تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1

الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSC) هي المسؤولة عن بدء السرطان ، والتكرار ، والمقاومة العلاجية ، وورم خبيث. يعتبر مكانة الأوعية الدموية OCSC لتعزيز التجديد الذاتي ل OCSCs ، مما يؤدي إلى المقاومة الكيميائية. يوفر هذا البروتوكول الأساس لإنشاء نموذج متخصص للأوعية الدموية OCSC قابل للتكرار في المختبر.

تتواجد الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في مكان داعم ، وتشكل بيئة دقيقة تتكون من خلايا انسجة مجاورة وأوعية ومصفوفة خارج الخلية. تشكل قدرة CSCs على المشاركة في تطوير البطانة خاصية مهمة تساهم بشكل مباشر في الفهم العام لآليات تكوين الورم وورم خبيث للورم. الغرض من هذا العمل هو إنشاء منهجية قابلة للتكرار للتحقيق في قدرة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) على بدء الورم. هنا ، قمنا بفحص آلية الأوعية الدموية الجديدة بين الخلايا البطانية و OCSCs جنبا إلى جنب مع التغيرات المورفولوجية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة في المختبر NICO-1. يسمح هذا البروتوكول بتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب OCSCs بطريقة الدورة الزمنية. يمكن أن توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة فيما يتعلق بالخصائص الوعائية ل OCSCs في ورم خبيث للورم.

سرطان المبيض هو ثامن أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين النساء في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 300,000 تشخيص جديد وما يقدر بنحو 180,000 حالة وفاة سنويا¹. عند التشخيص الأولي ، غالبا ما يظهر سرطان المبيض بأعراض حادة ، حيث يكون حوالي 75٪ من المرضى بالفعل في المرحلة الثالثة والرابعة. وفقا لذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات هو <30٪ ومعدل الوفيات هو الأعلى بين سرطانات أمراض النساء² ، مع كفاءة علاج سرطان المبيض تعتمد بشكل كبير على العوامل السريرية مثل الإنجاز الناجح لجراحة debulking ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والتكرار بعد العلاج الأولي.

يتم تنظيم أنسجة سرطان المبيض بشكل هرمي ، حيث لا تكون جميع مكونات الورم قادرة على توليد أحفاد متساوية. تعتبر الخلايا الوحيدة القادرة على التجديد الذاتي وإنتاج مجموعة من الخلايا السرطانية غير المتجانسة تمثل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs)³. يرافق التجديد الذاتي ل CSC وبدء الورم تعزيز تكوين الأوعية لإعادة تشكيل البيئة المكروية للورم لغرض الحفاظ على مكانة داعمة. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام النماذج السابقة للتحليلات المختبرية بسبب التكاثر المحدود لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من العينات السريرية بسبب تعطيل الأجسام الكروية بعد المرور المتعدد. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق تجريبية لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية من المرضى لعدة تطبيقات⁴،⁵،^6،7. على وجه الخصوص ، من خلال استغلال خاصية CSCs للنمو عن طريق تكوين كرويات في ألواح ربط منخفضة للغاية مع وسط خال من المصل ، يتم حث الخلايا الجذعية السرطانية المزروعة على التعبير عن علامة سطح الخلية الجذعية التي لا يتم التعبير عنها في الخلايا السرطانية الطبيعية مع إمكانية التمايز متعدد السلالات ^8,9.

أظهرت البيانات الحديثة أن استمرار المبيض الخامل (O) CSCs الذي يتم تصوره على أنه انتشار في الصفاق يرتبط بتجديدها كأورام متكررة¹⁰. وبالتالي فإن فهم السمات الجزيئية والبيولوجية ل OCSCs قد يسمح بالاستهداف الفعال لهذه الخلايا واستئصالها ، مما يؤدي إلى مغفرة الورم المحتملة. على وجه الخصوص ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بالسمات الميكانيكية الخلوية والجزيئية لأدوار CSCs في تكوين الأوعية^{الدموية 11}. لذلك ، في البروتوكول الحالي ، استخدمنا OCSCs المشتقة من المريض في بيئة مخبرية للتحقيق في خاصية تولد الأوعية الدموية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة ، والذي قد يحاكي البيئة المكروية للورم في الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا البطانية في الموقع النقيلي في الإعداد السريري. في نهاية المطاف ، نظرا لأن الأوعية الدموية الجديدة تشكل عملية حاسمة ضرورية لدعم نمو الورم وورم خبيث ، فإن الفهم الأفضل لآليته سيسمح بتطوير علاج استهداف جديد ل OCSCs في الموقع النقيلي.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب CSCs بطريقة الدورة الزمنية. تتضمن ميزة البروتوكول السماح بإجراء تحقيقات قابلة للتكرار بالكامل باستخدام نظام الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد ، NICO-1 ، مما يسمح بمراقبة التأثيرات على المرضى من قدرة بدء الورم المشتقة من OCSC أثناء تكوين الأوعية الدموية للخلايا البطانية.

تم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب البروتوكول الذي وافقت عليه لجنة الأخلاقيات لرفاهية الإنسان. قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام البحثي لعيناتهم ، وتمت الموافقة على جمع واستخدام الأنسجة لهذه الدراسة من قبل الجينوم البشري ، لجنة أخلاقيات أبحاث تحليل الجينات في جامعة تيكيو.

1. عزل وزراعة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض والاستسقاء في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2

1. عزل الخلايا الجذعية السرطانية من استسقاء سرطان المبيض البشري الذي يتم الحصول عليه عن طريق البزل. جمع ما لا يقل عن 100-250 مل من الاستسقاء من المرضى لاتخاذ عدد كاف من الخلايا الجذعية السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتقييم ملامح التعبير لعلامات الخلايا الجذعية السرطانية (على سبيل المثال ، EpCAM و Calretinin و CD133 و CD44 و CD45 و ALDH1 و Oct4) وعلامات سرطان المبيض (pAX-8 و WT-1) عن طريق قياس التدفق الخلوي.
   1. جهاز الطرد المركزي استسقاء سرطان المبيض البشري عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة خلال 24 ساعة بعد شفط الاستسقاء.
   2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 2 مل من وسط OCSC و 8 مل من محلول ملحي مخزن بنسبة 30٪ Histodenz / phosphate (PBS ، درجة الحموضة 7.4).
   3. تحضير وسيط OCSC: مكمل StemPro hESC ، DMEM ⁄F-12 مع L-glutamine (وسط GlutaMAX) ، 25٪ BSA ، 100 ميكرومتر 2-mercaptoethanol ، 8 ng / mL FGF الأساسي ، 10 ميكرومتر الأنسولين ، و 20 ميكرومتر Y-27632.
   4. قم بتراكب 2 مل من وسط OCSC بعناية على محلول الخلية في الخطوة 1.1.2 في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في دوار دلو متأرجح بدون كبح.
   5. انقل بعناية طبقة OCSC (دون إزعاج في الطور البيني) إلى أنبوب جديد سعة 15 مل بواسطة ماصة النقل.
   6. املأ مع PBS حتى 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية.
   7. إعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط OCSC والبذور على طبق ثقافة منخفض للغاية ؛ يجب الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
   8. تغيير الوسيط كل ثلاثة أيام. قف بعناية طبق الثقافة لمدة 1 دقيقة ، وتخلص من جزء من المادة الطافية وأضف الوسيلة الجديدة.
2. مرور CSCs
   1. اجمع OCSCs في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بإزالة المادة الطافية ، واملأها ب PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 1 مل من محلول انفصال الخلية المكون من إنزيمات المحللة للبروتين والكولاجين (على سبيل المثال ، AccuMax) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   4. تخلط جيدا عن طريق السحب واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تأكد من وجود الخلايا في تعليق واحد.
   5. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات ، وملء مع PBS ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط OCSC للبذر اللاحق على أطباق الاستزراع ذات التعلق المنخفض للغاية وصيانتها عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.

2. زراعة الخلايا البطانية HUEhT-1

1. مرور خلايا HUEhT-1
   1. قم بإزالة الوسط من طبق الثقافة HUEhT-1 واغسل الخلايا باستخدام PBS.
   2. أضف 1 مل من 0.025٪ تربسين واحتضانه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. أضف 5 مل من وسط نمو الخلايا البطانية 2 ، واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط HUEhT-1 ، وزرع الخلايا على أطباق الاستزراع المغلفة بالكولاجين متبوعة بالصيانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
   5. تغيير الوسيط كل ثلاثة أيام.

3. تحضير صفيحة الاستزراع المشترك NICO-1 لفحص تكوين الأنبوب باستخدام خلايا HUEhT-1

1. قم بتجميع NICO-1 والطلاء باستخدام هيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية (Matrigel Matrix).
   1. قم بتجميع جانب واحد من NICO-1 باتباع تعليمات الشركة المصنعة واحتفظ به على الثلج.
   2. قم بتغطية سطح NICO-1 ب 300 ميكرولتر من PBS البارد ثم قم بإزالة المخزن المؤقت.
   3. أضف 300 ميكرولتر من هيدروجيل مبرد قائم على المصفوفة خارج الخلية واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
   4. لتحقيق التوازن ، اغمر المرشح بالإيثانول بنسبة 100٪ ، ثم اغسل مرشح ICCP مقاس 13 مم (0.6 ميكرومتر) باستخدام PBS لمدة دقيقة واحدة.
   5. قم بتجميع NICO-1 بما في ذلك أجزاء الجسم الرئيسية A (الغرفة اليمنى) و B (الغرفة اليسرى) جنبا إلى جنب مع الحلقة O والفلتر المتوازن.

4. زرع خلايا HUEhT-1 و CSCs على نظام NICO-1

1. تحضير معلقات الخلايا HUEhT-1 عن طريق trypsinizing أحادي الخلية وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو الخلايا البطانية مع مصل عجل الجنين 2٪.
2. أضف 1.2 مل من معلق الخلية (1.5 × 10⁵ خلايا) إلى كل بئر مطلي بالهيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية.
3. أضف 1.5 مل من OCSCs المستزرعة لمدة خمسة أيام إلى البئر الآخر.
4. احتضان NICO-1 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ ؛ يمكن ملاحظة تكوين الأنبوب تحت المجهر وتشكيل الشبكة على هيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية يتم قياسه عن طريق عدد الفروع.

قمنا بجمع سوائل الاستسقاء التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض المتقدم أثناء الجراحة أو البزل لغرض إجراء ثقافة مستقرة طويلة الأجل للكرويات. هنا ، نقدم حالات لثقافة كروية طويلة الأجل من CSCs المبيض تسمى CSC1 و CSC2. يحمل كلا خطي الخلية نفس التشخيص والملامح النسيجية. لا تزال الأدوار الميكانيكية ل OCSCs الكامنة وراء التفاعل مع الخلايا البطانية اللازمة للحث على الأوعية الدموية الجديدة للخلايا البطانية المحيطة ب OCSCs غير معروفة. لذلك ، كنا نهدف إلى توضيح عمليات تطوير مكانة الأوعية الدموية CSC في المواقع النقيلية. درسنا التفاعل بين الخلايا البطانية (HUEhT-1) و OCSCs باستخدام نموذج الزراعة المشتركة في المختبر NICO-1. يوضح الشكل 1 مقارنة بين نشاط تكوين الأنبوب الناجم عن CSC1 و CSC2. زاد عدد الأنابيب الوعائية المشكلة بشكل كبير بمرور الوقت في الاستزراع المشترك مع CSC2 (الشكل 2 أ). بالنسبة للتحكم الإيجابي ، نقدم الشكل 2B الذي يوضح خاصية تولد الأوعية الدموية ل HuEhT-1 بعد علاج VEGF (10 نانوغرام / مل) دون زراعة مشتركة ل CSC2. نحن الآن نوضح الآلية التفصيلية التي تقوم عليها النتيجة. الشكل 3 يظهر صورا تمثيلية لنموذج الاستزراع المشترك ل OCSC مع الخلايا البطانية باستخدام NICO-1. تم استزراع خلايا HUEhT-1 مع CSC2 لمدة 20 ساعة ، وتم التقاط صورة فيديو الفاصل الزمني. يوضح الشكل 3A النمط الظاهري ل CSC2 قبل وبعد الاستزراع المشترك لمدة 20 ساعة. يوضح الشكل 3B خلايا HUEhT-1 المستزرعة في نفس الوقت. من الجدير بالذكر أن خلايا HUEhT-1 شكلت أنابيب الأوعية الدموية أثناء الاستزراع المشترك مع CSC2 (الشكل 3C: مقطع فيديو)

الشكل 1: نموذج مكانة الأوعية الدموية OCSCs. لا تزال الأدوار الميكانيكية التي تحفز بها OCSCs تكوين الأنبوب (الأوعية الدموية) للخلايا البطانية غير معروفة. درسنا التفاعل بين الخلايا البطانية (HUEhT-1) و OCSCs باستخدام وضع الثقافة المشتركة في المختبر ، NICO-1. تتكون المقصورة اليمنى لهذا النظام من ملحق يحمل OCSCs مع وسط الخلية. تتكون الحجرة اليسرى من بئر تحتوي على خلايا بطانية و HUVECs بنفس الوسط الموجود في البئر الأيمن.

الشكل 2: مقارنة بين أنشطة الأوعية الدموية الجديدة التي تسببها OCSCs. بمرور الوقت ، زاد عدد أنابيب الأوعية الدموية المشكلة بشكل كبير عند الاستزراع المشترك مع CSC2.

الشكل 3: تكوين الأوعية الدموية لخلايا HUEhT-1 مع CSC2 باستخدام NICO-1. شكلت خلايا HUEhT-1 أنابيب الأوعية الدموية أثناء الاستزراع المشترك مع CSC2.

يصف البروتوكول المقدم كيفية محاكاة البيئة المكروية للورم في OCSCs في بيئة معملية. يشكل المكون الأساسي للطريقة نموذج الاستزراع المشترك القابل للتكرار بدرجة كبيرة والذي تم الحصول عليه باستخدام نظام NICO-1 ، وهو نظام استزراع مشترك غير مباشر في Transwell. تدرس العديد من نماذج الاستزراع المشترك المتاحة حاليا آثار الاتصال المباشر بين الخلية والخلية على مجموعات الخلايا المستزرعة¹²،^13،14،^15،16،^17،18. يمكن أن يتكاثر أبسط نموذج يمكن استخدامه لفحص تأثيرات الاستزراع المشترك عن طريق الخلط المباشر لنوعين من الخلايا ، ويمكن فحص مدى التفاعلات غير المتجانسة والمتجانسة عن طريق تغيير كثافات البذر لكل نوع من الخلايا ونسبة البذر النسبية للسكان الفرعيين¹⁹. ومع ذلك، فإن التحديد المباشر للمساهمات النسبية ل OCSCs في أي آثار ملحوظة للاستزراع المشترك بشكل مستقل عن طريق الفحص المجهري أمر صعب بسبب الاختفاء الدقيق لكل خلية؛ وبالتالي ، غالبا ما تكون هذه الدراسات مصحوبة بالتوازي مع تجارب الوسائط المشروطة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نظام الاستزراع المشترك المنفصل في الدراسات التي تكون فيها تأثيرات إشارات paracrine على البيئة المكروية للورم ذات أهمية¹⁹. بالمقارنة ، في الطريقة الحالية ، نصف نموذجا يسمح بالتقييم المتزامن لتأثيرات الاتصال بين الخلية والخلية وإشارات paracrine ، والتي تحاكي بنية البيئة المكروية للورم الأصلي.

يعمل تكوين الأوعية الدموية كسمة مميزة لسرطان المبيض ويلعب دورا مهما في تقدمه ، والذي يتضمن تفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية والبيئة المكروية للورم المحيط²⁰. بيفاسيزوماب هو دواء رئيسي يستهدف الجزيئات تم قبوله على نطاق واسع للاستخدام في العلاج الكيميائي المركب لسرطان المبيض المتقدم²¹. على وجه التحديد ، يشكل بيفاسيزوماب جسما مضادا وحيد النسيلة ضد عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). يساهم VEGF في تطور سرطان الصفاق ، وتشكيل الاستسقاء الخبيث في سرطان المبيض أو البريتوني المتقدم من خلال تعزيز الأوعية الدموية الجديدة وتعزيز نفاذية الأوعية الدموية²². لذلك ، ثبت أن تثبيط VEGF يمنع إنتاج الاستسقاء ونمو الورم الهائل في الموقع النقيلي. وبالتالي ، هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات التي تستهدف بشكل فعال الخلايا البطانية الوعائية المحفزة ب VEGF في مستوى البيئة المكروية للورم. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب استخدام النماذج قبل السريرية بشكل فعال ، مثل نماذج الفئران ، لهذه الدراسات. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن تقارب بيفاسيزوماب ل VEGF البشري مرتفع في حين أن بروتين الفأر أقل²³. هذا يفرض قيودا فيما يتعلق بتطبيق بيفاسيزوماب ضمن التجارب المصممة لمزيد من التحقيق في آلية مكافحة VEGF نحو الأوعية الدموية الجديدة في البيئة المكروية للورم كما تم التحقق منها باستخدام نماذج الفئران. لذلك هناك حاجة إلى نموذج مناسب ببنية جيدة التحكم لتلخيص مكونات البيئة المكروية للورم في الجسم الحي. في مثل هذه الحالة ، نلاحظ أن نظام نموذج الاستزراع المشترك في المختبر يسمح بالتتبع المباشر لسلوك الخلية في جميع أنحاء ثقافة OCSCs المشتقة من المريض والخلايا البطانية ويسمح بدراسة هذه المجموعات الفرعية للخلايا الفردية استجابة للزراعة المشتركة.

يمكن أن يوفر الفهم الأفضل لدور OCSCs ومكانتها الوعائية رؤى جديدة لتطوير استراتيجيات علاجية ل OCSCs. كما هو موضح في التجارب التمثيلية ، تتمثل نقاط القوة في النموذج في أنه يوفر منصة دراسة تبدو متطابقة جزئيا مع الإعدادات السريرية ، مما يتيح تطوير واختبار عقاقير جديدة أفضل استهدافا وفعالية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات مع التكرار السريري المباشر لنتائجنا التي تنطوي على عدد أكبر من OCSCs المشتقة من المرضى.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل من خلال منحة معونة للبحث العلمي C (منحة رقم 19K09834 إلى K.N.) من وزارة التعليم والعلوم والثقافة ، اليابان.