Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

Tecnologia HaloTag è una tecnologia multifunzionale che ha mostrato un significativo successo in isolamento di piccole e grandi complessi proteici da cellule di mammifero. Qui si segnalano i vantaggi di questa tecnologia rispetto alle alternative esistenti e dimostrare la sua utilità per studiare numerosi aspetti della funzione delle proteine ​​all'interno delle cellule eucariotiche.

La ricerca in proteomica è esploso negli ultimi anni con i progressi nella capacità di spettrometria di massa che hanno portato alla caratterizzazione di numerosi proteoma, comprese quelle da virus, batteri e lieviti. In confronto, l'analisi del proteoma umano resta indietro, in parte a causa del gran numero di proteine ​​che devono essere studiati, ma anche la complessità delle reti e delle interazioni essi presenti. Per affrontare in modo specifico le sfide della comprensione del proteoma umano, abbiamo sviluppato la tecnologia HaloTag per l'isolamento delle proteine, particolarmente forte per l'isolamento di complessi multiproteici e permettendo la cattura più efficiente delle interazioni e / o proteine ​​deboli o transitori in bassa abbondanza. HaloTag è un tag geneticamente codificato proteina di fusione, progettato per covalente, specifica e immobilizzazione o l'etichettatura delle proteine ​​con vari ligandi rapido. Sfruttando queste proprietà, numerose applicazioni di cellule di mammiferi sono stati sviluppati a carattereize funzione delle proteine ​​e qui vi presentiamo metodologie, tra cui: proteine ​​pull-down utilizzati per la scoperta di nuove interazioni o test funzionali e la localizzazione cellulare. Troviamo vantaggi significativi nella velocità, specificità e covalente cattura di proteine ​​di fusione di superfici per l'analisi proteomica rispetto ad altri approcci non-covalenti tradizionali. Dimostriamo questi e l'ampia utilità della tecnologia utilizzando due importanti proteine ​​epigenetici come esempi, la proteina bromodomain umana BRD4, e istone deacetilasi HDAC1. Questi esempi dimostrano la potenza di questa tecnologia per consentire la scoperta di nuove interazioni e caratterizzare la localizzazione cellulare negli eucarioti, che sarà insieme una maggiore comprensione di proteomica funzionale umani.

Comprensione della funzione cellulare, la risposta agli stimoli, e le variazioni di sviluppo e / o malattia membri è strettamente legata alla de-convoluzione del proteoma in questi diversi stati dinamici ^1,2. Molto è stato fatto per capire il proteoma di organismi inferiori, tuttavia, dato il numero di proteine ​​e di tutte le interazioni possibili, questo è stato molto impegnativo per affrontare il proteoma umano ^1,3-7. I progressi nella spettrometria di massa hanno notevolmente consentito la capacità di intraprendere questi studi, e qui vi presentiamo un progresso ulteriore e significativo con lo sviluppo della tecnologia HaloTag sia per la cattura efficiente di complessi proteici e la caratterizzazione funzionale delle proteine ​​umane da cellule di mammifero ^8-10. Questa tecnologia è stata recentemente dimostrato in diversi studi per essere un fattore critico per la scoperta di interazioni importanti, consentendo spaccato funzione nuova proteina e understanding di malattia ^11-13.

La proteina di fusione HaloTag è stato inizialmente sviluppato per affrontare diverse sfide di tag tradizionali affinità e anticorpi relativi alla cattura proteina, la purificazione, l'etichettatura e ^8-10. Da quasi tutti i metodi di cattura e purificazione della proteina, è prevista una fase di interazione non covalente che viene utilizzato per l'arricchimento di una particolare proteina ^14. Durante questa fase, la proteina e / o complesso può dissociarsi per diffusione, soprattutto se il processo richiede ore anziché minuti. Per risolvere questo problema, la proteina di fusione è stato specificamente progettati per rapidamente ed irreversibilmente interagire con i suoi ligandi, che può essere sia particelle, superfici o fluorofori ^9. Pertanto una volta che è legato al suo ligando, resta vincolato, che è uno dei fattori più differenziante rispetto ad altri tag di affinità. Anche dimostrato qui, è la capacitàaffrontare diverse questioni biologiche con un singolo costrutto, che è possibile alternando ligandi ⁹ (Figura 1). Ad esempio, per interrogare interazioni o funzione della proteina, ligandi di superficie sono utilizzati per la cattura di proteine ​​o complessi (Figura 1). In un esperimento separato, la stessa proteina di fusione può essere fluorescente per studiare la localizzazione cellulare, il traffico, o ricambio proteico (Figura 1). È importante ricordare, tuttavia, che una volta ligando è vincolata, se si tratta di una superficie o un fluorocromo, è irreversibile e quindi altri ligandi non può quindi essere successivamente associato nello stesso esperimento.

Analisi delle tecnologie esistenti per mappare le interazioni proteina rivela la difficoltà di isolare efficacemente le interazioni specifiche, compresi quelli che sono più transitori o sono in abbondanza inferiori ^1,6,7,14,15. Inoltre, un recente lavoro di numerosi gruppis mostra la preoccupazione che all'interno dei metodi di isolamento tradizionali, in particolare nel settore della proteomica umani, ci sono un numero significativo di contaminanti proteici che possono mascherare segnali da veri interattori in spettrometria di massa ^16. Le proprietà sviluppati per la proteina HaloTag e il suo indirizzo resina co-sviluppato bene queste preoccupazioni. Nel protocollo per pulldowns complessi (Figura 1), il legame dei complessi può essere raggiunto in 15 min, sia promuovendo cattura complessa e riducendo i livelli di legame non specifico ^8. Inoltre, permette irreversibilmente vincolante per la cattura efficace di proteine ​​poco abbondanti e consente l'uso di molte meno cellule, riducendo ulteriormente sfondo ^8. Una volta stabilita la cattura di complessi, il protocollo prevede condizioni di lavaggio miti per mantenere l'integrità complesso. Eluizione di complessi catturati può essere eseguita in due modi e scegliendo quale metodo è dettata dall'obiettivo di anale vallelisi. Se il desiderio è quello di analizzare o scoprire proteine ​​interagenti mediante Western blot o spettrometria di massa, allora è consigliabile per eluire complessi con denaturanti come SDS o urea (Figura 1). Ciò è particolarmente vantaggioso per spettrometria di massa come la proteina originariamente fusa HaloTag, chiamata proteina esca, rimarrà dietro legato alla resina e quindi non dominerà la frazione di peptidi identificati nella spettrometria di massa. Questo significa anche però che la proteina esca probabilmente non sarà visibile in analisi mediante western blot, una differenza significativa rispetto ad altre purificazioni affinità non covalenti o co-immunoprecipitazione. Se l'obiettivo è quello di purificare una intatta complesso da utilizzare per studi funzionali, eluizione può essere effettuata utilizzando TEV (Tobacco Etch Virus) proteasi, che riconosce la sequenza di clivaggio cognate codificata tra la proteina di fusione e la proteina esca (Figura 1). Tueste campioni possono anche essere analizzati mediante spettrometria di massa, ma come mostrato in seguito, conterranno una quantità significativa di proteina esca che possono impedire il rilevamento di bassa abbondanza, interattori specifici.

Qui vi presentiamo i protocolli a tendina e di imaging applicate a due importanti proteine ​​terapeutiche, la proteina bromodomain BRD4 e un istone deacetilasi, HDAC1 ^17. Abbiamo dimostrato con questi esempi, l'interazione con partner attesi come determinato mediante spettrometria di massa, l'attività enzimatica dopo l'isolamento complessa per HDAC1 e localizzazione cellulare adeguata per entrambi. Insieme, questi risultati dimostrano la multifunzionalità e la forza della tecnologia per la caratterizzazione delle interazioni proteina eucariotica e funzioni.

Nota: Il seguente protocollo può essere utilizzato con qualsiasi fusione HaloTag e in qualsiasi linea cellulare di scelta stabilmente o transitoriamente transfettate. Per questi esempi, gli daremo i protocolli di trasfezione transiente di fusioni HaloTag in cellule HEK293T o HeLa. Per tutti gli esperimenti, si raccomanda di utilizzare il solo controllo della proteina.

1. Fusion Protein Expression test

1. Ottenere proteina di fusione costrutto:
   1. Ottenere pre-made vettore HaloTag fusione o costruire utilizzando vettori esistenti. Per ulteriori informazioni sui costrutti disponibili, vedere la Tabella dei reagenti specifici.
   2. Se fare qualsiasi clone, si raccomanda di verificare sequenziare il DNA.
2. Test espressione della proteina e controllo di fusione:
   1. Per ogni campione, preparare 250 ml di 1X SDS tampone di colorante di caricamento (60 mM Tris HCl pH6.8, 0,75 mm blu di bromofenolo e 12,5% glicerolo, ditiotreitolo 100 mm, 0,5% SDS).
   2. Per ogni proteina di fusionee controllo, piatto 0,5 ml di HEK293T o cellule HeLa nel loro supporto appropriato ad una densità di 2-4 x 10 ⁵ cellule / ml in una piastra standard da 24 pozzetti.
   3. Incubare per 18-24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2, poi trasfezione come raccomandato.
   4. 24 ore dopo la trasfezione, aggiungere 0,5 ml di 5 mm rodammina tetra-metil (TMR), ligando ai media di ogni pozzetto e mescolare delicatamente piatto.
   5. Incubare le cellule transfettate contenenti ligando per 15 min a 37 ° C e 5% di CO _2.
   6. Aspirare il terreno off contenente il ligando e lavare ogni pozzetto di cellule delicatamente con 1 ml di RT PBS.
   7. Aspirare off PBS ed eseguire un secondo lavaggio con 1 ml di RT PBS.
   8. Rimuovere PBS e aggiungere 200 ml di 1X SDS Caricamento buffer di colorante direttamente alle cellule.
   9. Pipetta lisato dalla piastra in 1,5 ml provetta Eppendorf.
   10. Lisato bollire per 5 min a 95 ° C.
   11. Rimuovere 5-10 microlitri della reazione e carico su gel SDS-PAGE.
   12. Utilizzare uno scanner di rilevamento fluorescente(TMR eccitazione: 555 nm, emissione: 585 nm) per individuare le bande. Utilizzare marcatori proteici fluorescenti come standard.
   13. Se uno scanner rilevazione fluorescente è più disponibile, eseguire western blot utilizzando anticorpi contro la proteina esca sia o tag proteina di fusione per rilevare l'espressione della proteina di fusione.

2. Pulldowns proteine

1. Preparazione delle cellule trasfettate in maniera transiente:
   1. Per ogni fusione o il controllo preparare un piatto 15 centimetri con 30 ml di cellule a 3-4 x 10 ⁵ cellule / ml o 1-1,2 x 10 ⁷ cellule totale per costrutto.
   2. Incubare per 18-24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2, poi trasfettare costruire come raccomandato.
   3. Dopo 24-48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto e lavare delicatamente lo strato di cellule con 20-25 ml di ghiaccio PBS freddo.
   4. Rimuovere lavaggio PBS, quindi aggiungere 25-30 ml di 4 ° C refrigerati PBS e raschiare delicatamente le cellule dalla piastra.
   5. Raccogliere le cellule in provette coniche e centrifugaFuge per 5-10 min a 2.000 xg e 4 ° C.
   6. Scartare il surnatante e mettere il pellet cellulare a -80 ° C per un minimo di 30 min o un massimo di 6 mesi.
2. Equilibration della resina HaloLink:
   1. Per ogni campione di fusione o di controllo, preparare 12 ml di tampone in resina Equilibration / Wash (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, e 0,005% IGEPAL CA-630). Nota: È molto importante da fare e usare la resina Equilibration Buffer entro 12 ore come diluito IGEPAL CA-630 non è stabile o efficace oltre questo lasso di tempo.
   2. Agitare delicatamente o miscela di resina per ottenere una sospensione uniforme.
   3. Per ogni esperimento pull-down, dispensare 200 ml di resina in un provette da 1,5 ml microcentrifuga.
   4. Centrifugare per 1 min a 800 xg (ad esempio, 3,000 rpm in una microcentrifuga), poi rimuovere con attenzione e scartare il surnatante (etanolo) senza disturbare resina sul fondo della provetta.
   5. Aggiungere 800 ml di resina equilibrazione / Wash tampone e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta diverse volte.
   6. Centrifugare per 2 minuti a 800 xg, rimuovere con cautela e scartare il surnatante.
   7. Ripetere i punti 2.2.5 e 2.2.6 altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
   8. Non rimuovere il lavaggio finale o surnatante fino al momento di aggiungere lisati cellulari descritte di seguito (Passo 2.3.8) per evitare che la resina si secchi.
3. Rilegatura e lavaggio di complessi di fusione:
   1. Per ogni campione, preparare 500 ml di Mammalian Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Na Desossicolato) e 1 ml di tampone 1X TBS (100 mM Tris-HCl pH 7.5 e NaCl 150 mM).
   2. Scongelare il pellet e risospendere in 300 ml di mammiferi Lysis Buffer pipettando su e giù o brevemente vortex.
   3. Aggiungere 6 ml di 50X inibitore della proteasi Cocktail (800 mcg / ml benzamidina HCl, 500 mg / fenantrolina ml, 500 mg / ml aprotinina, 500 mg / ml leupeptina, 500 & #. 181; g / ml pepstatina A, 50 mM PMSF) Nota: cocktail proteasi che comprendono AEBSF non possono essere utilizzati come tali funzioni interferiscono con tag proteina di fusione di legame.
   4. Aggiungere 3 microlitri DNasi RQ1 e capovolgere per 10 minuti a RT.
   5. Dounce con vetro omogeneizzatore 2,0 ml dimensione; . 25-30 colpi su ghiaccio, o passare cellule attraverso un ago G 25 o 27 5-10 volte per completare lisi Nota: Sonicazione non è raccomandato in quanto complessi possono cadere a pezzi e sovra-riscaldamento possono influenzare l'attività tag proteina di fusione.
   6. Centrifugare a 14.000 xg per 5 minuti a 4 ° C per cancellare il lisato.
   7. Trasferire il lisato chiaro, circa 300 volume totale ml, a nuovo tubo e posto sul ghiaccio.
   8. Aggiungi a cancellare lisato altri 700 ml di tampone 1X TBS e mescolare bene pipettando su e giù.
   9. Prendere tubi resina equilibrata preparata al punto 2.2.8 e rimuovere finale di lavaggio / surnatante da resina senza disturbare resina sul fondo della provetta.
   10. Aggiungere a ciascuna tuessere di resina, i 1 ml di lisato diluito.
   11. Incubare con miscelazione su un rotatore tubo (o mixer dolce) per 15 min a 22 ° C. Nota: assestamento di resina durante questo tempo riduce l'efficienza di legame. Se vincolante a 4 ° C è desiderato, farlo mescolando per 1 ora.
   12. Tubi in resina centrifugare per 2 min a 800 xg ed eliminare il surnatante.
   13. Aggiungere 1 ml di tampone in resina Equilibration / Wash effettuate nella Fase 2.2.1 e mescolare accuratamente capovolgendo il tubo di resina a mano diverse volte.
   14. Tubi in resina centrifugare per 2 min a 800 xg ed eliminare il lavaggio.
   15. Ripetere i passaggi 2.3.12 2.3.14, seguita da altre tre volte.
   16. Aggiungere 1 ml di tampone di equilibrazione resina / lavaggio e incubare a 22 ° C per 5 minuti con rotazione costante.
   17. Tubi in resina centrifugare per 2 min a 800 xg ed eliminare il lavaggio.
   18. A seconda dell'applicazione finale (vedere Introduzione per ulteriori spiegazioni), procede alla Sezione 2.4 o 2.5.
4. SEluizione DS per i gel denaturanti, macchie occidentali, o spettrometria di massa:
   1. Risospendere la resina da ciascun campione in 50 microlitri tampone SDS eluizione (1% SDS e 50 mM Tris-HCl pH7.5)
   2. Agitare le provette a temperatura ambiente per 30 min.
   3. Centrifugare per 2 minuti a 800 XG e trasferire eluati a tubi nuovi per l'analisi.
   4. Per western blot o gel macchia d'argento, carico 5-10 microlitri su un gel denaturante SDS.
   5. Per spettrometria di massa, salvare 40 microlitri di ciascun campione a -20 ° C.
5. TEV Protease eluizione per test funzionali, macchie occidentali, o spettrometria di massa:
   1. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, risospendere la resina in 50 microlitri tampone ProTEV clivaggio e 30 unità di enzima TEV.
   2. Incubare a 25 ° C con agitazione per 1 ora.
   3. Centrifugare per 2 minuti a 800 x g.
   4. Trasferimento eluato ai tubi freschi.
   5. Conservare il campione a 4 ° C per un uso immediato in saggi funzionali.

3.Cellular Imaging di fluorescenza con etichette proteine ​​di fusione Utilizzando un citoplasmatica e nucleare permeabile Ligand

1. Transfettare, etichetta, e le cellule di immagine:
   1. In un 8 coprioggetti ben camerata per ciascuna proteina di fusione o di controllo, piatto 400 microlitri di cellule HeLa in loro supporto appropriato in ciascun pozzetto ad una densità di 1-2 x 10 ⁵ cellule / ml.
   2. Incubare per 18-24 ore a 37 ° C e 5% di CO _2, poi trasfezione come raccomandato.
   3. 18-24 hr dopo la trasfezione, diluire TMR ligando 1:200 cellulari in mezzi appropriati, quindi aggiungere 100 ml di questa soluzione in ogni pozzetto e mescolare delicatamente.
   4. Incubare le cellule transfettate contenenti ligando per 15 min a 37 ° C e 5% di CO _2.
   5. Aspirare il terreno off contenenti ligando e sostituirlo con 500 ml di mezzi di comunicazione idonei privi di proteina di fusione tag ligando, che è stato pre-riscaldato a 37 ° C.
   6. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.
   7. Mettere le cellule di nuovo in incubatrice (376, C e 5% CO ₂₎ per 30 min.
   8. Aspirare off media e sostituirlo con 500 ml di mezzi appropriati, che è stato pre-riscaldato a 37 ° C.
   9. Immagine su un microscopio utilizzando adeguati parametri di acquisizione (TMR di eccitazione: 555 nm, emissione: 585 nm).

Quando si lavora con qualsiasi nuova proteina di fusione, è importante prima prova per l'espressione di detta proteina dopo trasfezione e anche verificare che una proteina del peso molecolare corretto viene prodotto. Come proteine ​​di fusione HaloTag possono essere fluorescente e covalentemente marcato con ligandi impermeabili, permeabili o seconda localizzazione, è possibile determinare rapidamente espressione applicando lisati cellulari per elettroforesi su gel denaturante seguita dalla scansione in un fluorimager. Utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 1.2, espressione di Halo-BRD4 (189 kD), e il solo controllo HaloTag (Ctrl) viene osservato (34 kD, Figura 2A). Come indicato nel protocollo, l'espressione di proteine ​​di fusione può anche essere rilevato utilizzando le macchie tradizionali occidentali con anticorpi anti-HaloTag, o se sono disponibili, gli anticorpi alla proteina esca. Se possibile, si raccomanda di utilizzare il ligando fluorescente invece come è più preciso, più veloce e più facile trilevazione degli anticorpi han, e anche quantitativa ^10.

Dopo espressione della proteina di fusione corretta full-length è verificato, pulldowns proteine ​​possono essere eseguite. Mostrato nella Figura 2B sono i gel colorati d'argento di repliche biologiche di Halo-BRD4 e Ctrl pulldowns eluiti dalla SDS (Protocollo Sezione 2.4), che dimostrano un'alta riproducibilità. I gel macchia d'argento mostrano un numero significativo di proteine ​​si trovano ad interagire con la proteina BRD4 e bassissima sfondo nel controllo (Figura 2B). Come accennato nell'introduzione, in questo processo di eluizione, la Halo-BRD4 non verrà eluita dalla resina che rimane a legame covalente. Pertanto, non vi è una banda significativa a questo peso molecolare essere rilevato nella macchia argento (Figura 2B) o western blot (dati non mostrati). Per determinare se queste proteine ​​sono specifiche BRD4, spettrometria di massa cromatografia liquida (LC-MS/MS) è stata eseguita sulla cmiscela omplex ottenuto dopo SDS eluizione. Mostrato nella Figura 2C sono conteggi spettrali e normalizzato fattore abbondanza spettrale valori (NSAF) per interattori noti di BRD4 ^18-20 trovate nel spettrometria di massa Halo-BRD4. La grande abbondanza di componenti provenienti da pTEFb ^18,20 e anche la proteina BRD9 ¹⁹ confermano specifica acquisizione di complessi BRD4. Come previsto dalle argento macchia gel (Figura 2B), numerose altre proteine ​​sono state anche identificate come potenziali interattori di BRD4 che non sono state osservate nel controllo (dati non riportati). In quanto questi sono finora sconosciuta, hanno bisogno di essere verificate in modo indipendente da altre metodologie per confermare se la proteina è un vero interattore, e se sì, se è direttamente o indirettamente connesso con BRD4.

Isolato complessi possono anche essere studiati per l'attività; si consiglia di eluire complessi utilizzando TEV proteasi (Protocollo Sezione 2.5), in modo che essi mantengono functionality. Nella Figura 3A, un argento macchia gel di complessi pulldown Alo-HDAC1 rilasciati dalla resina utilizzando proteasi TEV è mostrato. Come proteasi TEV si unirà in una regione linker tra il tag proteina di fusione e il suo partner di fusione, quantità significative di proteina esca, in questo caso HDAC1, sono osservati (Figura 3A). Per determinare se tale frazione contenuta attività HDAC1, campioni di TEV eluiti sono stati testati in un saggio di HDAC luminescenti, HDAC-Glo ^21. Come mostrato in Figura 3B, campioni HDAC1 pulldown mostrato alti livelli di attività HDAC1 (colonna 1), che è stato specificamente inibita da un inibitore HDAC noto, SAHA ²² (colonna 2). Come controlli per dimostrare ulteriormente la specificità, nessuna inibizione HDAC è stata osservata con un inibitore famiglia sirtuin correlato, EX-527 ²² (colonna 3) e nessun segnale è stato rilevato usando tampone da solo senza campione HDAC1 pulldown aggiunto (colonna 4).

Una componente significativa della funzioneAL proteomica e comprensione complessi, è anche la comprensione di localizzazione e / o traffico di proteine. Poiché questi costrutti stessa fusione può essere fluorescente all'interno delle cellule, abbiamo monitorato la loro localizzazione utilizzando l'imaging confocale. A seguito del protocollo nella sezione 3, cellule HeLa trasfettate transitoriamente con Halo-BRD4 (Figura 4A) e Halo-HDAC1 (Figura 4B) sono stati fluorescente etichettati con il ligando TMR e ripreso. Come mostrato nelle figure 4A e 4B, sia localizzata nel nucleo come previsto ^17. Questi dati dimostrano che la presenza di tag non ha alterato localizzazione cellulare fisiologica dei suoi partner di fusione.

Figura 1. Schema di proteine ​​a tendina e applicazioni di imaging confocale. Utilizzo come ingle costruire diverse applicazioni per comprendere la funzione delle proteine ​​in cellule di mammifero sono possibili. Per tutti, un costrutto di fusione Halo è sia stabilmente che transientemente espresso in cellule di mammifero aderenti o sospensione. Per le proteine ​​pulldowns complessi, le cellule vengono quindi lisate, complessi sono covalentemente catturati in resina, e eluite sia attraverso SDS eluizione (percorso di sinistra) o scissione TEV (sentiero a destra). SDS eluizione è raccomandato per procedere ad analisi di spettrometria di massa, mentre TEV clivaggio è ottimale per l'esecuzione di analisi funzionale. Per caratterizzare espressione, localizzazione cellulare, gli eventi di traffico, o turnover delle proteine, le cellule vive che esprimono proteine ​​di fusione sono fluorescente e in seguito analizzati su SDS PAGE gel o utilizzando l'imaging confocale. Entrambi i ligandi fluorescenti permeabile o impermeabile cella sono disponibili a seconda della localizzazione o presentazione della proteina di fusione all'interno della cellula.

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Figura 2. Espressione Halo-BRD4 proteine, a tendina e analisi di spettrometria di massa. (A) SDS PAGE gel che mostrano l'espressione di Halo-BRD4 proteina di fusione, 189 kD, e Halo tag proteina di fusione da solo, 34 kD, di controllo (Ctrl) all'interno di un lisato cellulare HEK293T marcato con TMR ligando (protocollo paragrafo 2.1). I gel sono stati scansionati con fluorimager per il rilevamento e un marcatore fluorescente peso molecolare è stato utilizzato. (B) gel macchia d'argento di repliche biologiche per pulldowns di Halo-BRD4 e Ctrl campioni diluiti con SDS. Dimensioni peso molecolare sono indicati per il gel. (C) conta spettrali (pannello di sinistra) e normalizzati fattori spettrali abbondanza valori (NSAF) (pannello di destra) che rappresentano la proteina peso molecolare di proteine ​​identificate in spettrometria di massa di repliche biologiche di Halo- BRD4 e Ctrl. Mostrato sono proteine ​​note per interagire wesima BRD4, compresi i componenti di pTEFb (CDK9 e ciclina T) ^18,20, così come BRD9 ^19. Nessun peptidi di queste proteine ​​sono state identificate nel Ctrl.

Figura 3. Alo-HDAC1 complesso isolamento e analisi dell'attività. (A) gel macchia d'argento che mostrano l'isolamento di complessi Halo-HDAC1 e lo sfondo dal Ctrl dopo TEV scissione (Protocollo Sezione 2.5). La band di spicco HDAC1 (55 kDa) e la band proteasi TEV sono etichettati. Il HDAC1 libero è generato da TEV scissione all'interno di un linker ottimizzato tra la sequenza di fusione HaloTag e HDAC1 dopo la cattura sulla resina (Figura 1). (B) Il grafico mostra l'attività di HDAC1 isolamenti complessi campioni in una luminescente test istone deacetilasi, HDAC- Glo ^21. Colonna 1 del grafico mostra alta lEvels di attività HDAC contenuti con i campioni a tendina Halo-HDAC1 (HDAC1). Colonna 2 rivela questa attività può essere specificamente diminuita mediante aggiunta dell'inibitore HDAC, SAHA ^22, ai campioni pulldown HDAC1. Come controlli, colonna 3 mostra un inibitore della deacetilasi specifico alla famiglia sirtuin, ma non HDAC, EX-527 ^22, non inibisce l'attività HDAC1 e Colonna 4 mostra alcuna attività si osserva utilizzando tampone da solo.

Figura 4. Alo-BRD4 e Alo-HDAC1 confocale. Vivo cella confocale di cellule HeLa trasfettate con Alo-BRD4 (A) o alo-HDAC1 (B) fluorescente con TMR ligando. (A) espressione Alo-BRD4 è limitata al nucleo e (B) l'espressione Halo-HDAC1 è prevalentemente NUClear. Lato sinistro dei pannelli è il canale fluorescente e sul lato destro è una sovrapposizione del canale fluorescente con il canale DIC per ciascuno. Le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale dotato di 37 ° C + CO ₂ camera ambientale utilizzando appositi set di filtri. Bar scale = 20 micron.

Presentato qui ci sono due proteine ​​di fusione, Halo-BRD4 e Halo-HDAC1, caratterizzato in cellule di mammifero eucariote per l'espressione, proteina complessa isolamento e di attività, e la localizzazione cellulare. Nel lavoro attraverso questi diversi protocolli, ci sono diversi passi importanti per il successo di ogni esperimento. Come è il caso con qualsiasi proteina di fusione, livelli di espressione e la posizione del tag stesso può essere critico per il mantenimento fisiologia. E 'quindi importante considerare che fusioni C-terminale N-e / o dovranno essere progettato se non è stata dimostrata conoscenza o lavorare con un altro tag preliminare per la particolare proteina di scelta. Per quanto riguarda l'espressione, se il livello è troppo alto, la diluizione del DNA può essere eseguita durante la transfezione o l'utilizzo di vettori con promotori deboli sono possibili per raggiungere il livello appropriato. Il lavoro precedente è stato eseguito mostrando isolamento efficiente di complessi macromolecolari a endogeno levels di espressione ^8, che consentono il lavoro a livelli molto bassi di espressione. Se possibile, studi localizzazione cellulare sarebbe anche in grado di fornire indicazioni circa la collocazione del tag ottimale così come il livello di espressione rispetto necessario per una corretta fisiologia.

Una volta che le proteine ​​di fusione sono pronti per esperimenti pulldown, per ottenere il massimo successo con il protocollo è molto importante seguire i tempi consigliati nella lisi, l'associazione e sezioni di lavaggio, come uno dei maggiori vantaggi è la velocità dell'isolamento complesso processo. Se uno qualsiasi di questi passaggi sono allungate nel tempo, come è richiesto per un metodo di cattura a base di anticorpi, vi è il rischio di dissociazione complesso o aumentata vincolante ⁸ non specifico. Allo stesso modo se i tempi si accorciano durante la lisi cellulare o vincolante, le cellule non possono essere completamente lisati o efficiente catturati rispettivamente. Se il numero di lavaggi è dimalleviato o buona miscelazione della resina non si verifica durante i lavaggi vincolanti o, quindi saranno aumentati livelli di proteine ​​non specifici di sfondo. Inoltre, i mezzi di lisi è molto importante in quanto correlata alla efficienza di legame alla resina. I tentativi di Sonicare i campioni, rimuovere il prodotto detergente raccomandato, aggiungere SDS o altre sostanze detergenti e / o includere il AEBSF inibitore della proteasi si tradurrà in riduzione o la perdita di legame delle proteine ​​di fusione e dei loro complessi alla resina.

Metodi esistenti per l'isolamento complesso da cellule di mammifero e lotta analisi proteomica umana con la sfida di ridurre background in analisi mediante spettrometria di massa ^16. Questo è stato così significativo che un deposito di proteine ​​contaminanti è stata creata da numerosi gruppi di spettrometria di massa ^16. Sfondo in campioni spettrometria di massa a tendina può essere definito come qualcosa che impedisce l'identificazione diveri interattori della proteina esca. Come tale, sfondo può derivare da proteine ​​contaminanti non specifici o anche grandi concentrazioni di proteine ​​esche o anticorpi utilizzati per precipitare le proteine ​​esca. Lavoro significativo è stato fatto per ottimizzare sia il protocollo pulldown presentata qui, come la resina di minimizzare il livello delle proteine ​​contaminanti non specifici nel processo pulldown. Questo è evidente nei gel macchia d'argento e analisi di spettrometria di massa di controllo (Figura 2). Per affrontare gli elevati livelli di proteina esche o di anticorpi che possono essere altrettanto dannosi come agenti inquinanti e con altre metodologie che lottano, si raccomanda il menu a discesa con SDS eluizione (Protocollo Sezione 2.4). A causa del legame covalente alla resina, questo processo lascerà la maggior parte della proteina di fusione partenza covalentemente alla resina. Una piccola percentuale di esca si osserva nella analisi di spettrometria di massa, che si ritieneche avvenga attraverso idrolisi, ma non presenta un problema per il rilevamento di altre interazioni deboli o transitori ^8.

Come accennato nell'introduzione, progressi significativi nella proteomica sono stati abilitati da significativi progressi nella spettrometria di massa ^1,7. Pertanto, è importante sottolineare parametri importanti della scelta di analisi di spettrometria di massa per deconvolute la miscela di proteine ​​ottenuti nelle pulldowns. Strumentazione deve essere robusto e in grado di analizzare regolarmente ed efficiente campioni contenenti una piccola quantità di proteine, spesso inferiore <1 mg. Cromatografia nanoscala coinvolge 50-75 micron colonne HPLC diametro interno con portate nell'intervallo nl / min 100-300 è tipicamente impiegato per la compatibilità con i campioni di piccole dimensioni e per massimizzare la sensibilità dello spettrometro di massa. Per massimizzare le informazioni acquisite in uno Stato o singola analisif gli spettrometri di massa dell'arte in grado di acquisire spettri di massa ad alta risoluzione su una scala temporale compatibile con le suddette separazioni su scala nanometrica, ≥ 10 Hz, sono tipicamente impiegati. Questi strumenti hanno livelli attomolar di sensibilità e possono ordinariamente acquisire dati con sub precursore ppm e tolleranze di massa di ioni prodotto. Tali caratteristiche di rendimento servono per aumentare la resa del numero di proteine ​​identificate e l'attendibilità associato tali identificazioni.

Con questi dati ci dimostrano la localizzazione fisiologico cellulare, la proteina corretta: interazioni proteina insieme con un potenziale per la scoperta di nuove interazioni, e l'isolamento di complessi attivi tutto utilizzando un unico costrutto. Infatti tecnologie alternative possono essere usate per ciascuno di questi diversi aspetti, ma probabilmente non per tutti ^23,24. Con la tecnologia HaloTag, un approccio multifunzionale può essere utilizzato, avanzando proteomCI studi e ottenere una comprensione più completa della funzione della proteina in cellule di mammifero.

Spese di pubblicazione per questo articolo sono sponsorizzati da Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy e Marjeta Urh sono dipendenti di Promega Corporation, il proprietario imprese cessione di brevetti della tecnologia HaloTag e le sue applicazioni. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, e David Allen sono dipendenti di MSBioworks, che fornisce servizi di spettrometria di massa descritti in questo manoscritto.

Ringraziamo il Dott. Martin Rosenberg, il dottor Gary Tarpley, e il dottor Keith Wood per il supporto di questo lavoro, e il Dr. James Cali per la lettura critica del manoscritto. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, e MU sono dipendenti di Promega Corporation. MF, RJ, RA, e DA sono dipendenti di MS Bioworks, LLC.