Method Article
التكنولوجيا HaloTag هي تقنية متعددة الوظائف التي أظهرت نجاحا كبيرا في عزل المجمعات البروتين كل صغيرة وكبيرة من خلايا الثدييات. نحن هنا تسليط الضوء على مزايا هذه التكنولوجيا مقارنة بالبدائل القائمة وتثبت فائدتها لدراسة جوانب عديدة من وظيفة البروتين داخل الخلايا حقيقية النواة.
وقد انفجرت البحث في البروتيوميات في السنوات الأخيرة مع التقدم في قدرات مطياف الكتلة التي أدت إلى توصيف العديد من proteomes، بما في ذلك تلك من الفيروسات والبكتيريا والخميرة. في المقارنة، وتحليل بروتيوم الإنسان متخلفة، ويرجع ذلك جزئيا إلى العدد الكبير من البروتينات التي يجب دراستها، ولكن أيضا مدى تعقيد شبكات والتفاعلات هذه الحاضر. للتصدي على وجه التحديد تحديات فهم بروتيوم الإنسان، وقد وضعنا التكنولوجيا HaloTag للبروتين العزلة، قوية بشكل خاص لعزل المجمعات multiprotein والسماح التقاط أكثر كفاءة من التفاعلات و / أو البروتينات ضعيفة أو عابرة في وفرة منخفضة. HaloTag هو المشفرة وراثيا علامة انصهار بروتين، والمصممة لالتساهمية، محددة، والشلل السريع أو وضع العلامات البروتينات مع مختلف بروابط. الاستفادة من هذه الخصائص، وقد وضعت العديد من التطبيقات لخلايا الثدييات إلى الطابعإيزي ظيفة البروتين وهنا نقدم المنهجيات بما في ذلك: البروتين سحب هبوطا تستخدم لاكتشاف التفاعلات رواية أو المقايسات الفنية، وتوطين الخلوية. نجد مزايا كبيرة في سرعة، والنوعية، والتقاط التساهمية من البروتينات الانصهار إلى السطوح لتحليل البروتين بالمقارنة مع الأساليب التقليدية الأخرى غير التساهمية. ونحن لشرح هذه الأداة المساعدة واسعة من التكنولوجيا باستخدام اثنين من البروتينات جينية مهمة كأمثلة، البروتين bromodomain الإنسان BRD4، وdeacetylase هيستون HDAC1. هذه الأمثلة تبرهن على قوة هذه التكنولوجيا في تمكين اكتشاف التفاعلات التي تميز الرواية وتوطين الخلوية في حقيقيات النوى، والتي سوف تزيد معا فهم البروتينات وظيفية الإنسان.
وتعادل معقد فهم وظيفة الخلوية، والاستجابة للمؤثرات، والتغيرات في الدول تطوير و / أو المرض للتخلص من الإلتواء من بروتيوم طوال هذه الدول ديناميكية مختلفة 1،2. وقد تم فعل الكثير لفهم بروتيوم من الكائنات أقل، ومع ذلك، وبالنظر إلى عدد من البروتينات وجميع التفاعلات الممكنة، وقد كان هذا تحديا كبيرا في التصدي للبروتيوم الإنسان 1،3-7. التقدم في مطياف الكتلة قد مكنت كثيرا من القدرة على إجراء هذه الدراسات، وهنا نقدم على النهوض إضافية وهامة مع تطور التكنولوجيا HaloTag لكلا القبض على كفاءة من المجمعات البروتين وتوصيف وظيفي للبروتينات بشرية من خلايا الثدييات 8-10. وقد تم مؤخرا أظهرت هذه التكنولوجيا في العديد من الدراسات أن يكون عاملا حاسما لاكتشاف التفاعلات الهامة، والسماح لنظرة ثاقبة وظيفة البروتين الرواية وunderstandiنانوغرام من المرض 11-13.
وقد وضعت البروتين الانصهار HaloTag في البداية لمعالجة العديد من التحديات من الأكواد تقارب التقليدية والأجسام المضادة وعلاقتها التقاط البروتين، وتنقية، ووضع العلامات 8-10. في ما يقرب من جميع طرق لالتقاط البروتين وتنقية، وهناك خطوة التفاعل غير التساهمية التي تستخدم لتخصيب خاصة بروتين 14. خلال هذه الخطوة، يمكن للبروتين و / أو معقدة تنأى بسبب نشرها، خصوصا إذا كانت العملية تتطلب ساعات بدلا من دقائق لإكمال. لمعالجة هذا القلق، تم تصميم هذا البروتين الانصهار خصيصا للتفاعل بسرعة وبشكل لا رجعة فيه مع بروابط، والتي يمكن أن تكون إما الجزيئات، السطوح، أو fluorophores 9. ولمرة واحدة كان من المحتم أن يجند لها، إلا أنها تبقى ملزمة، والتي هي واحدة من أكثر العوامل التفريق بالمقارنة مع العلامات الأخرى تقارب. أظهرت أيضا هنا، هو القدرةلمعالجة المسائل البيولوجية المختلفة مع بناء واحد، وهو أمر ممكن بالتناوب بروابط 9 (الشكل 1). على سبيل المثال، لاستجواب تفاعلات البروتين أو وظيفة، وتستخدم بروابط السطح للقبض على البروتين أو المجمعات (الشكل 1). في تجربة منفصلة، وهو نفس البروتين الانصهار يمكن fluorescently المسمى لدراسة توطين الخلوية، والاتجار، أو دوران البروتين (الشكل 1). من المهم أن نتذكر أنه بمجرد ولكن لا بد ليجند، سواء كان على سطح أو fluorophore، فإنه لا رجعة فيه، وبالتالي بروابط أخرى لا يمكن أن تكون ملزمة ثم في وقت لاحق في نفس التجربة.
تحليل التكنولوجيات القائمة لرسم خريطة التفاعلات البروتين تكشف عن صعوبة لعزل بكفاءة تفاعلات محددة، بما في ذلك تلك التي هي أكثر عابرة أو هي في انخفاض فرة 1،6،7،14،15. أيضا، والعمل مؤخرا من قبل العديد من مجموعةو يظهر القلق أنه في غضون أساليب العزلة التقليدية، وخاصة في مجال تحليل البروتينات البشرية، وهناك عدد كبير من الملوثات البروتين الذي قد يخفي إشارات من interactors صحيحا في تحليل الطيف الكتلي 16. الخصائص المتقدمة للبروتين HaloTag وعنوانه شارك في تطوير الراتنج جيدا هذه المخاوف. لا يمكن أن يتحقق في بروتوكول لpulldowns معقدة (الشكل 1)، ملزم المجمعات في 15 دقيقة، كل من تعزيز القبض المعقدة والحد من مستويات ملزم غير محددة 8. بالإضافة إلى ذلك، ملزم لا رجعة فيه يسمح لالتقاط كفاءة من البروتينات وفرة منخفضة ويسمح لاستخدام عدد أقل بكثير من الخلايا، ومرة أخرى تخفيض خلفية 8. مرة واحدة يتم تأسيس القبض على المجمعات، ويشمل البروتوكول الظروف غسل خفيفة للحفاظ على سلامة المعقدة. شطف من المجمعات استولت يمكن القيام بها من قبل اثنين من الأساليب واختيار أي تمليه الأسلوب هدف الشرج المصبysis. إذا كانت هناك رغبة في تحليل أو اكتشاف البروتينات التفاعل من قبل لطخة غربية أو مطياف الكتلة، ثم فمن المستحسن أن أزل المجمعات مع denaturants مثل SDS أو اليوريا (الشكل 1). هذا أمر مفيد لقياس الطيف الكتلي مثل البروتين تنصهر في الأصل لHaloTag، ووصف البروتين الطعم، سيظل وراء منضمة إلى الراتنج وبالتالي لن تهيمن على السكان من الببتيدات الكشف في مطياف الكتلة. وهذا يعني أيضا أن البروتين ولكن الطعم من المحتمل أن لا تكون واضحة في تحليل لطخة غربية، أي بفارق كبير بالمقارنة مع غيرها من التنقيات تقارب غير التساهمية أو زملاء immunoprecipitations. إذا كان الهدف هو لتنقية مجمع سليمة لاستخدامها في الدراسات وظيفية، شطف يمكن القيام بها باستخدام TEV (التبغ إحفر الفيروسات) البروتيني، الذي يعترف به تسلسل الانقسام وما شابه ذلك المشفرة بين انصهار بروتين والبروتين الطعم (الشكل 1). Tويمكن أيضا أن يتم تحليل العينات ذات المناظر بواسطة مطياف الكتلة، ولكن كما هو موضح في وقت لاحق، وسوف تحتوي على كمية كبيرة من البروتين الطعم التي قد تحول دون الكشف عن وفرة أقل، interactors محددة.
هنا نقدم المنسدلة والتصوير بروتوكولات تطبيقها على اثنين من البروتينات العلاجية الهامة، البروتين bromodomain BRD4 وdeacetylase هيستون، HDAC1 17. أظهرنا مع هذه الأمثلة، والتفاعل مع الشركاء المتوقع على النحو الذي يحدده قياس الطيف الكتلي، النشاط الأنزيمي بعد العزلة معقدة لHDAC1، وتوطين الخلوية المناسبة لكليهما. معا، وهذه النتائج تدل على طبيعة متعددة الوظائف وقوة التكنولوجيا لتوصيف التفاعلات البروتين وحيد الخلية ووظيفتها.
ملاحظة: بروتوكول التالية يمكن استخدامها مع أي الانصهار HaloTag وعلى أي خط الخلية الاختيار ستابلي أو عابر. لهذه الأمثلة، وسنقدم بروتوكولات لترنسفكأيشن عابرة للاندماج HaloTag في الخلايا HEK293T أو هيلا. لجميع التجارب، ونحن نوصي استخدام عنصر التحكم البروتين فقط.
1. فيوجن التعبير البروتين اختبار
2. Pulldowns البروتين
3.التصوير الخلوية من Fluorescently صفتها البروتينات الانصهار باستخدام السيتوبلازم والنووية نافذ يجند
عند العمل مع أي انصهار بروتين الجديدة، من المهم أن الاختبار الأول للتعبير عن أن بروتين بعد ترنسفكأيشن والتحقق من أن البروتين من الوزن الجزيئي المناسبة يتم إنتاجها أيضا. كما HaloTag البروتينات الانصهار fluorescently يمكن أن يكون وصفت تساهميا مع، بروابط كتيمة قابلة للاختراق أو تبعا التعريب، فمن الممكن لتحديد التعبير بسرعة من خلال تطبيق لست] الخلوية لتغيير طبيعة الكهربائي هلام تليها المسح على fluorimager. باستخدام بروتوكول موضح في القسم 1.2، التعبير عن هالو-BRD4 (189 دينار كويتي) وHaloTag وحده التحكم (السيطرة) ويلاحظ (34 دينار كويتي، الشكل 2A). كما ورد في البروتوكول، ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن التعبير عن البروتينات الانصهار باستخدام البقع الغربية التقليدية مع الأجسام المضادة للHaloTag، أو إذا كانت متاحة، والأجسام المضادة للبروتين الطعم. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام يجند الفلورسنت بدلا كما هو أكثر تحديدا وأسرع وأسهل رهان الكشف عن الأجسام المضادة، وكذلك كمية 10.
بعد أن يتم التحقق من التعبير السليم كامل طول البروتين الانصهار، pulldowns البروتين يمكن أن يؤديها. هو مبين في الشكل 2B هي الفضة الهلام الملون من مكررات البيولوجية من هالو-BRD4 والسيطرة pulldowns مزال بواسطة SDS (القسم بروتوكول 2.4) والتي تثبت استنساخ عالية. تظهر المواد الهلامية وصمة عار الفضة يتم العثور على عدد كبير من البروتينات للتفاعل مع البروتين ومنخفضة جدا BRD4 الخلفية في السيطرة (الشكل 2B). كما ذكر في المقدمة، في هذه العملية من شطف، لن يتم مزال هالو-BRD4 من الراتنج أنها لا تزال ملزمة تساهميا. وبالتالي، ليس هناك عصابة كبيرة في هذا الوزن الجزيئي يجري الكشف عنها في وصمة عار الفضة (الشكل 2B) أو لطخة غربية (لا تظهر البيانات). لتحديد ما إذا كانت هذه البروتينات هي محددة لBRD4، تم إجراء قياس الطيف اللوني السائل الشامل (LC-MS/MS) على جخليط omplex تم الحصول عليها بعد SDS شطف. هو مبين في الشكل 2C هي التهم الطيفية وتطبيع عامل وفرة الطيفية (NSAF) قيم interactors معروفة من BRD4 18-20 جدت في هالو-BRD4 تحليل الطيف الكتلي. وفرة عالية من المكونات من pTEFb 18،20 وكذلك البروتين BRD9 19 تأكيد القبض محددة من المجمعات BRD4. كما تنبأ الفضة وصمة عار المواد الهلامية (الشكل 2B)، كما تم تحديد العديد من البروتينات الأخرى كما interactors المحتملة للBRD4 التي لم تراع في التحكم (لا تظهر البيانات). لأن هذه هي لم تكن معروفة سابقا، وأنها بحاجة إلى التحقق بشكل مستقل من قبل منهجيات أخرى لتأكيد ما إذا كان البروتين هو interactor لصحيحا، وإذا كان الأمر كذلك، وإذا كان مباشر أو غير مباشر المرتبطة BRD4.
ويمكن أيضا أن تدرس مجمعات معزولة عن النشاط؛ أنه يوصي أزل المجمعات باستخدام البروتيني TEV (القسم بروتوكول 2.5) بحيث تحافظ functionaliتاي. في الشكل 3A، الفضة وصمة عار الجل المجمعات المنسدلة هالو-HDAC1 صدر من الراتنج باستخدام TEV البروتيني هو مبين. كما TEV البروتيني سوف يلتصق في منطقة رابط بين العلامة البروتين الانصهار والاندماج شريك له، كميات كبيرة من البروتين الطعم، في هذه الحالة HDAC1، ويلاحظ (الشكل 3A). لتحديد ما إذا كان هذا الكسر الواردة النشاط HDAC1، تم اختبار عينات TEV مزال في مقايسة HDAC الانارة، HDAC-جلو 21. كما هو مبين في الشكل 3B، وأظهرت عينات HDAC1 المنسدلة مستويات عالية من النشاط HDAC1 (العمود 1)، والتي كانت تحول دون وجه التحديد المانع HDAC المعروفة، ساها 22 (العمود 2). كما ضوابط لمزيد من إثبات خصوصية، لم يلاحظ أي تثبيط HDAC مع ذات الصلة المانع الأسرة sirtuin، EX-527 22 (العمود 3) وتم الكشف عن عدم وجود إشارة باستخدام العازلة وحدها دون العينة HDAC1 المنسدلة المضافة (العمود 4).
وثمة عنصر هام من وظيفةالبروتيوميات القاعدة والمجمعات فهم، ومن فهم أيضا البروتين التعريب و / أو الاتجار. لأن هذه ثوابت نفس الانصهار يمكن fluorescently المسمى داخل الخلايا، ونحن مراقبة توطين وذلك باستخدام التصوير متحد البؤر. بعد بروتوكول في القسم 3، خلايا هيلا عابر مع Halo-BRD4 (الشكل 4A) وهالو-HDAC1 (الشكل 4B) وfluorescently المسمى مع يجند TMR وتصويرها. كما هو مبين في الأرقام 4A و 4B، سواء المترجمة إلى النواة كما هو متوقع 17. تظهر هذه البيانات أن وجود علامة لم يغير توطين الخلوية الفسيولوجية للشركاء الانصهار فيها.
الشكل 1. تخطيطي المنسدلة البروتين وتطبيقات التصوير متحد البؤر. طريق كما إنجل بناء العديد من التطبيقات لفهم وظيفة البروتين في خلايا الثدييات ممكنة. للجميع، وبناء هالة الانصهار إما ثابت أو عابر أعرب في خلايا الثدييات ملتصقة أو تعليق. لpulldowns البروتين معقدة، ثم يتم هي lysed الخلايا، يتم التقاطها المجمعات تساهميا على الراتنج، ومزال إما عن طريق شطف SDS (المسار الأيسر) أو انشقاق TEV (المسار الأيمن). ينصح SDS شطف للمضي قدما لتحليل الطيف الكتلي، في حين TEV انشقاق هو الأمثل لأداء التحليل الوظيفي. لتوصيف التعبير وتوطين الخلوية، والأحداث الاتجار، أو دوران البروتين، والخلايا الحية معربا عن البروتينات الانصهار وfluorescently المسمى ومزيد من التحليل على SDS PAGE المواد الهلامية أو باستخدام التصوير متحد البؤر. تتوفر كل من خلية بروابط الفلورسنت نفاذية أو غير منفذة تبعا للتوطين أو عرض تقديمي من البروتين الانصهار داخل الخلية.
igure 2 "FO: محتوى العرض =" 6in "سرك =" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الشكل 2. هالو-BRD4 البروتين التعبير، المنسدلة، وتحليل الطيف الكتلي. المواد الهلامية (A) A SDS PAGE يظهر التعبير عن هالو-BRD4 الانصهار البروتين، 189 دينار كويتي، وهالو انصهار بروتين علامة وحده، 34 دينار كويتي، والتحكم (السيطرة) في غضون المحللة الخلوية HEK293T المسمى مع TMR يجند (القسم بروتوكول 2.1). تم مسحها المواد الهلامية مع fluorimager للكشف، وكان يستخدم الفلورسنت الوزن الجزيئي علامة (B) والمواد الهلامية الفضة وصمة عار من مكررات البيولوجية لpulldowns من هالو-BRD4 والسيطرة عينات مزال مع SDS. يشار إلى الأحجام الوزن الجزيئي للهلام (C) التهم الطيفي (اللوحة اليسرى) وتطبيع العوامل فرة الطيفية (NSAF) القيم (اللوحة اليمنى) والتي تمثل البروتين الوزن الجزيئي للبروتينات التي تم تحديدها في تحليل الطيف الكتلي من مكررات البيولوجية من هالو- BRD4 والسيطرة. أظهرت هي بروتينات معروفة للتفاعل ثإيث BRD4، بما في ذلك مكونات pTEFb (CDK9 وأحذية ركوب T) 18،20، وكذلك BRD9 19. تم تحديد أي من هذه الببتيدات والبروتينات في السيطرة.
الرقم 3. هالو-HDAC1 العزلة معقدة وتحليل النشاط. (أ) المواد الهلامية الفضة وصمة عار تبين عزل المجمعات هالو-HDAC1 والخلفية من السيطرة بعد انشقاق TEV (بروتوكول القسم 2.5). وصفت الفرقة البارزين HDAC1 (55 كيلو دالتون) والفرقة البروتيني TEV. يتم إنشاء HDAC1 مجانا من TEV انشقاق داخل رابط الأمثل بين HaloTag وHDAC1 تسلسل الانصهار بعد القبض على الراتنج (الشكل 1). (B) رسم بياني يبين نشاط HDAC1 العزلة معقدة العينات في الانارة الفحص deacetylase هيستون، HDAC- 21 بالشبكة. العمود 1 من الرسم البياني يبين عالية لevels النشاط HDAC الواردة مع عينات المنسدلة هالو-HDAC1 (HDAC1). العمود 2 يكشف هذا النشاط يمكن انخفضت تحديدا إضافة المانع HDAC، ساها 22، إلى عينات المنسدلة HDAC1. والضوابط، العمود 3 يوضح المانع deacetylase محددة لعائلة sirtuin، ولكن ليس HDACs، EX-527 22، لا تمنع النشاط HDAC1 والعمود 4 عروض لوحظ أي نشاط باستخدام العازلة وحدها.
الشكل 4. هالو هالو-BRD4 و-HDAC1 التصوير متحد البؤر. يعيش خلية التصوير متحد البؤر من خلايا هيلا transfected مع هالو-BRD4 (A) أو هالو-HDAC1 (B) fluorescently المسمى مع TMR يجند. يقتصر (A) هالو BRD4 التعبير إلى النواة و (ب) هالو-HDAC1 التعبير هي في الغالب مجلس التوحيد الوطنىلير. الجانب الأيسر من لوحات هي قناة الفلورسنت والجانب الأيمن هو تراكب للقناة فلوري مع قناة مدينة دبي للإنترنت لكل منها. تم الحصول على الصور على المجهر متحد البؤر مجهزة 37 ° C + CO 2 غرفة البيئية باستخدام مجموعات التصفية المناسبة. أشرطة النطاق = 20 ميكرومتر.
المقدمة هنا نوعان من البروتينات الانصهار، هالو هالو-BRD4 و-HDAC1، وتتميز في خلايا الثدييات حقيقية النواة للتعبير، والبروتين العزلة معقدة والنشاط، وتوطين الخلوية. في العمل من خلال هذه البروتوكولات المختلفة، وهناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كل تجربة. كما هو الحال مع أي انصهار بروتين، ومستوى التعبير ووضع العلامة نفسها يمكن أن تكون حاسمة للحفاظ على وظائف الأعضاء. ولذلك فمن المهم أن نرى أن N-و / أو اندماج-C محطة سوف تحتاج إلى أن تكون مصممة إذا لم يثبت علم مسبق أو العمل مع علامة أخرى للبروتين معين في الاختيار. بخصوص التعبير، إذا كان مستوى مرتفع جدا، التخفيف من الحمض النووي يمكن أن يؤديها خلال ترنسفكأيشن أو استخدام ناقلات مع المروجين أضعف وممكن لتحقيق المستوى المناسب. وقد تم العمل السابقة تظهر العزلة كفاءة من المجمعات الجزيئات أجريت في الذاتية جنيهVELS التعبير 8، مما يتيح العمل على مستويات منخفضة جدا من التعبير. إذا كان ذلك ممكنا، فإن الدراسات توطين الخلوية أيضا أن تكون قادرة على تقديم فكرة عن الموقف الأمثل موضع العلامة وكذلك مستوى التعبير النسبية اللازمة لعلم وظائف الأعضاء المناسبة.
مرة واحدة البروتينات الانصهار مستعدون للتجارب المنسدلة، للحصول على أقصى قدر من النجاح مع بروتوكول فمن المهم جدا اتباع الأطر الزمنية الموصى بها في تحلل، ملزمة، وأقسام الغسيل، باعتبارها واحدة من أكبر مزايا هي سرعة العزلة معقدة العملية. إذا تطول في الوقت المناسب أي من هذه الخطوات، مثل والمطلوبة لطريقة التقاط القائم على الضد، هناك خطر تفارق معقدة أو زيادة ملزمة 8 غير محددة. وبالمثل إذا تم تقصير مرات خلال تحلل الخلوية أو ملزمة، والخلايا قد لا تكون هي lysed تماما أو أسروا بكفاءة على التوالي. إذا كان عدد من يغسل هو decrخففت أو لا يحدث خلط جيدة من الراتنج خلال يغسل ملزمة أو، ثم سيتم زيادة مستويات الخلفية للبروتينات غير محددة. أيضا، وسيلة للتحلل من المهم جدا كما تتعلق كفاءة ملزمة لالراتنج. سوف محاولات ليصوتن العينات، وإزالة المنظفات الموصى بها، إضافة SDS أو المنظفات القوية الأخرى، و / أو تشمل AEBSF مثبط البروتياز يؤدي إلى انخفاض أو فقدان ملزم البروتينات الانصهار والمجمعات لالراتنج.
الأساليب القائمة لعزل معقدة من خلايا الثدييات والإنسان البروتين النضال التحليل مع التحدي المتمثل في الحد من خلفية في تحليل الطيف الكتلي 16. وقد كان هذا من الأهمية بمكان أن مستودع من البروتينات تلويث تم إنشاؤها من قبل العديد من الجماعات مطياف الكتلة 16. الخلفية في عينات مطياف الكتلة المنسدلة يمكن تعريفها بأنها أي شيء مما يمنع تحديدinteractors الحقيقي للبروتين الطعم. على هذا النحو، يمكن أن تنشأ من الخلفية تلويث البروتينات غير محددة أو أيضا على تركيزات كبيرة من البروتين الطعم أو الأجسام المضادة المستخدمة لترسيب بروتينات الطعم. وقد تم عمل كبير في تحسين كل من بروتوكول المنسدلة المقدمة هنا وكذلك الراتنج لتقليل مستوى البروتينات تلويث غير محددة في عملية المنسدلة. هذا هو واضح في المواد الهلامية وصمة عار الفضة وتحليل الطيف الكتلي لعنصر التحكم (الشكل 2). لمعالجة مستويات عالية من البروتين الطعم أو الأجسام المضادة التي يمكن أن تكون ضارة على قدم المساواة مع الملوثات ومع المنهجيات الأخرى التي النضال، ينصح المنسدلة مع SDS شطف (القسم بروتوكول 2.4). ويرجع ذلك إلى التعلق التساهمية إلى الراتنج، وهذه العملية سوف يترك الغالبية العظمى من البروتين الانصهار انطلاق المرفقة تساهميا إلى الراتنج. ويلاحظ وجود نسبة صغيرة من الطعم في تحليل الطيف الكتلي، الذي يعتقدأن يحدث من خلال التحلل، لكنه لا يمثل مشكلة للكشف عن التفاعلات الأخرى أضعف أو عابرة 8.
كما ذكر في المقدمة، تم تفعيل تقدما كبيرا في البروتينات بواسطة تقدما كبيرا في مطياف الكتلة 1،7. وبالتالي، فمن المهم تسليط الضوء على المعالم الهامة للاختيار تحليل الطيف الكتلي لdeconvolute خليط من البروتينات التي تم الحصول عليها في pulldowns. يجب أن تكون الأجهزة قوية وقادرة على روتيني وكفاءة تحليل العينات التي تحتوي على كمية صغيرة من البروتين، وغالبا ما تكون أقل من <1 ميكروغرام. وعادة ما تستخدم اللوني النانوية تنطوي 50-75 ميكرومتر أعمدة القطر HPLC الداخلية مع معدلات التدفق في 100-300 NL / دقيقة مجموعة من أجل التوافق مع أحجام عينة صغيرة وتعظيم حساسية مطياف الكتلة. لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المكتسبة في حالة س تحليل واحدو في الطيف الشامل الفن قادر على الحصول على دقة عالية أطياف الشامل على نطاق الوقت متوافق مع فصل النانو المذكورة آنفا، ≥ 10 هرتز، وعادة ما يعملون. هذه الصكوك لديهم مستويات attomolar من الحساسية ويمكن الحصول على البيانات مع السلائف جزء في المليون الفرعية وايون المنتج التحمل الخطأ الشامل بشكل روتيني. تخدم هذه خصائص الأداء لزيادة الغلة من عدد من البروتينات التي تم تحديدها والثقة المرتبطة بتلك تحديد الهوية.
مع هذه البيانات التي تثبت التعريب الفسيولوجية الخلوية، وبروتين المناسبة: تفاعلات البروتين جنبا إلى جنب مع القدرة على اكتشاف التفاعلات الرواية، وعزل جميع مجمعات نشاطا باستخدام بناء واحد. التكنولوجيات البديلة في الواقع يمكن استخدامها لكل من هذه الجوانب المختلفة، ولكن من المحتمل أن لا لجميع 23،24. مع التكنولوجيا HaloTag، يمكن أن تستخدم نهجا متعدد الوظائف، والنهوض proteomICS الدراسات والحصول على فهم أكثر اكتمالا وظيفة البروتين في خلايا الثدييات.
وترعى رسوم النشر لهذه المادة من قبل شركة PROMEGA. دانيت L. دانيلز، جاكي منديز، هيلين Benink، أندرو نايلز، نانسي ميرفي وMarjeta Urh هم موظفون لشركة PROMEGA، صاحب التجارية بالتنازل عن براءات الاختراع للتكنولوجيا HaloTag وتطبيقاتها. مايكل فورد، ريتشارد جونز، رافي أمونوجاما، وديفيد ألين هم موظفون من MSBioworks، التي تقدم خدمات قياس الطيف الكتلي وصفها في هذه المخطوطة.
نشكر الدكتور مارتن روزنبرغ، الدكتور غاري تربلي، والدكتور كيث الخشب لدعم هذا العمل، والدكتور جيمس كالي لقراءة نقدية للمخطوطة. DLD، JM، HB، NM، AN، JC، وMU هم موظفون لشركة PROMEGA. MF، RJ، RA، وDA هم موظفون من MS Bioworks، LLC.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
HeLa Cells | ATCC | CCL-2 | Adherent |
HEK293T Cells | ATCC | CRL-11268 | Adherent |
Cellular growth media | Invitrogen/Gibco | ||
PBS - tissue culture certified | Invitrogen/Gibco | ||
FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
HaloTag Control Vector | Promega | G6591 | |
HaloTag-BRD4 | Kazusa DNA Research Institute | FHC11882 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag-HDAC1 | Kazusa DNA Research Institute | FHC02563 | N-terminal HaloTag fusion |
HaloTag Clones containing content | Promega | Various | http://www.promega.com/FindMyGene/ |
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal) | Promega | Various | Choose based upon expression level and HaloTag orientation |
HaloTag TMR Ligand | Promega | G8251 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | 18896 | |
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System | Promega | G6500 | Contains HaloTag TMR ligand |
HaloTag Mammalian Pull-Down System | Promega | G6504 | |
Protease Inhibitor Cocktail, 50X | Promega | G6521 | |
Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | |
HaloTag Monoclonal Antibody | Promega | G9211 | |
ProTEV Plus | Promega | V6101 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
HaloLink Resin | Promega | G1912 | |
HDAC-Glo | Promega | G6420 | |
PBS + 0.1% Triton X-100 | For optional imaging | ||
4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS | For optional imaging | ||
Ethanol | |||
Tissue culture vessels and dishes | |||
Cell culture incubator | |||
Disposable cell lifter | Thermo Fisher Scientific | 08-773-1 | |
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder | Thermo Fisher Scientific | K885300-0002 | 25-27 G needle could also be used |
Microcentrifuge | |||
Tube rotator such as Labquake | Thermo Fisher Scientific | 4002110Q | Ideal for binding and washing steps |
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer | Thermo Fisher Scientific | 05-400-200 | Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps |
Chambered cover glass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | For optional imaging |
Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em) | For optional imaging |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved