וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

ב- active presynaptic קצות עצבים היקפיים, הסינפטיות עוברים מחזורים של מסכות, אנדוציטוזה. במהלך מיחזור, התחומים luminal של חלבונים transmembrane SV הופכים חשופים על פני התא. אחד החלבונים האלה הוא Synaptotagmin-1 (Syt1). נוגדן נגד תחום luminal של Syt1, פעם נוספו המדיום תרבות, הוא נלקח במהלך מחזור exo-endocytotic. זו תפיסה פרופורציונלית לכמות SV מיחזור, ניתן לכמת דרך immunofluorescence. כאן, אנו משלבים את ספיגת נוגדן Syt1 עם תרביות תאים כפול של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית. זה מאפשר לנו (1) בתרגום אתרי presynaptic המבוססים על ביטוי של סמן רקומביננטי presynaptic Synaptophysin, (2) לקבוע את הפונקציונליות שלהם באמצעות ספיגת Syt1 ו- (3) לאפיין את המיקוד ואת ההשפעות של חלבון של עניין, GFP-Rogdi.

לומד שלפוחית סינפטית מיחזור חשוב בקביעת כיצד לשנות מאפיינים presynaptic, במהלך הפלסטיות הסינפטית או בתגובה ההפרעות בתפקוד סינפטית. נוגדן ספיגת לומד Synaptotagmin-1 (Syt1) מספק שיטה אחת של מד-SV מיחזור. Syt1 הוא חלבון SV-הקשורים משמש חיישן^{2 +} Ca, הוא הכרחי עבור שחרור exocytotic של הנוירוטרנסמיטר^1,2. . זה חלבון טראנסממברנלי עם תחום cytoplasmic C-מסוף מחוץ ה-SV, תחום luminal של N-מסוף בתוך SV³... במהלך אקסוציטוזה, תחום luminal של Syt1 הופך להיות חשוף למדיום החיצוני. למדיום החיצוני זה, אנו מוסיפים נוגדנים נגד קבוצת המחשבים cytoplasmic, אשר הופך הפנימו במהלך אנדוציטוזה. נוגדנים אלו יכולים להיות שגם מראש מצומדת עם fluorophores או immunostained עם נוגדנים משניים^4,5,6,7. עוצמת קרינה פלואורסצנטית immunosignal שנוצר הוא יחסי לסכום של SV מיחזור. גישה זו יכול לשמש כדי לקבוע SV מכוננת והן דפולריזציה-induced מיחזור^6,8.

מבחני ספיגת Syt1 יכול להתבצע לאחר העברה גנטית וירוס בתיווך על כמעט כל התאים בצלחת או לאחר תרביות תאים דליל של מספר קטן של תאים. השיטה שלנו משלב וזמינותו עם תרביות תאים זוגיים דלילה של נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי באמצעות סידן פוספט⁹. אנו משתמשים חלבון רקומביננטי סמן ידוע לצבור ב presynapses, Synaptophysin fluorescently מתויגות, לאיתור מסופי presynaptic של overexpress שלנו חלבון של עניין, Rogdi. זה מאפשר לנו לבדוק אם לאו Rogdi מטרות פונקציונלי synapses ומשפיע SV מיחזור. הגן קידוד Rogdi זוהה במקור ב מסך למוטאנטים דרוזופילה מאופיין זיכרון לקוי¹⁰. בבני אדם, מוטציות בגן Rogdi לגרום מחלה נדירה ולא הרסניות הנקראת תסמונת Kohlschütter-Tönz. חולים הסובלים אמייל השיניים מומים pharmacoresistant אפילפסיה, העיכובים psychomotor; עם זאת, ההתאמה subcellular של המוצר הגן נשאר חמקמק¹¹. לפיכך, וזמינותו ספיגת Syt1 סיפק ראיות מפתח עבור ההתאמה של GFP מתויג Rogdi הסינפסות פונקציונלי⁹.

טכניקה זו ספיגת יש מספר יתרונות. ראשית, SV מיחזור יכול להיות שנצפו הן בזמן אמת על ידי ביצוע חי^7,הדמיה¹², ואחרי קיבוע^6,9 על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של התווית זריחה Syt1. בנוסף, פותחו גרסאות שונות של נוגדן Syt1. ישנם גרסאות לא מתויגות ניתן שכותרתו עם נוגדנים משניים בעקבות פרוטוקול סטנדרטי immunostaining לאחר קיבוע, וכל הווריאנטים מצומדת מראש עם תווית פלורסצנטיות כבר מצורף. לבסוף, זריחה נוגדן מבוססי היא יתרון בשל מבחר עשיר של צבעים משניים או מצומדת זמינים מסחרית שניתן להשתמש בהם.

כאשר תיקון ו immunostaining הנוירונים, זה גם אפשרי כתם חלבונים נוספים ולבצע ניתוח colocalization. זה יכול לעזור לקבוע היכן הם ממוקמים ביחס SVs מיחזור. האינטנסיביות של התווית פלורסצנטיות היא מדד ישיר של כמות SV מיחזור. בנוסף, הנוגדנים באופן סלקטיבי תווית מבנים המכילים Syt1, וכתוצאה מכך ירידה לפרטים גבוה מעט רקע זריחה⁴. פרוטוקולים גירוי שונות יכולות לשמש, כגון מאגרי דפולריזציה או גירוי חשמלי פרוטוקולים^9,12,13,14. עם זאת, מיחזור SV הבזליים ניתן למדוד ללא גירוי של תרבויות עצביים¹⁵.

השיטה שלנו מטפל באופן ספציפי Syt1 ספיגת נוגדן בנוירונים transfected כפול עם נוגדן משני immunolabeling לאחר קיבוע. עם זאת, אנו מתייחסים כל הווריאציות בשימוש שגרתי של וזמינותו בדיון שלנו לתת לצופים הזדמנות להתאים הפרוטוקול לצרכים הספציפיים.

אין מחקרים עם בעלי חיים נערכו. ניסויים המערבות בעלי חיים לאללה לקבל תא תרבויות אושרו על ידי רשויות מקומיות להגנת בעלי חיים (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin גטינגן) תחת האישור למספר T10/30. הניסויים נערכו עם הפרוטוקולים המאושרים.

1. תרבית תאים בהיפוקמפוס ראשי

1. להכין את התרבות התא הפומבית של ההיפוקמפוס חולדה על^16,19¹⁷יום עובריים. צלחת התאים על coverslips 12 מ"מ מצופה polyethyleneimine (פיי) במנות 24-ובכן-צפיפות של 50,000-60,000 תאים/טוב. בדוק את צפיפות באמצעות תא ספירת לשכת ושלב אופטיקה חדות.
2. תרבות הנוירונים במשך 3 ימים (יום במבחנה (DIV) 3) של צלחת 24-ובכן בחממה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
3. להעריך את coverslips עבור אינדיקטורים של תקינות התא באמצעות מיקרוסקופ אור המשודרת (למשל, שלב ניגודיות אופטיקה בהגדלה גדולה של 10-20 X). בדוק אם האינדיקטורים הבאים של בריאות טובה: הילה ניגודיות שלב ברור, neurites בלי חרוזים מבנים, ו אין סומא קיבוץ באשכולות או neurite bundling.

2. תקנים

הערה: הפרוטוקול הבא מתייחס כפול-תרביות תאים עבור 3 בארות. עם זאת, הפרוטוקול פועלת בצורה הטובה ביותר כאשר כמויות מספיקות עבור 4 בארות מוכנים.

1. הכנת 500 מ"ל של תרביות תאים מאגר (274 מ"מ NaCl, 10 מ מ. אשלגן כלורי, 1.4 מ מ נה₂HPO₄, 15 מ מ גלוקוז, 42 מ"מ HEPES) בתוך הבקבוק Erlenmeyer.
   1. להמיס 8.0 גר' NaCl, 0.37 גרם אשלגן כלורי, g 0.095 של נה₂HPO₄, 1.35 גר' גלוקוז ו- g 5.0 של HEPES ב- 400 מ ל מים מזוקקים flask Erlenmeyer.
   2. להתאים את ה-pH עולה 6.95 עם NaOH M 1 באמצעות מד pH.
   3. לכוון את עוצמת הקול עם מים מזוקקים עד 500 מ"ל, לבדוק את ה-pH באמצעות מד pH.
   4. להפוך aliquots 20-30 מ של תרביות תאים מאגר עם ערכי pH הבאים על-ידי pipetting 1 NaOH M למאגר תרביות תאים: 6.96 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, הגנה 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      הערה: ה-pH של המאגר תרביות תאים חיונית היעילות תרביות תאים.
   5. כדי לבדוק אילו תקנים מאגר מוביל המספר הגבוה ביותר של תאים transfected, לבדוק כל ערך ה-pH של 6.96 7.11. השתמש בשיטת תרביות תאים שמתואר 2.2-2.11, על פלסמיד המאומת לבטא GFP. לקבוע את מספר התאים transfected לכל coverslip עבור כל ערך ה-pH של מאגר תרביות תאים להעריך אילו מאגר עובד הכי טוב.
   6. Aliquot המאגר עם יעילות תרביות תאים הגבוהה לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל להקפיא ולאחסן הצינורות ב-20 ° C.
2. לחמם את מופחת סרום בינוני בינוני התרבות תאים, מים מזוקקים עד 37 ° C באמבט מים.
3. הכינו את התמהיל תרביות תאים צינור microcentrifuge 1.5 mL. לעבוד תחת למינארי על מנת להבטיח תנאי עבודה סטרילית.
   1. מיקס 7.5 µL של 2 מ' סידן כלורי עם 4 µg של כל DNA ללא אנדוטוקסין (Synaptophysin-מורנג ו- mGFP/GFP-Rogdi). מוסיפים מים כדי להגיע הנפח הכולל של 60 מ ל צינור microcentrifuge 1.5 mL.
   2. להוסיף 60 מ של תרביות תאים מאגר לתערובת. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, להוסיף למאגר תרביות תאים dropwise תוך כדי טלטול DNA-לערבב בעדינות על המערבולת.
   3. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות. נמנעים מללחוץ את הצינור הדגירה במהלך זמן הדגירה על ידי הנחת הצינור ליד למינארי.
4. מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית, להסיר את המדיום תרבות תא ("בינוני ממוזגים") מן הבארות באמצעות pipet 1000 מ"ל ואחסן אותו במיכל נפרד בחממה.
5. להוסיף 500 מ"ל של מדיום מופחת סרום מכל קידוח. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עד תקופת הדגירה 20 דקות (שלב 2.3.3).
6. להוסיף 30 מ של תרביות תאים לערבב כל טוב על-ידי pipetting מספר טיפות. למחוק את השאריות בתחתית הצינורית.
7. לאחר כל הבארות אלו שסופקו עם תערובת תרביות תאים, לנער בעדינות את הצלחת 24-טוב על מנת להבטיח הפצה של המיקס תרביות תאים בטווח הבינוני.
8. תקופת דגירה הבארות של 60 דקות-CO 37 ° C ו-5%₂.
9. להסיר למחוק את התמהיל תרביות תאים, לשטוף אותו שלוש פעמים עם תא תרבות בינוני. להוסיף 1 מ"ל של התא תרבות בינוני מכל קידוח, דגירה אותם למשך 30 שניות ב RT. להסיר 750 מ"ל של מדיום ולהוסיף את אותה כמות בינונית טרייה. חזור על זה שלוש פעמים.
   הערה: השלב כביסה הוא קריטי. לשמור על הפעם בה כל טוב יש לא בינוני לכל הפחות (כלומר., להסיר ולהחליף טוב-מאת-טוב) ולהוסיף המדיום כביסה בעדינות.
10. להסיר, למחוק את המדיום תרבות תא ולהוסיף 450 מ של ממוזגים בינוני טוב-מאת-טוב.
11. תן את הנוירונים בוגרים בחממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ עד DIV 10.

3. Syt1 ספיגה ולניתוח

הערה: הפרוטוקול הבא חל על תפיסה 3 בארות. דפולריזציה של כל מספר אחר של בארות, להתאים את הכמויות בהתאם.

1. להכין 50 מ של 10 x דפולריזציה (640 מ"מ NaCl, 700 מ"מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl₂, 20 מ מ CaCl₂, 300 מ"מ גלוקוז, 200 מ"מ HEPES, pH 7.4) של מאגר הבקבוק Erlenmeyer.
   הערה: מאגר דפולריזציה ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. אם פתרון שאינו depolarizing משמש גם, להכין 10 הפתרון של x Tyrode המורכב מ מ 1290 NaCl, 50 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl₂, 20 מ מ CaCl₂, 300 מ"מ גלוקוז, 200 מ"מ HEPES pH 7.4 על מנת להשוות גירוי הנוצרות על-ידי מיחזור עם ספונטנית מיחזור. לאחר דילול ל- 1 x, להוסיף 1 מיקרומטר של טטרודוקסין לפני השימוש כדי לחסום את פוטנציאל הפעולה הדור.
   1. להמיס 1.87 g של NaCl, g 2.61 של אשלגן כלורי, 0.1 גר' MgCl₂-6 H₂0, 0.15 גרם CaCl₂-2 H₂O ואת 3.0 גר' גלוקוז-1 H₂O g 2.38 של HEPES ב 50 מ ל מים מזוקקים flask Erlenmeyer. להתאים את ה-pH עם NaOH וסינון סטרילי-הפתרון. לדלל 1:10 מאגר במים מזוקקים להשגת ריכוז 1 x.
2. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS (pH 7.4) קיבוע לאחר גירוי.
   1. עבור 500 מ של 4% מחברים ב- PBS 1 x, לפזר 20 גר' paraformaldehyde ב 450 מ של מזוקקים H₂O.
      הערה: חימום הפתרון עשוי להאיץ את המסת, אך שלא לחמם את הפתרון מעל 70 מעלות צלזיוס, כאשר מחברים עלולה להתפרק.
      זהירות: PFA היא רעילה, קרצינוגני ו- teratogenic. יש ללבוש כפפות בעת עבודה עם כדורגלן, לעבוד תחת מכסה המנוע fume ולהימנע בליעה.
   2. ומצננים את פתרון כדי RT ולהוסיף 50 מ של פתרון מניות PBS x 10. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH/HCl באמצעות מד pH.
3. לחמם 600 מ ל 1 x מאגר דפולריזציה של 10 מ"ל של התא תרבות בינוני עד 37 ° C באמבט מים.
4. להוסיף 1 מ"ל של נוגדן anti-Syt1 העכבר (שיבוט 604.2) 1-מאגר דפולריזציה ו מערבולת למשך 10 שניות.
5. להסיר ולמחוק את המדיום התרבות התא מהתאים. להוסיף 200 מ של המיקס דפולריזציה-נוגדן אחד טוב, תקופת דגירה של 5 דקות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממה.
6. להסיר למחוק את התמהיל דפולריזציה-נוגדן, לשטוף אותו שלוש פעמים עם תא תרבות בינוני. להוסיף 1 מ"ל של התא תרבות בינוני מכל קידוח, תקופת דגירה של 30 שניות ב RT. להסיר 750 מ"ל של מדיום ולהוסיף את אותה כמות בינונית טרייה. אני חוזר שלוש פעמים.
7. להסיר, למחוק את המדיום תרבות תא ולהוסיף 300 מ של 4% מחברים ב- 1 x PBS. תקופת דגירה של 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
8. רחץ שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1 x PBS.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

4. Immunocytochemistry

1. להכין 50 מ של מאגר חסימה.
   הערה: חסימת מאגר ניתן לשמור ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
   1. להמיס 2.5 g של סוכרוז ו- 1g של אלבומין שור (BSA) ב 5 מ של פתרון מניות PBS x 10. להוסיף 1.5 מיליליטר 10% הפתרון מניות דטרגנט. מערבבים את הפתרון עד שכל הרכיבים יש מומס כראוי ולהוסיף מזוקקים H₂O עד שהגיע נפח סופי של 50 מ. Aliquot הפתרון ומקפיאים את aliquots עבור אחסון.
2. לדלל המשני, מצמידים fluorophore הנוגדן (מכוונת נגד המין Syt1-נוגדן ראשוני) ב- 200 מ של מאגר חסימה של כל טוב-לדילול 1:1000.
3. להסיר ולמחוק מגניב 1 x מ המכילים כל אחד טוב של coverslip.
4. להוסיף 200 מ של חסימת שילוב מאגר-נוגדן מכל קידוח ולאחר תקופת דגירה של 60 דקות ב- RT.
   התראה: מאחר נוגדנים משניים הם רגישים לאור, כל הצעדים להתקדם חייב להתבצע בחושך.
5. לאחר דגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1 מ"ל של PBS 1 x.
6. להטביע את coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם המדיום ההטבעה.
   1. להוסיף טיפה 7 mL הטבעה בינוני על גבי השקופית מיקרוסקופ. הסר את coverslip הצלחת 24-ובכן באמצעות הרמת אותו עם מזרק תופס אותו עם מלקחיים.
      התראה: תאים על משטח coverslip בקלות פגומים, אז מלקחיים יש לטפל בזהירות.
   2. טובלים את coverslip לתוך מים מזוקקים כדי להסיר את PBS לייבש אותו בקפידה על-ידי נגיעה צד אחד כדי רקמה רכה.
   3. להעיף את coverslip על גבי ה-droplet בינוני ההטבעה, כך השטח נושאת את התאים פונה השקופית מיקרוסקופ, ובכך הטבעה התאים אל המדיום ההטבעה.
7. להשאיר את השקופיות יבש מתחת למכסה המנוע עבור h 1-2 (לכסות אותם כדי למנוע חשיפה קלה) ולאחסן אותם בקופסה שקופיות מיקרוסקופ ב 4 º C.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

5. ניתוח מיקרוסקופי

1. לאחר coverslips יבשה, למקם אותם תחת המיקרוסקופ עם המטרה ואת המצלמה.
2. להתאים את זמן החשיפה לערוץ כל כך כמה פיקסלים הם חשיפת כדי להבטיח הפצה המרבי של ערכי אפור.
   הערה: בזמן חשיפה הזמן עשוי להשתנות בין הערוצים, זה צריך להיות קבועה עבור ערוץ אחד להבטיח comparability בין coverslips.
3. לרכוש תמונות מרובה ערוצים עבור 10 אזורים מעניינים (ROIs) לכל coverslip. בדוק כי רועי מכיל תהליכים עצב נוירון transfected בבדיקת ה-GFP-זריחה, אשר אמור להיות punctate.

6. ניתוח סטטיסטי

1. לייצא את התמונות כקבצים. tif. לטעון את התמונות לתוך OpenView¹⁸ על-ידי לחיצה על קובץ | טעינת קובץ תמונה.
2. בחר את התמונה Synaptophysin-מורנג כערוץ 1 בתמונה Rogdi-GFP/mGFP כמו ערוץ 2, בתמונה זריחה Alexa647 כמו ערוץ 3.
3. סף ROIs.
   1. לחץ על ניתוח | אזור מקום מעל puncta. לבחור ערכי הסף ו דלתא בעוצמה כך על בדיקה ויזואלית, זריחה ' מאטום לשקוף ' הוא נשלל, עוזב רק punctate אותות בדמותו של ערוץ 1 (זריחה Synaptophysin-מורנג ייצוג). שמור את הסף זהה עבור כל התמונות.
4. העברת אלה ROIs לערוץ המתאים 2 (זריחה GFP-Rogdi/mGFP) ו- 3 (Syt1-זריחה) של כל אזור coverslip על ידי לחיצה על ביצוע עכשיו.
   הערה: ROIs צריך להיחשב רק אם התא אינו transfected כפול. בשיטה זו, זריחה מורנג GFP צריך להיות ברור לעין.
5. לשמור את הנתונים לתוך עורך יומן ניתוח על ידי לחיצה על נתוני יומן רישום.
6. לפתוח את עורך יומן ניתוח תחת הלשונית Windows ולהעתיק את הערכים עבור כל ערוץ. להדביק את הערכים עבור ערוצים נפרדים גיליון אלקטרוני.
7. קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של Syt1-הערוץ ב ROIs בתנאים שתי תרביות תאים (GFP-Rogdi ו- mGFP).
8. החל המתאים בדיקות סטטיסטיות כגון של התלמיד במבחן t כדי לקבוע הבדלים משמעותיים.

תוצאה צפויה של גישה זו היא איתור כ 50 transfected כפול נוירונים לכל coverslip ב צפיפות של נוירונים 50,000 לכל טוב. הפעולה באקסון של הנוירון כל צפוי להראות נקודות חמות מרובות של מתויג fluorescently הצטברות Synaptophysin, ומציין אשכולות ofSVs. באתרים presynaptic תפקודית, האות Synaptophysin רקומביננטי colocalizes עם זריחה Syt1 punctate. GFP-Rogdi כמו החלבון עניין (איור 1) או mGFP של הפקד באמצעות תרביות תאים זוגיים, היא ביטוי במשותף עם רקומביננטי Synaptophysin.

בניסוי זה, אנחנו מנתחים SV מיחזור באתרים presynaptic בנוירונים לבטא GFP-Rogdi או mGFP. אם החלבון שליטה, mGFP, homogeneously והכהים את כל התא, אך השפעתה באתרים סינפטית עדיין צריכה להילמד, ואז יש צורך בשיתוף transfect חלבון השני הוא מועשר presynaptically, fluorescently מתויג Synaptophysin.

כפי שהוסבר קודם, התאים עוברים דפולריזציה-induced משדר השחרור. כתוצאה מכך, הסינפסות פונקציונלי תופסים נוגדנים Syt1 הוסיף למדיום. לאחר נוגדן immunolabeling Syt1 עם נוגדנים משניים fluorescently שכותרתו, מידת ספיגת Syt1 הוא סוף סוף לכמת באמצעות את immunosignal (איור 2).

איור 1. תא כפול-transfected. שדה הראייה מראה תא transfected כפול לבטא GFP-Rogdi (א) ו- Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin הוא חלבון שלפוחית סינפטית בשפע. Variant רקומביננטי שלה יכול לשמש עבור תיוג עם העיתון ons סינפטית. הדפוס לוקליזציה של GFP-Rogdi דומה לזה של Synaptophysin-mCherry (C). גודל ברים = 10 μm. בתיבות הצג 2.5 X הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. GFP-Rogdi-פונקציונלי הסינפסות. ספיגת Syt1 בשידור חי בוצעה בתאים transfected כפול לבטא mGFP (ירוק) או Synaptophysin-מורנג (אדום; A-D) או GFP-Rogdi (ירוק), Synaptophysin-מורנג (אדום; E-H). ספיגת נוגדן Syt1 בוצעה באמצעות נוגדן חד שבטי העכבר נגד תחום luminal של Syt1. לאחר קיבוע מחברים, התאים היו מוכתמים נוגדן anti-GFP ארנב. נוגדנים משניים (אנטי-ארנב 488 אלקסה ועכבר נגד אלקסה 647) נוספו לאתר GFP או GFP-Rogdi ו- Syt1, בהתאמה. Autofluorescence של Synaptophysin-מורנג שימש כדי לזהות מסופי presynaptic (B ו F). Punctate Syt1 immunofluorescence מצביע על אתרים של שלפוחית מיחזור (כחול; C ו- G). שימו לב כי הרוב המכריע של התווית על-ידי Syt1 הסינפסות המותאמות לשפה שאינה transfected נוירונים. GFP-Rogdi היה ממוקד הסינפסות פעיל, לא שינתה את שלפוחית סינפטית מיחזור (I). 3 תרבות עצמאית הניסויים בוצעו (N = 3). לפחות 3 coverslips מתרבות כל אחד (סה כ 10) שימשו לצורך ניתוח. לבסוף, נותחו 3 אזורי לכל coverslip (n = 30). Student´s -t-test הראו הבדל משמעותי. גודל ברים = 10 μm. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (S.E.M.). "נ. ס" מציין אין משמעות. דמות זו שונתה מ רימן. et al. ⁹ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ישנם שלושה מבחני בשימוש שגרתי ללמוד שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור. השניים הראשונים כוללים את השימוש) styryl פלורסנט צבענים כמו FM1-43 (אשר לשלב ממברנות נלקחים לתוך organelles במהלך אנדוציטוזה, משתחררים לאחר אקסוציטוזה); ו- b) fluorescently מתויג חומרים SV (אשר, על ביטוי, לשלב מכונות מיחזור proteinaceous). אם fluorophores מצורף לשנות שלהם פלורסצנטיות בהתאם רמת החומציות, הם יכולים לשמש כדי לעקוב אחר השינויים בין הפנים חומצי של SV ה-pH של המדיום חוץ-תאית. החלבונים רקומביננטי מתויג בווריאציה רגיש pH של GFP נקראים Phluorins. מבחני שני דנו שניהם היה מובלט בעבר^19,20, ואת היתרונות והחסרונות של כל אחד היו גם שנסקרה²¹.

כאן, אנו מתארים שלישית, שיטת ומבוססת^4,5,6,7,9,14. כדי לבדוק SV מיחזור, עלינו לנצל את העובדה כי תחום luminal של חלבונים הקשורים שלפוחית Synaptotagmin-1 (Syt1) הופך להיות חשופים על פני התא על אקסוציטוזה. ראשית, אנו מוסיפים נוגדן נגד קבוצת המחשבים luminal למדיום תרבות, אשר הוא ואז נלקח על ידי שלפוחית במהלך SV מיחזור. ספיגת נוגדן זה דמיינו, לכמת על-ידי immunofluorescence. לחלופין, ניתן להשתמש ישירות עם תוויות Syt1-נוגדן. התווית ניתן pH-עצמאית, דיווח לוקליזציה של Syt1-נוגדן והן על המשטח החיצוני של SVs, או תלויי-pH, דיווח לוקליזציה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית שינויים. אנו מתארים גם את השילוב של זה SV assay מיחזור עם תרביות תאים כפול של נוירונים בתרבית כדי לבדוק אם לאו חלבון של ריבית, ה-GFP-Rogdi, מטרות פונקציונלי synapses ומשפיע SV מיחזור. GFP-Rogdi הוא ספציפי לגישה זו; עם זאת, ניתן לטפל על אותן השאלות כל החלבונים עניין.

Assay זה הוצג לראשונה בשנת 1992 לפיקוח ספונטני מיחזור של SVs⁴ , פותחה עוד יותר על ידי הקבוצה כדי לפקח SV עורר מיחזור¹². הניסויים שלהם הקים את ספיגת Syt1 רגישה clostridial רעלנים עצביים, אשר חוסמות SV אקסוציטוזה¹². הם גם הראו כי גירוי של תרבויות מאת דפולריזציה ב 37 ° C מגביר את ההפנמה של נוגדנים Syt1 לעומת 1) תרבויות שנשמרים על קרח, אשר מונע רוב אנדוציטוזה, וכדי 2) תרבויות מודגרות ב 37 ° C ללא גירוי, אשר מאפשרת למיחזור ספונטנית, אך לא לעורר^12,מחזור²². וזמינותו, באפשרותך להשוות בקלות SV מיחזור בין שני מצבים, כמו למשל עם ובלי מולקולה של עניין. בפרט, פרוטוקול זה מתמקד השוואת Syt1 ספיגת נוגדן בנוכחות לעומת העדר overexpressed חלבון מסוים. ניתן להרחיב את הפרוטוקול אם התרומה של השטח מחייב, ספונטני מיחזור, מיחזור עורר צריך לפנות לבדיקה. לדוגמה, המקננת נוירונים על הקרח ללא גירוי מונע אנדוציטוזה, חשיפת כל איגוד משטח של הנוגדן Syt1. המקננת הנוירונים ב 37 מעלות צלזיוס בפתרון הבזליים עם טטרודוטוקסין מונעת הפצת פוטנציאל הפעולה, חשיפת כל מיחזור ספונטנית. לפיכך, ומוכנסות נוירונים ב 37 ° C תחת מגרה תנאים יכול לחשוף את היקף מיחזור SV עורר.

תאים חיים רגישים תנאים אידיאליים פיזיולוגיים; לכן, תחזוקה, תרביות תאים, מאגרי דפולריזציה צריך תמיד להיבדק עבור פרמטרים פיזיולוגיים כולל pH וטמפרטורה. בעוד דפולריזציה מאגרי ניתן להעביר דרך מסננים סטרילית לאחר ה-pH הותאם, מאגרי תרביות תאים רגישים סינון סטרילי. לכן, אנו להתאים את החומציות, לשמור אותו קפוא עד לשימוש, ולסובב את זה ומפרידה שולחני כדי הצניפה כל חיידק. עבור תרביות תאים, זה חיוני כדי לערבב את החומר הממתן במידה מספקת כדי להבטיח שיוך של פלסמיד הקריסטלים סידן פוספט. סידן פוספט תקנים עובד הכי טוב על יום במבחנה (DIV) 2-4. אנו משתמשים מתויג Synaptophysin, טראנסממברנלי SV, כסמן לזיהוי המסופים presynaptic transfected הנוירונים. ניתן להשתמש גם מתויג גרסאות לחלבונים SV אחרים כגון SV2, Synapsin, ערפדים/Synaptobrevin או אזור פעיל מולקולות כגון בסון, RIM, Munc13-1, יצוקה.

הן mCherry והן מורנג פולטים פלואורסצנטי אדום. למרות mCherry הוא בהיר יותר מורנג, יש פליטה גדול באורכי גל ארוכים יותר מורנג. לכן, עבור הדמיה פלורסצנטיות טריפל עם GFP, צבע אדום, צבע פולט בטווח 700 nm, מורנג הוא אפשרות טובה יותר mCherry. עבור זריחה כפול עם GFP, צבע אדום, mCherry עשויה להיות חיובית משום זה צבע בהיר יותר. כדי להבטיח תרביות תאים דליל, המיקס תרביות תאים צריך לא להיות מודגרות יותר מ 60 דקות. חשוב גם כי דגירה במאגר depolarizing הוא משך הזמן כדי להבטיח אקסוציטוזה של שלפוחית כל נכון. עם זאת, עליך להימנע חשיפה ממושכת למאגר depolarizing. במהלך ייבוא תמונות, זה גם חיוני כדי להחיל את אותו פעמים חשיפה עוצמות אור כדי להבטיח לכימות השוואה בין קבוצות שונות של ניסויים.

לבסוף, במהלך ניתוח תמונות, פרוטוקול שלנו כולל מספר שיקולים. עבור אזור אחד של עניין מציג puncta Synaptophysin רקומביננטי, סף נמוך עוצמה מוגדר כך פלורסצנטיות ' מאטום לשקוף ' אינו נכלל. בשלב הבא, לגודל הסף הזה נבדק על coverslips להתבונן דומה של אותות punctate והדרה של זריחה ' מאטום לשקוף ', אזורים אחרים. מרגע הסף המתאים מזוהה, היא חלה על כל התמונות, בהפקת אזורים punctate עניין (ROIs) בערוץ Synaptophysin (עם התגית mCherry או מורנג) רקומביננטי. לבסוף, Syt1 העוצמה נקבעת עבור ROIs⁹.

הגישה שלנו ממוטב תרביות תאים דליל. אנחנו מנתחים את הפונקציה presynaptic בסביבה מורכבת איפה שיש SV מיחזור של האקסונים של נוירונים transfected מוקף הנוירונים untransfected. תצורה זו, כפול-תקנים מאפשרת לנו לתפעל תפקוד ולאתר המסופים presynaptic של הנוירונים transfected. הנוירונים presynaptic transfected לפנות נוירונים postsynaptic untransfected הוא גורם חשוב בהערכת ההשפעות של נוירון presynaptic על מיחזור SV. ההגדרה גם ניתן להתאים בקלות לבדוק אם לאו מניפולציה postsynaptic גורם לשינויים presynaptic. במקרה זה, תרביות תאים דליל של נוירונים עם חלבון המיועד לאתרים postsynaptic בתרגום האתרים postsynaptic של הנוירונים transfected, ספיגת Syt1 יכול להיקבע-סינפטיים עם העיתון ons של נוירונים untransfected.

כאשר תרביות תאים דליל אינו הכרחי, ניתן להחיל תקנים שונים פרוטוקולים. לדוגמה, תרביות תאים עם Lipofectamine על DIV 7 - 8 תוצאות שיעור גבוה יותר של תרביות תאים, אבל זה כרוך גם ביטוי חזק יותר בכל תא transfected⁹. יתר על כן, התמרה חושית ויראלית יכולה לגרום ביטוי כמעט 100% של נוירונים בתרבית^14,23,24. בניסויים שמטרתם ניטור SV מיחזור, תרביות תאים שניתן לבצע על חלבון יחיד או השמטת לחלוטין. לדוגמה, כאשר בסך הכל סינפטית מיחזור בהשוואה בין נוירונים מ wildtype מהונדסים גנטית עכברים, תיוג נוירונים בודדים על-ידי תרביות תאים אין צורך. בנוסף, דבר זה מאפשר immunolabeling של חלבונים אנדוגני. אם נכשל תרביות תאים, חשוב לבדוק את המאגר תרביות תאים עם פלסמיד מאומתים או להשתמש מאגר עם pH שונים (ראה הכנת תקנים מאגר). באמצעות תכשירים DNA חופשי אנדוטוקסין מופיע גם להיות מכריע. Immunostaining הפנימו Syt1 עבודות נוגדנים בדגימות מחברים-קבוע והן מתנול-קבוע. יש גם לציין כי autofluorescence GFP ו- RFP הוא אבוד לאחר קיבוע מתנול. אם ה-GFP או RFP צריך להיות מותאם קבוע מתנול תאים, חלבונים אלה חייבים להיות immunolabeled. אם Syt1 ספיגת נכשל, דפולריזציה זמן וריכוז K⁺ במאגר דפולריזציה צריכה להשתנות בהתאם פרוטוקול וריאציות רבות פורסמו, עם דפולריזציה פעמים החל s 90²⁵ עד 60 דקות¹², ועם K⁺ ריכוזים של 45 מ מ, 50 מ מ, 70 מ"מ ו 110 מ מ^{6,25,26 ,27}. כאשר עליך ניתן למנוע את פעילות חוזרים ונשנים, ניתן להוסיף חוסמי הקולטן גלוטמט גם במהלך דפולריזציה. לבסוף, בעוד דפולריזציה K⁺ גבוהה נחשבת הגירוי החזק ביותר, פוטנציאל פעולה יכול לגרום SV מיחזור-לגירויים פיזיולוגיים עוד^22,28. הבדלי יעילות ספיגת נוגדן Syt1 עשויה להתרחש בתרבויות עכבר ועכבר. בשיטה שלנו, שיבוט העכבר monoclonal anti-Syt1 604.2 (RRID:AB_993036) מייצרת מכתים חזקה יותר בתרבויות עכברוש מאשר בתרבויות העכבר, בעוד נוגדן anti-Syt1 ארנב polyclonal (RRID:AB_11042457) מייצרת מכתים חזקה יותר בתרבויות העכבר, אבל מספר הערות אזהרה נדונים להלן.

יש לקחת בחשבון מספר אזהרות לגבי השימוש של נוגדנים אנטי-Synaptotagmin עבור ספיגת לתוך SVs. ראשית, N-גליקוזילציה של אספרגין 24 של Syt1 מקדמת את ספיגת החלבון^29,30endocytotic. אספרגין 24 הוא חלק תחום luminal של Syt1. הנוגדנים עכבר, ארנב, בהם אנו משתמשים מופנים כנגד חומצות אמינו 1-12 ו- 1-8, בהתאמה, של Syt1. בעוד epitopes שלהם אינם חופפים עם האתר N-גליקוזילציה, הפרעה סטרית או, לעומת זאת, אינדוקציה של ספיגת על-ידי איגוד נוגדן לא ייכללו. מוטציה של אתר N-גליקוזילציה ב Syt1 לא משנה את קינטיקה של אנדוציטוזה והיעדים של Syt1 ל SVs. היא מגבירה את השבר של Syt1 שנותרו על המשטח החיצוני של קרום פלזמה כאשר אנדוציטוזה הנגרמת על ידי גירוי חלשים. כאשר לגירויים חזקים, כגון דפולריזציה K⁺ גבוהה, מוחלים, אין צמצום ספיגת Syt1 הוא ציין³⁰. בסך הכל, אם הנוגדנים התערב עם אתר N-גליקוזילציה בדרך כלשהי הם עשויים לגרום לשינוי במצב אנדוציטוזה SV לעומת התנאים ללא נוגדנים, אך שינוי זה צריך להיות דומה לניסוי (במקרה שלנו ביטוי של GFP-Rogdi), הפקד (במקרה שלנו הביטוי של GFP). בנוסף, נוגדנים polyclonal עשוי להיות סביר יותר לזירוז crosslinking מאשר נוגדנים חד-שבטיים, ובעיות הסטריים כי מספר גדול יותר של עותק של נוגדנים נקשר epitope. אנו מודעים לא מחקרים שיטתיים השוואת נוגדנים זמינים אחד עם השני; עם זאת, מספר מחקרים עסקו את תוקפו של נוגדנים מסוימים. לדוגמה, כאשר SV קינטיקה מיחזור היו ובחן באמצעות שיבוט נוגדן anti-Syt1 העכבר monoclonal 604.2 Synaptophluorin-זריחה שינויים השוואה ישירה, תוצאות דומות התקבלו, אימות השימוש הזה נוגדן²⁸. טעינת SVs עם הארנב polyclonal נוגדנים Syt1 והקלטת הסינאפסית electrophysiologically גילה כי הסינפסות טעון הפחתי הסינאפסית בצורה המזכירה של אובדן-של-פונקציה מוטציות של Syt1. לכן, אותם נוגדנים polyclonal להשפיע על העברה סינפטית. תפיסה בפועל חשף ספונטני והן עורר מיחזור, טוען כי נוגדן polyclonal מתאימה לפקח על סיבוב אחד של SV מיחזור, אבל זהירות יש לנקוט בעת פירוש תוצאות לאחר ספיגת של נוגדנים אלה³¹.

שלושה מבחני נמצאים בשימוש שגרתי ללמוד SV למחזור, הכוללים ממברנה labelling עם styryl צבענים, ביטוי של Phluorins, וביצע ספיגת Syt1-נוגדן כאן. כל שלושת מבחני יכול לשמש כדי לקבוע את הרגליים endocytotic ו- exocytotic של SV מיחזור. בעוד כל מבחני שלושה יתרונות רב עוצמה, לכל אחד יש גם אזהרה עקרון. צבעי FM תווית על פני התא כולו, נלקחים לתוך התא עם כל ממברנות מיחזור. Phluorins חייבת להיות מוצגת על ידי ביטוי. Syt1-נוגדנים תווית החלבון אנדוגני, אך נוגדנים מסוימים עשויים להשפיע על תפקודו תחת תנאים מסוימים. כל הקונה, עם זאת, ניתן בהתאם כשהיא ממוענת²¹.

בסך הכל, וזמינותו ספיגת נוגדן Syt1 שימש למטרות שונות. ראשית, היא שימשה לתייג באופן סלקטיבי SVs שעברו ספונטני או עורר מיחזור, בהתאמה^28,31,32,33. שנית, היא שימשה כדי לקבוע את ההשפעה של התרופה או חלבון על היקף SV מיחזור; לדוגמה, כדי להראות כי BDNF משפר SV ספונטני והן עורר מיחזור⁶. שלישית, השתמשו בו כדי לקבוע את המספר של הסינפסות עם מיחזור SVs כאחוז של המספר הכולל של הסינפסות מורפולוגית מוגדר^34,35. זה התגלה כי overexpressing המולקולה תא postsynaptic-אדהזיה Neuroligin-1 מגביר את האחוז של הסינפסות עם מיחזור SVs²⁵ , כי הפחתת ביטוי של רצפטורים גלוטמט אמפא-סוג מקטין את אחוז הסינפסות עם מיחזור SVs, להעלות את האחוז של הסינפסות שקט presynaptically³⁶. בנוסף, וזמינותו שימש כדי לנתח את הניידות של SVs שכותרתה²⁷ וכדי לקבוע הלוקליזציה של Syt1 באמצעות nanoscopy^13,22,33. לבסוף, עדיין להשתמש בשיטה זו כדי לבדוק אם לאו חלבונים מסוימים בתרגום כדי הסינפסות פונקציונלי⁹. הנוגדן Syt1 יכול לשמש גם עבור מחקרים ארוכי טווח, איפה הנוגדן נשאר הנוירונים ימים בעקבות ספיגת³⁷. זה יכול להיות משולב עם סיבוב שני של ספיגת באמצעות נוגדן Syt1 שכותרתו בנפרד או נוגדן נגד תחום luminal של חלבון SV שונה. דבר זה מאפשר בדיקה של אשר SVs ממוחזר בתחילה, אשר המיחזור בסוף הניסוי. זה יהיה מעניין להסתגל זה הנועד מערכות מודל שלם יותר, כגון פרוסות חריפה ותרבויות פרוסה organotypic. בעקרון, וזמינותו ספיגת מאפשרת השוואה של רקמה מתוך wildtype, גנטית שונה חיות או יכול להיות משולב עם משלוח ויראלי או biolistics, כלומר., "אקדח גנים", לתמרן החלבון ביטוי במערכות אלו מודל. במערכות כאלה, השפעת מסוימים לפליטת על מכונות presynaptic, בפיקוח על ספיגת assay, וכן רשת דינמיקה ניתן יהיה ללמוד בו זמנית.

המחברים אין לחשוף.

אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי DFG באמצעות האשכול המצוינות מיקרוסקופ במטווח ננומטר ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB, B1-7, סמטת).