proteiche filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C da utilizzare in saggi di Western blot.
12. Blocco di nitrocellulosa membrane filtranti con il 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi policlonali di coniglio primaria contro i non-fosforilata HSP27 (1: 1.000 diluizione) o primaria anticorpo policlonale di coniglio contro fosforilata HSP27 (1 : 1.000 diluizione) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), e incubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore.
13. Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio per 10 minuti 3 volte con TBST.
14. Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente.
15. Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica.
16. Lavorare in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana ricoperta di una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l'alto di proteine.
17. Posizionare pellicola a raggi X in cima a membrana ed esporre per 1 min.

3. siRNA Transfection Assay ¹⁰

1. HCECs Culture a 5 × 10 ⁵ cellule / pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in un incubatore a 37 ° con un'atmosfera 5% CO ₂ utilizzando BEGM fino a raggiungere il 95% di confluenza.
2. Diluire il reagente di trasfezione (2.5 o 7.5 ml) con 100 ml riduzione media siero per trasfezione (il fattore di diluizione è 41 o 14.3) e sciogliere il HSP27-specifica e strapazzate controllo siRNA in 100 ml di medio siero ridotto per creare 10 o 50 nm di specifici HSP27 e si arrampicò di controllo siRNA.
3. Mescolare 100 μ; L soluzione siRNA con 100 microlitri di reagente diluito trasfezione (rapporto 1: 1) e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere i complessi siRNA-lipidi alle cellule. Poi, dopo 4 mezzi di modifica ore per completare BEGM e incubare le cellule per 2 giorni a 37 ° C.
5. Analizzare le cellule trasfettate mediante western blotting, come descritto dalle sezioni da 4.1 a 4.7.

4. Western Blot test per celle siRNA-trasfettate ¹¹

1. Estrarre specifici HSP27 e strapazzate controllo HCECs siRNA-trasfettate in una cappa di sicurezza biologica con 100 microlitri tampone di lisi ghiacciata (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), inibitori della proteasi, e 0,5% Triton X-100, pH 7).
2. Incubare le cellule per 30 min in ghiaccio per indurre lisi cellulare.
3. lisati pellet a 10.000 xg per 15 minuti e poi trasferire surnatanti di fresco 1,5 ml vascaes (90 microlitri aliquote) e conservarli a -80 ° C.
4. Determinare le concentrazioni di proteine dei lisati cellulari che utilizzano il Metodo di Bradford. ⁹
5. Caricare i campioni con la stessa quantità di proteine ​​cellulari totali su un gel di acrilammide 10% o 12%, sottopongono il gel di SDS-PAGE, e trasferire elettroforeticamente le bande proteiche separate su filtri di nitrocellulosa con una corrente di 200 mA per 1 ora a 4 ° C a utilizzare nei test Western blot.
6. Blocco membrane filtranti di nitrocellulosa con 5% di latte scremato in soluzione salina Tris tamponata con Tween 20 (TBST) per 1 ora, aggiungere anticorpi primari contro fosforilata e non fosforilata HSP27 (1: 1000 diluizione), fosforilata Akt (1: 1000 diluizione), non fosforilata Akt (1: 1000 diluizione, usato come marcatore sopravvivenza cellulare), Bcl-2 associata X proteina (1: 1000 diluizione, usato come una proteina pro-apoptotica) e gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1 : 200 diluizione, usato come controllo di carico) in 5% di albumina di siero bovino (BSA), eincubare le membrane notte a 4 ° C su un agitatore.
7. Rileva bande immunoreattive con rafano anticorpi di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi (1: 10.000) diluizione in 5% di BSA dopo il lavaggio 3 volte con TBST, 10 minuti ogni lavaggio.
8. Incubare la membrana nei reagenti luminol Western blotting (6-7 ml per 10 cm cm x 5 cm membrane) per 1 min a temperatura ambiente.
9. Rimuovere la membrana dalla soluzione del reagente, rimuovere il liquido in eccesso con un panno assorbente, e posto in un protettore foglio di plastica.
10. Lavorando in una stanza buia con una luce di sicurezza, posizionare la membrana coperto in una cassetta pellicola con il lato rivolto verso l'alto proteine.
11. Posizionare pellicola per raggi X sulla parte superiore della membrana ed esporre per 1 min.

5. Scratch-indotta direzionale Ferimento test di valutazione della migrazione delle cellule ¹²

1. In una cappa di sicurezza biologica, fare una ferita trascinando una punta di pipetta sterile attraverso la superficie di un pozzo di culture confluenti dispecifici HSP27 siRNA-trasfettate o HCECs siRNA-trasfettate controllo strapazzate.
2. Subito dopo il ferimento, lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS) e mantenerli nelle culture BEGM in un incubatore a 37 ° con un CO ₂ atmosfera 5% per 24 ore dopo il ferimento.
3. Fotografare immagini HCEC utilizzando un microscopio in posizione verticale a ingrandimento 100X 24 ore dopo il ferimento ed eseguire sfondo appiattimento utilizzando il filtro comando nel software di analisi delle immagini.
4. Utilizzando il comando SELECT Misure, definire l'area di interesse (AOI), con la stessa forma poligonale dimensioni che possono coprire perpendicolarmente da un capo all'altro della ferita iniziale, e determinare tre diversi AOI nella zona ferita di ciascun campione.
5. contare automaticamente il numero di cellule in ogni campo usando il conteggio / Dimensioni opzioni di menu Misura.

6. flusso Analisi Citometria di Apoptosis

1. Cultura HSP27-specifici siRNA-trasfettate e controllo sHCECs contenenti ciascuna 10 nM siRNA iRNA-trasfettate ad una concentrazione di 5 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti fino a quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza in un incubatore a 37 ° con CO ₂ atmosphere 5% in BEGM.
2. Sfilare HCECs utilizzando 2 ml 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto per 5 minuti, centrifugare a 900 xg per 5 minuti in una provetta da 15 ml, e aspirare tripsina-EDTA con una pipetta 1 ml.
3. Lavare le cellule due volte con PBS freddo e risospendere le cellule in 1x tampone (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1.4 M NaCl, e 25 mM CaCl ₂₎ rilegatura ad una concentrazione di 10 ⁶ cellule / ml.
4. Trasferire 100 microlitri sospensione cellulare (1 x 10 ⁵ cellule) in una provetta 5 ml.
5. Aggiungere 5 ml di fluoresceina isotiocianato coniugato annessina V e 5 ml ioduro di propidio.
6. Delicatamente vortice le cellule e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio.
7. Aggiungere 200 ml di 1x tampone di legame a ciascuna provetta e analizzare le cellule da un flusso cytometer entro 1 ora.

L'espressione di HSP27 fosforilata significativamente aumentata a 5, 10, e 30 minuti dopo il ferimento zero confrontato con HCECs illesi ^13. Analisi Western Blot ha rivelato che l'espressione di HSP27 fosforilata e fosforilata Akt sono stati entrambi significativamente ridotto, mentre l'espressione di Bax era significativamente aumentata in HCECs siRNA-trasfettate specifici Hsp27 (Figura 1A-E). L'espressione HSP27 fosforilata è stato ridotto del 30% e del 40% a 10 nm e 50 nm di HSP27-specifiche cellule siRNA-trasfettate, rispettivamente, rispetto alle cellule siRNA-trasfettate controllo, ma l'espressione HSP27 fosforilata non è stato ridotto (Figura 1A-B ). Inoltre, l'espressione HSP27 non fosforilato è stato ridotto del 20% e del 30% in 10 nM e 50 nM di HSP27 specifiche cellule transfettate siRNA, rispettivamente, ma l'espressione HSP27 non fosforilato non è stata ridotta (Figura 1A e C </ Strong>).

Il saggio ferimento direzionale zero indotta indicato che a 24 ore dopo il ferimento, HSP27-specifiche cellule siRNA-trasfettate a 10 e 50 nm esibivano ridotta migrazione (Figura 2). Inoltre, HSP27-specifici HCECs siRNA-transfettate sono stati sottoposti a morte cellulare per apoptosi più e necrotica rispetto al controllo strapazzate cellule siRNA-trasfettate mediante citometria di flusso (Figura 3).

Figura 1. Analisi Western Blot utilizzando anticorpi contro fosforilata HSP27 (p-HSP27), non fosforilata HSP27 (non-p-HSP27), fosforilata Akt (p-Akt) come marker delle cellule sopravvivenza, non fosforilata Akt (non p-Akt), Bcl-2eassociated X proteine (Bax) come una proteina pro-apoptotica, e GAPDH (a). L'espressione di HSP27 fosforilata e nonphosphorylated e fosforilata Akt significativamente diminuita (B - D), tuttavia, l'espressione di Bax significativamente aumentata nelle HCECs siRNA transfettate specifico Hsp27 (E), rispetto a quella osservata nelle cellule transfettate siRNA-controllo (p <0.05). L'espressione HSP27 fosforilata è stato ridotto del 30% e del 40% a 10 nm e 50 nm di HSP27-specifiche cellule siRNA-trasfettate rispetto al controllo finta rispettivamente, ma l'espressione HSP27 fosforilata non è stata ridotta a 10 nm e 50 nm di siRNA di controllo cellule transfettate (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: una differenza statisticamente significativa tra i gruppi (p <0.05). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. citometria di flusso di 50 Nm di controllo scrambled siRNA e umani cellule HSP27-specifici siRNA-trasfettate corneali epiteliali (HCECs) etichettati con annessina V e PI (A e B). La percentuale delle cellule totali nei quadranti corrisponde alle prime cellule apoptotiche (cellule annessina V-positivi e PI-negativi, Q4, in basso a destra), le cellule ritardo apoptotici (annessina V-positivo e PI-positivo cellule, Q2, in alto a destra), e le cellule necrotiche (cellule annessina V-negativi e PI-positivi, Q1, alto a sinistra). HCECs siRNA-trasfezione specifici Hsp27 avevano morte cellulare per apoptosi più e necrotico di controllare le cellule siRNA-trasfettate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies¹⁰ that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we used a siRNA transfection technique to modify gene expression in human CECs to effectively knock-down HSP27-specific gene expression and study HSP27 function. Although there were differences in the target sequence that we used as well as in the cell density, final siRNA concentration, and incubation time, the protocol recommended by the manufacturer was explicitly followed. In terms of alternative methods, HSP27 knock-out mouse may be used to show if HSP27 phosphorylation involves epithelial migration and cell apoptosis. However, it is difficult to monitor the change of HSP27 phosphorylation in mouse model, because its phosphorylation occurs in very short period during epithelial wound healing.

There were several limitations to the present study. First, the in vitro environment in which we cultured human CECs certainly differed from the in vivo environment for human CECs, especially regarding cell survival. Second, the siRNA used in this study was not specific to the phosphorylated form of HSP27 as it affected the overall expression levels of HSP27, including both phosphorylated and non-phosphorylated forms.

In the future, a clinical application of these procedures would be to apply HSP27 to live human wounded corneas. We hope that the current findings will help to advance treatments of corneal epithelial tissue damage.

Gli autori non hanno interessi finanziari o esclusive in qualunque materiale o metodi citati in questo studio.

Questo studio è stato sostenuto dalla Student Research Grant (13-14) dell'Università di Ulsan College of Medicine, Seoul, Corea e una borsa di studio (2014-464) presso l'Istituto di Scienze della Vita Asan, Seoul, Corea.