הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1

תאי גזע של סרטן השחלות (OCSC) אחראים על התחלת סרטן, הישנות, עמידות טיפולית וגרורות. נישת כלי הדם OCSC נחשבת לקידום התחדשות עצמית של OCSCs, מה שמוביל לכימורסטיות. פרוטוקול זה מספק את הבסיס להקמת מודל נישה כלי דם OCSC הניתן לשחזור במבחנה.

תאי גזע סרטניים (CSCs) שוכנים בנישה תומכת, המהווה מיקרו-סביבה המורכבת מתאים סטרומליים סמוכים, כלי דם ומטריצה חוץ-תאית. היכולת של CSCs להשתתף בפיתוח אנדותל מהווה מאפיין חשוב התורם ישירות להבנה הכללית של מנגנוני הגידול וגרורות הגידול. מטרת עבודה זו היא לבסס מתודולוגיה הניתנת לשחזור כדי לחקור את יכולת ייזום הגידול של תאי גזע סרטניים בשחלות (OCSCs). כאן בחנו את מנגנון הניאו-וסקולריזציה בין תאי אנדותל ל-OCSCs יחד עם השינויים המורפולוגיים של תאי אנדותל באמצעות מודל התרבית במבחנה NICO-1. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של שלב הניאו-וסקולריזציה המקיף את ה-OCSCs באופן של קורס זמן. הטכניקה יכולה לספק תובנה לגבי התכונות האנגיוגנטיות של OCSCs בגרורות סרטניות.

סרטן השחלות הוא הממאירות השמינית בשכיחותה בקרב נשים ברחבי העולם, עם כ-300,000 אבחנות חדשות וכ-180,000 מקרי מוות בשנה¹. באבחון הראשוני, סרטן השחלות מופיע לעתים קרובות עם תסמינים חמורים, כאשר כ -75% מהחולים כבר בשלב III-IV. בהתאם לכך, שיעור ההישרדות ל-5 שנים הוא <30% ושיעור התמותה הוא הגבוה ביותר בקרב סוגי סרטן גינקולוגיים², כאשר יעילות הטיפול בסרטן השחלות תלויה מאוד בגורמים קליניים כגון ההישג המוצלח של ניתוח הפחתה, עמידות לכימותרפיה והישנות לאחר הטיפול הראשוני.

רקמות סרטן השחלות מאורגנות באופן היררכי, כאשר לא כל מרכיבי הגידול מסוגלים באותה מידה לייצר צאצאים. התאים היחידים המסוגלים לחדש את עצמם ולייצר אוכלוסיית תאי גידול הטרוגנית נחשבים כמייצגים תאי גזע סרטניים (CSCs)³. התחדשות עצמית של CSC וייזום גידולים מלווים בקידום אנגיוגנזה לשיפוץ המיקרו-סביבה של הגידול שלהם לצורך שמירה על נישה תומכת. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש במודלים קודמים לניתוחים חוץ-גופיים בגלל יכולת השחזור המוגבלת של גידול CSCs שמקורם בדגימות קליניות עקב שיבוש של ספרואידים לאחר מעבר מרובה. לאחרונה, פותחו שיטות ניסיוניות לטיפוח CSCs מחולים עבור מספר יישומים 4,5,6,7. בפרט, על ידי ניצול המאפיין של CSCs לגדול על ידי יצירת ספרואידים בלוחות חיבור נמוכים במיוחד עם מדיום ללא סרום, ה- CSCs המעובדים מושרים לבטא סמן פני שטח של תאי גזע שאינו מתבטא בתאי גידול רגילים עם פוטנציאל התמיינות רב-ליניארי ^8,9.

נתונים עדכניים הראו כי ההתמדה של שחלות רדומות (O)CSCs המוצגות כהפצה בצפק קשורה להתחדשותן כגידולים חוזרים¹⁰. הבנת התכונות המולקולריות והביולוגיות של OCSCs עשויה אפוא לאפשר מיקוד יעיל והשמדה של תאים אלה, וכתוצאה מכך הפוגה פוטנציאלית של הגידול. בפרט, מעט מאוד ידוע לגבי התכונות המכניסטיות התאיות והמולקולריות של תפקידי CSCs באנגיוגנזה¹¹. לכן, בפרוטוקול הנוכחי השתמשנו ב-OCSCs שמקורם בחולה במסגרת מבחנה כדי לחקור את התכונה האנגיוגנית של תאי אנדותל באמצעות מודל התרבית המשותפת, שעשוי לחקות את המיקרו-סביבה של תאי CSCs ואנדותל באתר הגרורתי בסביבה הקלינית. בסופו של דבר, מכיוון שניאו-וסקולריזציה מהווה תהליך קריטי הנחוץ לתמיכה בצמיחת הגידול ובגרורות, הבנה טובה יותר של המנגנון שלו תאפשר פיתוח של טיפול מיקוד חדשני עבור OCSCs באתר הגרורתי.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להמחיש את שלב הניאו-וסקולריזציה סביב ה-CSCs באופן של קורס זמן. היתרון של הפרוטוקול כולל מתן אפשרות למחקרים הניתנים לשחזור מלא באמצעות מערכת התרבית התלת-ממדית, NICO-1, ובכך לאפשר תצפית על ההשפעות על המטופלים של יכולת ייזום הגידול שמקורה ב-OCSC במהלך אנגיוגנזה של תאי אנדותל.

כל ההליכים בוצעו על פי הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לרווחת האדם. כל המטופלים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לשימוש המחקרי בדגימות שלהם, ואיסוף הרקמות והשימוש בהן למחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של מחקר הגנום האנושי, ניתוח גנים באוניברסיטת Teikyo.

1. בידוד ותרבית של תאי גזע מסרטן השחלות (OCSCs) מחולות עם סרטן השחלות ומיימת בארון בטיחות ביולוגית ברמה 2

1. לבודד תאי גזע סרטניים מיימת סרטן השחלות האנושית המתקבלת באמצעות פרסנטזיס. לאסוף לפחות 100-250 מ"ל של מיימת מחולים לקחת מספר מספיק של תאי גזע סרטניים. בנוסף, הערך את פרופילי הביטוי של סמני תאי גזע סרטניים (כלומר, EpCAM, קלרטין, CD133, CD44, CD45, ALDH1 ו- Oct4) וסמני סרטן השחלות (pAX-8, WT-1) על ידי ציטומטריה של זרימה.
   1. צנטריפוגה סרטן השחלות האנושיות מיימת ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתוך 24 שעות לאחר שאיפת מיימת.
   2. הסר את הסופרנטנט והוסף 2 מ"ל של OCSC בינוני ו-8 מ"ל של 30% תמיסת מלח חצובה של היסטודנץ/פוספט (PBS, pH 7.4).
   3. הכנת מדיום OCSC: תוסף תזונה StemPro hESC, DMEM⁄F-12 עם L-גלוטמין (מדיום GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-מרקפטואתנול, 8 ננוגרם/מ"ל FGF בסיסי, אינסולין 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר Y-27632.
   4. שכב בזהירות 2 מ"ל של מדיום OCSC לתמיסת התא בשלב 1.1.2 בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ברוטור דלי מתנדנד ללא בלימה.
   5. העבר בזהירות את שכבת OCSC (ללא הפרעה באינטרפאזה) לצינור חדש של 15 מ"ל על ידי העברת פיפט.
   6. מלא עם PBS עד 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.
   7. להשעות את גלולת התא במדיום OCSC וזרע על צלחת תרבית חיבור נמוך במיוחד; תרבויות צריך להישמר ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.
   8. שנה את המדיום כל שלושה ימים. בזהירות להעמיד את צלחת התרבית במשך כ 1 דקות, להשליך חלק supernatant ולהוסיף את המדיום החדש.
2. מעבר של CSCs
   1. אסוף OCSCs בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. מסירים את הסופרנטנט, ממלאים ב-PBS ומניחים צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים המורכבת מאנזימים פרוטאוליטיים וקולגנוליטיים (למשל, AccuMax), ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   4. מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ודא שהתאים נמצאים בתרחיף יחיד.
   5. מערבבים היטב על ידי פיפטציה, ממלאים ב-PBS וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את גלולת התא במדיום OCSC לזריעה לאחר מכן על צלחות תרבית בעלות חיבור נמוך במיוחד ותחזוקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.

2. תרבית תאי אנדותל HUEhT-1

1. מעבר תאי HUEhT-1
   1. הסר מדיום מתבשיל התרבית HUEhT-1 ושטוף את התאים עם PBS.
   2. יש להוסיף 1 מ"ל של 0.025% טריפסין ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. הוסף 5 מ"ל של צמיחת תאי אנדותל בינוני 2, אסוף תאים בצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הסר את הסופרנטנט, השהה את גלולת התא במדיום HUEhT-1, וזרע את התאים על מנות תרבית מצופות קולגן ולאחר מכן תחזוקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.
   5. שנה את המדיום כל שלושה ימים.

3. הכנת צלחת הקוקולטורה NICO-1 לבדיקת היווצרות צינורות באמצעות תאי HUEhT-1

1. הרכיבו NICO-1 וציפוי עם הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית (מטריצת מטריגל).
   1. הרכיבו צד אחד של NICO-1 בהתאם להוראות היצרן ושמרו על קרח.
   2. לכסות את פני השטח של NICO-1 עם 300 μL של PBS קר ולאחר מכן להסיר את המאגר.
   3. יש להוסיף 300 μL של הידרוג'ל מקורר על בסיס מטריצה חוץ-תאית ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות.
   4. כדי לאזן את המשקל, טבלו את המסנן עם 100% אתנול, ולאחר מכן שטפו מסנן ICCP בקוטר 13 מ"מ (0.6 מיקרומטר) עם PBS למשך דקה אחת.
   5. הרכיבו את ה-NICO-1 הכולל את שני חלקי הגוף העיקריים A (תא ימני) ו-B (תא שמאלי) יחד עם טבעת O ומסנן שיווי משקל.

4. זריעת תאי HUEhT-1 ותאי CSCs למערכת NICO-1

1. הכן את תרחיף תאי HUEhT-1 על ידי טריפסינזציה של מונו-שכבות התא והחייאת התאים במדיום צמיחת תאי אנדותל עם סרום עגל עוברי 2%.
2. הוסף 1.2 מ"ל של תרחיף התא (1.5 x 10^{5 תאים} ) לכל באר מצופה הידרוג'ל מבוססת מטריצה חוץ-תאית.
3. הוסף 1.5 מ"ל של OCSCs מתורבת במשך חמישה ימים לבאר השנייה.
4. דגירה NICO-1 ב 37 °C ב 5% CO₂; ניתן לצפות בהיווצרות צינורות תחת המיקרוסקופ והיווצרות הרשת על הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית הנמדד באמצעות מספר הענפים.

אספנו מיימת נוזלים שהתקבלו מחולות עם סרטן שחלות מתקדם במהלך ניתוח או פרסנטזיס לצורך ביצוע תרבית יציבה לטווח ארוך לספרואידים. כאן, אנו מציגים מקרים של תרבות ספרואידית ארוכת טווח של CSCs בשחלות המכונה CSC1 ו- CSC2. שני קווי התאים נושאים את אותם אבחנה ופרופילים היסטולוגיים. התפקידים המכניסטיים של OCSCs העומדים בבסיס האינטראקציה עם תאי האנדותל הדרושים כדי לגרום לניאו-וסקולריזציה של תאי אנדותל המקיפים את ה-OCSCs עדיין אינם ידועים. לכן, שמנו לנו למטרה להבהיר את התהליכים של התפתחות נישה וסקולרית CSC באתרים גרורתיים. בחנו את האינטראקציה בין תאי אנדותל (HUEhT-1) ו-OCSCs באמצעות מודל הקוקולטורה במבחנה NICO-1. איור 1 מראה השוואה של פעילות היווצרות צינורות המושרה על-ידי CSC1 ו-CSC2. מספר צינורות כלי הדם שנוצרו גדל באופן דרמטי עם הזמן בקולקולטורה עם CSC2 (איור 2A). לצורך הבקרה החיובית, אנו מציגים את איור 2B שמראה את התכונה האנגיוגנית של HuEhT-1 לאחר הטיפול ב-VEGF (10 ננוגרם/מ"ל) ללא תרבית משותפת של CSC2. כעת אנו מבהירים את המנגנון המפורט העומד בבסיס התוצאה. תרשים 3 מראה תמונות מייצגות של מודל coculture של OCSC עם תאי אנדותל באמצעות NICO-1. תאי HUEhT-1 עברו כריתה משותפת עם CSC2 במשך 20 שעות, ותמונת הווידאו בהילוך מהיר צולמה. איור 3A מראה את הפנוטיפ של CSC2 לפני ואחרי קולקולטורה במשך 20 שעות. איור 3B מראה תאי HUEhT-1 שעברו חקלאות בו-זמנית. ראוי לציין שתאי HUEhT-1 יצרו צינורות כלי דם במהלך הקוקולטורה עם CSC2 (איור 3C: וידאו קליפ)

איור 1: מודל נישה של כלי דם OCSCs. התפקידים המכניסטיים שבאמצעותם OCSCs גורמים להיווצרות צינוריות (כלי דם) של תאי אנדותל עדיין אינם ידועים. בחנו את האינטראקציה בין תאי אנדותל (HUEhT-1) ו-OCSCs באמצעות תרבית קו-תרבית חוץ-גופית, NICO-1. התא הימני של מערכת זו מורכב מכנס, המחזיק OCSCs עם המדיום התא. התא השמאלי מורכב מבאר המכילה תאי אנדותל ו- HUVECs עם אותו מדיום כמו בבאר הימנית.

איור 2: השוואה בין פעילויות הניאו-וסקולריזציה המושרות על-ידי OCSCs. עם הזמן, מספר צינורות כלי הדם שנוצרו גדל באופן דרמטי עם coculture עם CSC2.

איור 3: היווצרות כלי הדם של תאי HUEhT-1 בקולקולטורה עם CSC2 באמצעות NICO-1. תאי HUEhT-1 יצרו צינורות כלי דם במהלך הקוקולטורה עם CSC2.

הפרוטוקול המוצג מתאר כיצד לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול של OCSCs בסביבה חוץ-גופית. המרכיב העיקרי של השיטה מהווה את מודל החקלאות הניתן לשחזור ביותר המתקבל באמצעות מערכת NICO-1, מערכת קו-תרבית עקיפה של טרנסוול. רבים ממודלים של קוקולטורה הזמינים כיום בוחנים את ההשפעות של מגע ישיר בין תאים על אוכלוסיות תאים בתרבית 12,13,14,15,16,17,18^. המודל הפשוט ביותר שיכול לשמש לבחינת ההשפעות של תרבית משותפת עשוי להתרבות על ידי ערבוב ישיר של שני סוגי תאים, וניתן לבחון את מידת האינטראקציות ההטרוטיפיות וההומוטיפיות על ידי שינוי צפיפות הזריעה של כל סוג תא ויחס זריעה יחסי של תת-אוכלוסיות¹⁹. עם זאת, קשה לקבוע באופן ישיר את התרומות היחסיות של OCSCs לכל ההשפעות הנצפות של קולקולטורה באופן עצמאי על ידי מיקרוסקופיה בשל חוסר הנראות המדויק של כל תא; לפיכך, מחקרים אלה מלווים לעתים קרובות במקביל בניסויים תקשורתיים מותנים. לדוגמה, ניתן להשתמש במערכת קוקולטורה מופרדת במחקרים שבהם ההשפעות של איתות פראקריני על מיקרו-סביבה של גידולים מעניינות¹⁹. לשם השוואה, בשיטה הנוכחית אנו מתארים מודל המאפשר הערכה סימולטנית של ההשפעות של מגע בין תאים ואיתות פראקריני, המחקים את הארכיטקטורה של המיקרו-סביבה של הגידול המקומי.

אנגיוגנזה משמשת כסימן היכר של סרטן השחלות וממלאת תפקיד קריטי בהתקדמותו, הכוללת אינטראקציות בין תאים סרטניים, תאי אנדותל ומיקרו-סביבה של הגידול שמסביב²⁰. Bevacizumab היא תרופת מפתח ממוקדת מולקולרית המקובלת לשימוש בכימותרפיה משולבת לסרטן שחלות מתקדם²¹. באופן ספציפי, bevacizumab מהווה נוגדן חד שבטי נגד גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF). VEGF תורם להתפתחות קרצינומטוזיס פריטוניאלי, ויצירת מיימת ממאירה בסרטן שחלות או פריטוניאלי מתקדם על ידי קידום ניאו-וסקולריזציה ושיפור חדירות כלי הדם²². לכן, עיכוב VEGF הוכח כמעכב ייצור מיימת וצמיחת גידול מסיבית באתר הגרורתי. לפיכך, יש צורך בחקירה נוספת המכוונת ביעילות לתאי אנדותל וסקולריים מעוררי VEGF ברמת המיקרו-סביבה של הגידול. עם זאת, ייתכן שיהיה קשה להשתמש ביעילות במודלים פרה-קליניים, כגון מודלים של עכברים, עבור מחקרים אלה. לדוגמה, דווח כי הזיקה של bevacizumab עבור VEGF אנושי היא גבוהה ואילו זה של חלבון העכבר הוא^{נמוך 23}. זה אוכף מגבלה לגבי היישום של bevacizumab בתוך ניסויים שנועדו לחקור עוד יותר את מנגנון האנטי-VEGF שלה כלפי neovascularization במיקרו-סביבה של הגידול כפי שהתברר באמצעות מודלים של עכברים. לפיכך, יש צורך במודל מתאים עם ארכיטקטורה מבוקרת היטב כדי לשחזר את מרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול in vivo. במקרה כזה, נציין כי מערכת מודל הקוקולטורה במבחנה שלנו מאפשרת מעקב חי אחר התנהגות התאים בכל התרבית של OCSCs ותאי אנדותל שמקורם בחולה ומאפשרת לחקור את תת-אוכלוסיות התאים הבודדים הללו בתגובה לקולקולטורה.

הבנה טובה יותר של תפקידם של OCSCs ונישת כלי הדם שלהם יכולה לספק תובנות חדשות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עבור OCSCs. כפי שניתן לראות בניסויים המייצגים, נקודות החוזק של המודל הן בכך שהוא מספק פלטפורמת מחקר שנראית תואמת בחלקה את ההגדרות הקליניות, ומאפשרת פיתוח ובדיקה של תרופות חדשניות ממוקדות ויעילות יותר. נדרשים מחקרים נוספים עם שכפול קליני ישיר של התוצאות שלנו הכולל מספר משמעותי יותר של OCSCs שמקורם בחולה.

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי C (מענק מס' 19K09834 לק.נ.) ממשרד החינוך, המדע והתרבות, יפן.