Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

En las terminales nerviosas presinápticas activo vesículas sinápticas se someten a ciclos de exo y endocitosis. Durante el reciclaje, el luminales dominios de proteínas transmembranales SV verse expuestos en la superficie celular. Una de estas proteínas es Synaptotagmin-1 (Syt1). Un anticuerpo dirigido contra el dominio luminal de Syt1, una vez añadido al medio de cultivo, se toma durante el ciclo exo-endocytotic. Esta absorción es proporcional a la cantidad de SV reciclaje y puede cuantificarse a través de inmunofluorescencia. Aquí combinamos Syt1 absorción de anticuerpos con doble transfección de neuronas hippocampal cultivadas. Esto nos permite (1) localizar sitios presinápticos en la expresión de marcadores presinápticos recombinante Synaptophysin, (2) determinar su funcionalidad mediante absorción de Syt1 y (3) caracterizar la focalización y efectos de una proteína de interés, GFP-Rogdi.

Estudio de vesícula sináptica reciclaje es importante para determinar cómo cambian propiedades presinápticos, en plasticidad sináptica o en respuesta a la perturbación de la función sináptica. Estudio de Synaptotagmin-1 (Syt1) anticuerpos absorción proporciona un método para medir la cantidad de reciclaje de SV. Syt1 es una SV-proteína que actúa como un sensor de Ca^{2 +} y es necesario exocitóticas liberación del neurotransmisor^1,2. Es una proteína transmembrana con un dominio citoplásmico c-terminal fuera de la SV y un dominio luminal del N-terminal dentro del SV³. Durante la exocitosis, el dominio luminal de Syt1 queda expuesto al medio externo. A este medio externo, añadimos anticuerpos dirigidos contra el dominio citoplásmico, que se convierte en interiorizado durante la endocitosis. Estos anticuerpos pueden ser que ya sea previamente conjugado con fluoróforos o immunostained con anticuerpos secundarios^4,5,6,7. La intensidad de fluorescencia de la immunosignal resultante es proporcional a la cantidad de reciclaje de SV. Este enfoque puede utilizarse para determinar SV constitutiva e inducidas por despolarización reciclaje^6,8.

Ensayos de absorción de Syt1 pueden realizarse después de transferencia génica mediada por virus a prácticamente todas las células en el plato o escasa de la transfección de un pequeño número de células. Nuestro método combina el ensayo con escasa doble transfección de neuronas hippocampal primarias utilizando fosfato de calcio⁹. Utilizamos una proteína recombinante marcador sabida que se acumulan en presynapses, fluorescencia etiquetada Synaptophysin, localizar los terminales presinápticos y sobreexpresan la proteína de interés, Rogdi. Esto nos permite probar si o no Rogdi objetivos funcionales sinapsis y afecta a SV de reciclaje. La codificación Rogdi del gene fue identificado originalmente en una pantalla para mutantes de Drosophila caracterizados por alteración de la memoria¹⁰. En los seres humanos, mutaciones en el gene de Rogdi causan una enfermedad devastadora y rara llamada síndrome de Kohlschütter Tönz. Los pacientes sufren de malformaciones de esmalte dental, epilepsia farmacorresistente y retraso psicomotor; sin embargo, la localización subcelular del producto del gen seguía siendo evasiva¹¹. Así, el ensayo de absorción de Syt1 proporcionó evidencia clave para la localización de GFP con la etiqueta Rogdi en sinapsis funcional⁹.

Esta técnica de absorción tiene varios beneficios. En primer lugar, SV reciclaje puede observarse tanto en tiempo real realizando en proyección de imagen de^7,12y después de fijación^6,9 midiendo la intensidad de fluorescencia de la etiqueta de Syt1 fluorescencia. Además, se han desarrollado diversas variantes de anticuerpos Syt1. Hay variantes sin etiquetar que pueden ser etiquetadas con un anticuerpo secundario siguiendo un protocolo estándar immunostaining después de la fijación y variantes previamente conjugadas con una etiqueta de fluorescencia ya fijada. Finalmente, basados en anticuerpos de fluorescencia es ventajosa debido a la gran variedad de tintes secundarios o conjugados comercialmente disponibles que se pueden utilizar.

Cuando la fijación y el immunostaining las neuronas, también es posible teñir proteínas adicionales y realizar análisis de colocalización. Esto puede ayudar a determinar dónde se ubican en lo referente a reciclaje SVs. La intensidad de la etiqueta de la fluorescencia es la medida directa de la cantidad de SV de reciclaje. Además, los anticuerpos selectivamente etiqueta de Syt1 que contiene estructuras, dando por resultado alta especificidad y poca fluorescencia de fondo⁴. Diferentes protocolos de estimulación pueden usarse, como buffers de despolarización o estimulación eléctrica protocolos^9,12,13,14. Sin embargo, el reciclaje de SV básico puede medirse sin estimular los cultivos neuronales¹⁵.

Nuestro método dirige específicamente Syt1 absorción de anticuerpo en las neuronas transfectadas doble con inmunomarcación de anticuerpo secundario después de la fijación. Sin embargo, nos referimos a todas las variantes usadas rutinariamente el ensayo en nuestra discusión para dar a los espectadores una oportunidad para adaptar el protocolo a necesidades específicas.

No se llevaron a cabo ningún estudio con animales vivos. T10/30 el número de experimentos con animales sacrificaron para obtener culturas fueron aprobadas por las autoridades locales de protección animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) bajo la aprobación de la célula. Los experimentos se realizaron con los protocolos aprobados.

1. primario de la célula hipocampal cultura

1. Preparar el cultivo de células disociadas del hipocampo de rata en el día embrionario 19^16,17. Las células sobre cubreobjetos de 12 mm recubierto con polietilamina (PEI) en platos de 24 pozos a una densidad de 50.000-60.000 células/pocillo de la placa. Comprobar la densidad usando una celda óptica de contraste de fase y cámara de conteo.
2. Las neuronas de la cultura durante 3 días (día en vitro (DIV) 3) en un plato 24-well en la incubadora a 37 ° C con 5% CO₂.
3. Evaluar el cubreobjetos para indicadores de salud de la célula mediante microscopía de luz transmitida (por ejemplo, fase contraste la óptica en un aumento de 10-20 X). Busque los siguientes indicadores de buena salud: un halo de contraste de fase clara, neuritas sin estructuras de cuentas y no soma clustering o neurita liar.

2. transfección

Nota: El siguiente protocolo se refiere a una doble transfección para pozos de 3. Sin embargo, el protocolo funciona mejor cuando se preparan cantidades suficientes para pozos de 4.

1. Preparar 500 mL de tampón de transfección (274 mM NaCl, 10 mM de KCl, 1,4 Na₂HPO₄, glucosa de 15 mM, 42 mM HEPES) en un matraz Erlenmeyer.
   1. Disolver 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na₂HPO₄, 1,35 g de glucosa y 5,0 g de HEPES en 400 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer.
   2. Ajustar el pH a 6.95 con 1 NaOH M usando un medidor de pH.
   3. Ajuste el volumen con agua destilada a 500 mL y verificar el pH con un medidor de pH.
   4. Tomar alícuotas de 20-30 mL de tampón de la transfección con los siguientes valores de pH por pipeteo 1 M NaOH al buffer de transfección: 6,96 6.97 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      Nota: El pH del buffer de la transfección es crucial para la eficacia de transfección.
   5. Para probar que la transfección tampón conduce a la mayor cantidad de células transfected, prueba cada valor de pH de 6,96 a 7.11. Utilice el método de transfección descrito en 2.2 2.11 y un plásmido validado expresando GFP. Determinar el número de células transfected por cubreobjetos para cada valor de pH de buffer de transfección evaluar qué tampón funciona mejor.
   6. Alícuota del búfer con la más alta eficiencia de transfección en tubos de microcentrífuga de 2 mL congelar y almacenar los tubos a-20 ° C.
2. Caliente previamente el suero reducido medio, medio de cultivo celular y agua destilada a 37 ° C en el baño de agua.
3. Preparar la mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Trabajar bajo campana de flujo laminar para garantizar condiciones de trabajo estéril.
   1. Mezcla 7,5 μl de cloruro de calcio de 2 M con 4 μg de cada ADN libre de endotoxinas (Synaptophysin mOrange y mGFP/GFP-Rogdi). Añadir agua hasta alcanzar un volumen total de 60 mL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Añadir 60 mL de tampón de transfección a la mezcla. Para obtener los mejores resultados, añadir el tampón de transfección gota a gota agitando suavemente la mezcla de ADN en el vórtice.
   3. Incubar a temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Evitar la agitación del tubo de incubación durante el tiempo de incubación colocando el tubo al lado de la campana de flujo laminar.
4. Bajo la campana de flujo laminar, eliminar el medio de cultivo celular "(medio condicionado del) de los pozos utilizando una pipeta de 1000 mL y almacenar en un recipiente separado en la incubadora.
5. Añadir 500 mL de medio de reducido suero a cada pozo. Incube las células a 37 ° C y 5% de CO₂ hasta que termine el período de incubación de 20 minutos (paso 2.3.3).
6. Añadir 30 mL de mezcla de transfección a cada pocillo mediante pipeteo varias gotas. Deseche los residuos en la parte inferior del tubo.
7. Después de han sido suministrados todos los pozos con mezcla de transfección, agitar suavemente la placa de 24 pocillos para garantizar la distribución de la mezcla de la transfección en el medio.
8. Incubar los pocillos durante 60 minutos a 37 ° C y 5% CO₂.
9. Retire y deseche la mezcla de transfección y lavar tres veces con medio de cultivo celular. Añadir 1 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo e Incube por 30 segundos en RT. quitar 750 mL de medio y añadir la misma cantidad de medio fresco. Repita esta operación tres veces.
   Nota: El paso de lavado es fundamental. Mantener el tiempo que cada bien no tiene ningún medio como mínimo (es decir., quitar y reemplazar pozo por pozo) y añadir suavemente el medio de lavado.
10. Retire y deseche el medio de cultivo celular y añadir 450 mL de acondicionado medio bien-por-pozo.
11. Que las neuronas maduras en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ a 10 DIV.

3. estimulación y captación de Syt1

Nota: El siguiente protocolo aplica la absorción a 3 pozos. Por despolarización de cualquier otro número de pozos, ajuste las cantidades según corresponda.

1. Preparar 50 mL de tampón de despolarización 10 x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM de MgCl₂, 20 mM CaCl₂, glucosa de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4) en un matraz Erlenmeyer.
   Nota: El buffer de despolarización puede conservarse a 4 ° C durante varias semanas. Si una solución no despolarizantes también se utiliza, preparar un 10 solución de x Tyrode de 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂, 300 mM de glucosa, pH de 200 mM HEPES 7.4 con el fin de comparar la estimulación inducida por reciclaje con espontánea reciclaje. Después de la dilución a 1 x, agregue 1 μm del Tetrodotoxin antes de usar para bloquear la generación del potencial de acción.
   1. 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0.1 g de MgCl₂-6 H₂0, 0.15 g de CaCl₂-2 H₂O y 3,0 g de glucosa 1 H₂O y 2,38 g de HEPES en 50 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer se disuelven. Ajustar el pH con NaOH y filtro estéril la solución. Diluir el buffer 1:10 en agua destilada hasta alcanzar una concentración de 1 x.
2. Preparar 4% paraformaldehido (PFA) de 1 x PBS (pH 7.4) para la fijación después de la estimulación.
   1. Para 500 mL 4% PFA en PBS 1 x, disolver 20 g de paraformaldehído en 450 mL de agua destilada H₂O.
      Nota: La solución de la calefacción puede acelerar la disolución, pero no caliente la solución sobre 70 ° C, como las PDA pueden desintegrarse.
      PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, potencialmente carcinogénico y teratogénico. Use guantes cuando trabaje con PFA, trabajar bajo campana extractora y evitar la ingestión.
   2. Deje que la solución se enfríe a RT y añadir 50 mL de solución stock de 10 x PBS. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH/HCl con un medidor de pH.
3. Caliente previamente 600 mL de 1 x de buffer de despolarización y 10 mL de medio de cultivo celular a 37 ° C en el baño de agua.
4. Añadir 1 mL de anticuerpo de ratón anti-Syt1 (clon 604.2) a la 1 x buffer de despolarización y de vortex durante 10 segundos.
5. Retire y deseche el medio de cultivo celular de las células. Añadir 200 mL de la mezcla de despolarización-anticuerpo cada pozo e incubar durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO₂ en la incubadora.
6. Retire y deseche la mezcla de despolarización-anticuerpo y lavar tres veces con medio de cultivo celular. Añadir 1 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo e incube durante 30 segundos en RT. quitar 750 mL de medio y añadir la misma cantidad de medio fresco. Repetir tres veces.
7. Retire y deseche el medio de cultivo celular y agregar 300 mL de 4% PFA en PBS 1 x. Incubar 20 minutos a 4 ° C.
8. Lavado tres veces 5 minutos cada uno con PBS 1 x.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.

4. inmunocitoquímica

1. Preparar 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo.
   Nota: Bloqueo de búfer puede conservarse a-20 ° C durante varios meses.
   1. Disolver 2,5 g de sacarosa y 1 g de albúmina de suero bovino (BSA) en 5 mL de solución stock de 10 x PBS. Añadir 1,5 mL de solución detergente 10%. Agitar la solución hasta que todos los componentes se disuelvan bien y añadir agua destilada H₂O hasta un volumen final de 50 mL. Alícuota de la solución y la congelación de las alícuotas para el almacenamiento.
2. Diluir el anticuerpo secundario, fluoróforo acoplado (dirigido contra la especie de Syt1-anticuerpo primaria) en 200 mL de solución amortiguadora de bloqueo en cada pozo, a una dilución de 1: 1000.
3. Retire y deseche el PBS 1 x de cada uno bueno con un cubreobjetos.
4. Añadir 200 mL de mezcla de tampón-anticuerpo para cada pozo de bloqueo e incubar 60 minutos a TA.
   PRECAUCIÓN: Debido a los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, todos los pasos de avance deben realizarse en la oscuridad.
5. Después de la incubación, lavar las células 3 veces durante 5 minutos con 1 mL de PBS 1 x.
6. Incrustar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con el medio de inclusión.
   1. Añada una gota de 7 mL de incrustación medio sobre el portaobjetos. Quite el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantando con una jeringa y agarrar con pinzas.
      PRECAUCIÓN: Las células en la superficie del cubreobjetos se dañan fácilmente, para que fórceps deben manejarse con cuidado.
   2. El cubreobjetos de la inmersión en agua destilada para eliminar el PBS y secar cuidadosamente por tocar un borde a un tejido suave.
   3. Voltear el cubreobjetos sobre la gota media incrustación, por lo que la superficie que las células enfrenta el portaobjetos, incorporación de tal modo las células en el medio de inclusión.
7. Deja los portaobjetos se seca bajo el capó para 1-2 h (cubierta para evitar la exposición a la luz) y guardarlos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 ° C.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.

5. microscópico análisis

1. Después de secan el cubreobjetos, colocarlos bajo el microscopio con el objetivo y la cámara.
2. Ajuste el tiempo de exposición para cada canal de modo que algunos píxeles sobreexpuestas para una máxima distribución de valores de gris.
   Nota: Mientras que el tiempo de exposición puede variar entre los canales, debe ser constante para un canal asegurar la comparabilidad entre el cubreobjetos.
3. Adquisición de imágenes de varios canales para 10 regiones de interés (ROIs) por cubreobjetos. Compruebe que el ROI contiene procesos axonales de una neurona transfected comprobando que la fluorescencia de GFP, que debe ser punteada.

6. estadístico análisis

1. Exportar las imágenes como archivos de .tif. Cargar las imágenes en OpenView¹⁸ haciendo clic en archivo | Cargar archivo de imagen.
2. Elegir la imagen de Synaptophysin mOrange como canal 1, la imagen de Rogdi-GFP/mGFP como canal 2 y la imagen de fluorescencia Alexa647 como canal 3.
3. Umbral de los ROIs.
   1. Haga clic en análisis | Área de lugar sobre el orificio. Elija valores umbral e intensidad del Delta que en la inspección visual, se excluye la fluorescencia difusa, dejando sólo punteada las señales en la imagen del canal 1 (representación Synaptophysin mOrange fluorescencia). Mantener el umbral mismo de todas las imágenes.
4. Transferir estos ROIs en el correspondiente canal 2 (fluorescencia de GFP-Rogdi/mGFP) y 3 (Syt1-fluorescencia) de cada área del cubreobjetos haciendo clic en Ejecutar ahora.
   Nota: El ROI sólo debe considerar si la celda está transfected doble. En este método, mOrange y GFP fluorescencia debe ser claramente visible.
5. Guardar los datos en el editor de registro de análisis haciendo clic en los datos de registro.
6. Abra el editor de registro de análisis en la pestaña de Windows y copiar los valores para cada canal. Pegar los valores de los canales separados en una hoja de cálculo.
7. Determinar la intensidad de fluorescencia media del canal Syt1 en ROIs en ambas condiciones de transfección (GFP-Rogdi y mGFP).
8. Aplicar las pruebas estadísticas apropiadas como Student t-test para determinar diferencias significativas.

Un resultado previsto de este enfoque es localizar aproximadamente 50 doble-transfected las neuronas por cubreobjetos en densidades de 50.000 neuronas por pozo. El axón de cada neurona se espera para mostrar múltiples zonas interactivas de acumulación Synaptophysin fluorescencia etiquetada, indicando grupos ofSVs. En los sitios presinápticos funcionales, la señal de Synaptophysin recombinante colocalizes con fluorescencia Syt1 punteada. Doble transfección, GFP-Rogdi como la proteína de interés (figura 1) o mGFP como el control se expresa conjuntamente con recombinante Synaptophysin.

En este experimento, se analiza SV reciclaje en sitios presinápticos de las neuronas que expresan GFP-Rogdi o mGFP. Si la proteína de control, mGFP, se distribuye homogéneamente a lo largo de la célula entera, pero su influencia en los sitios sinápticos todavía necesita ser estudiado, entonces es necesario Co transfectar una segunda proteína que es enriquecida presynaptically, etiquetado fluorescente Synaptophysin.

Como se describió anteriormente, las células experimentan liberación de transmisor inducida por despolarización. Como resultado, sinapsis funcionales toman anticuerpos de Syt1 añadidos al medio. Después de inmunomarcación el Syt1 anticuerpo con un anticuerpo secundario marcado fluorescente, el grado de absorción de Syt1 finalmente se cuantifica utilizando el immunosignal (figura 2).

Figura 1. Células transfectadas doble. El campo visual muestra un celular doble-transfected expresando GFP-Rogdi (A) y sinaptofisina mCherry (B). Sinaptofisina es una proteína de abundantes vesículas sinápticas. Su variante recombinante puede utilizarse para etiquetar botones sinápticos. El patrón de localización de GFP-Rogdi parece al de Synaptophysin-mCherry (C). Barras de la escala = 10 μm. Cajas muestran 2,5 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. GFP-Rogdi en las sinapsis funcionales. Absorción de Syt1 vivo fue realizada en doble-transfected las células ya sea mGFP (verde) y sinaptofisina-mOrange (rojo; A-D) o GFP-Rogdi (verde) y sinaptofisina-mOrange (rojo; E-H). Absorción de anticuerpos Syt1 fue realizada usando un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra el dominio luminal de Syt1. Después de la fijación de la PFA, las células fueron teñidas con anticuerpos anti-GFP. Anticuerpos secundarios (anti-conejo Alexa 488 y anti-ratón Alexa 647) fueron agregados para detectar GFP o GFP-Rogdi y Syt1, respectivamente. Autofluorescencia de mOrange Synaptophysin fue utilizado para detectar los terminales presinápticos (B y F). Inmunofluorescencia de Syt1 punteada indica sitios de vesícula reciclaje (azul; C y G). Tenga en cuenta que la mayoría de etiquetado de Syt1 sinapsis se localiza neuronas no transfectadas. GFP-Rogdi fue atacado a las sinapsis activas y no cambiaron la vesícula sináptica de reciclaje (I). se realizaron 3 experimentos de cultura independiente (N = 3). Cubreobjetos por lo menos 3 de cada cultura (10 en total) se utilizaron para el análisis. Por último, se analizaron 3 áreas por cubreobjetos (n = 30). Student´s prueba de t no mostró diferencias significativas. Barras de la escala = 10 μm. Barras de error representan el error estándar de la media (SEM). "N.s." no indica que tiene importancia. Esta figura ha sido modificada desde Riemann et al. ⁹ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hay tres ensayos utilizados habitualmente para el estudio de vesícula sináptica (SV) reciclaje. Los dos primeros incluyen el uso de un) styryl fluorescente tintes como el FM1-43 (que incorporan en las membranas, se toman en orgánulos durante la endocitosis y se liberan después de exocitosis); y b) con la etiqueta fluorescente proteínas recombinantes de SV (que, a la sobreexpresión, incorporan a la maquinaria proteica de reciclaje). Si los fluoróforos acoplados cambian su fluorescencia dependiendo del pH, puede usarse para monitorizar los cambios entre el ácido de un SV y el pH del medio extracelular. Las proteínas recombinantes etiquetadas con una variante sensible a pH de GFP se llaman Phluorins. Los dos ensayos que discuten han sido destacados previamente^19,20, así como los pros y los contras de cada uno ha comentado²¹.

Aquí, describimos una tercera, método bien establecido^4,5,6,7,9,14. Para probar SV reciclaje, aprovechamos el hecho de que el dominio luminal de la proteína asociada a la vesícula Synaptotagmin-1 (Syt1) queda expuesto a la superficie de la célula por exocitosis. En primer lugar, agregamos un anticuerpo dirigido contra el dominio luminal al medio de cultivo, que entonces es tomado por la vesícula durante el reciclaje de SV. La absorción de este anticuerpo es visualizada y cuantificada por inmunofluorescencia. Como alternativa, puede usarse un Syt1-anticuerpo marcado directamente. La etiqueta puede ser independiente del pH, informes de localización de Syt1-anticuerpos dentro de y en la superficie externa de la Superintendencia, o dependiente del pH, informes de localización basada en los cambios de fluorescencia. También se describe la combinación de este ensayo de reciclaje de SV con doble transfección de neuronas cultivadas para probar o no una proteína funcional de objetivos de interés, GFP-Rogdi, sinapsis y afecta a SV de reciclaje. GFP-Rogdi es específica de este enfoque; sin embargo, las mismas cuestiones pueden abordarse de alguna proteína de interés.

Este ensayo fue introducido en 1992 para supervisar el reciclado espontáneo de SVs⁴ y fue desarrollado por el mismo grupo para vigilar SV evocado reciclaje¹². Sus experimentos establecieron que Syt1 absorción es sensible a neurotoxinas clostridiales, que bloquean SV exocitosis¹². También demostraron que la estimulación de las culturas por despolarización a 37 ° C aumenta la internalización de Syt1 anticuerpos frente a 1) las culturas que se mantienen en hielo, que evita que la mayoría de la endocitosis y 2) los cultivos se incubaron a 37 ° C sin el estímulo, que permite reciclaje espontáneo pero no evocar reciclaje^12,22. El análisis puede comparar fácilmente SV reciclaje entre dos condiciones, como por ejemplo con y sin una molécula de interés. En particular, este protocolo se centra en comparar la absorción de anticuerpos Syt1 en la presencia contra la ausencia de una cierta Proteína sobreexpresada. El protocolo puede ser ampliado si las contribuciones relativas de la superficie de Unión, espontánea de reciclaje y reciclaje evocados necesitan evaluarse. Por ejemplo, incubando las neuronas en el hielo sin estimulación previene la endocitosis, revelando cualquier atascamiento superficial del anticuerpo Syt1. Incubando las neuronas a 37 ° C en solución basal con tetrodotoxina previene la propagación del potencial de acción, revelando cualquier reciclaje espontáneo. Así, las neuronas incubación a 37 ° C bajo estimulantes condiciones puede revelaron la magnitud del reciclaje de SV evocados.

Células vivas son sensibles a las condiciones fisiológicas ideales; por lo tanto, mantenimiento, transfección y despolarización buffers deben siempre probarse para parámetros fisiológicos como pH y temperatura. Mientras que los almacenadores intermediarios de la despolarización se pueden pasar a través de filtros estériles después de ajustar el pH, buffers de transfección son sensibles a filtración estéril. Por lo tanto, ajustar su pH, guardamos congelados hasta su uso y girar en una centrífuga de mesa para que sedimenten las bacterias. Para transfección, es vital para mezclar el búfer adecuadamente para asegurar la Asociación del plásmido con los cristales de fosfato de calcio. Transfección del fosfato de calcio funciona mejor de día en vitro (DIV) 2-4. Utilizamos etiquetas Synaptophysin, una proteína transmembrana de SV, como marcador para la identificación de las terminales presinápticas de las neuronas transfected. Etiquetado con versiones de otras proteínas SV como SV2, Synapsin, VAMP/Synaptobrevin o zona activa moléculas como fagot, borde, Munc13-1 y CAST también pueden ser utilizadas.

MCherry y mOrange emiten fluorescencia roja. Aunque mCherry es más brillante que el mOrange, tiene una mayor emisión en longitudes de onda larga de mOrange. Por lo tanto, para imágenes de fluorescencia triple con GFP, un tinte rojo y un tinte emitir entre 700 nm, mOrange es una mejor opción que mCherry. Doble fluorescencia con GFP y un colorante rojo, mCherry puede ser favorable ya que es el tinte más brillante. Para garantizar el escaso de la transfección, la mezcla de transfección no debe ser incubada durante más de 60 minutos. También es importante que la incubación en un búfer de despolarización es la longitud adecuada de tiempo para la exocitosis de vesículas todos. Sin embargo, debe evitarse la exposición prolongada al buffer de despolarización. Durante la adquisición de la imagen, también es fundamental aplicar los mismo tiempos de exposición e intensidades de luz para asegurar la comparación cuantificable entre diferentes conjuntos de experimentos.

Finalmente, durante el análisis de la imagen, nuestro protocolo incluye varias consideraciones. Para un área de interés mostrando recombinante Synaptophysin puncta, se establece el umbral de baja intensidad para que fluorescencia difusa se excluye. A continuación, este umbral se prueba en otras áreas y cubreobjetos para observar similar inserción de las señales y la exclusión de fluorescencia difusa. Una vez que se identifica un umbral adecuado, se aplica a todas las imágenes, producción de las regiones de interés (ROIs) en el canal de Synaptophysin (etiquetado mCherry o mOrange) recombinante. Por último, Syt1 intensidad se determina para los ROIs⁹.

Nuestro enfoque está optimizado para transfección escasa. Analizamos la función presináptica en un entorno complejo donde hay SV reciclaje en axones de las neuronas transfected rodeadas de neuronas untransfected. En este montaje, doble transfección nos permite manipular la función neuronal y localizar los terminales presinápticos de las neuronas transfected. Transfected las neuronas presinápticas que en contacto con las neuronas postsinápticas untransfected es un factor importante en la evaluación de efectos de la neurona presináptica en el reciclaje de SV. El ajuste también puede ser fácilmente adaptado para probar o no una manipulación postsináptica provoca cambios presinápticos. En este caso, transfección escasa de neuronas con una proteína que está dirigido a sitios postsinápticos a localizar los sitios postsinápticos de las neuronas transfected, y absorción de Syt1 puede determinarse en botones sinápticos de las neuronas untransfected.

Cuando transfección escasa no es necesaria, se pueden aplicar protocolos de la transfección diferentes. Por ejemplo, transfección con Lipofectamine DIV 7 - 8 resultados en tasas más altas de la transfección, pero también implica la expresión más fuerte en cada células transfected⁹. Además, la transducción viral puede resultar en expresión en casi el 100% de las neuronas cultivadas^14,23,24. En experimentos dirigidos a monitorizar SV reciclaje, transfección puede realiza para una sola proteína o completamente a la izquierda hacia fuera. Por ejemplo, cuando reciclaje general sináptica es comparada entre las neuronas de tipo salvaje y genéticamente ratones, etiquetado neuronas individuales por transfección no es necesarios. Además, esto permite inmunomarcación de proteínas endógenas. Si falla la transfección, es importante comprobar el búfer de transfección con un plásmido validado o utilizar un buffer con un pH diferente (véase preparación de buffer de transfección). Usando preparaciones de ADN libres de endotoxinas también parece ser crucial. Immunostaining había internalizado Syt1 obras de anticuerpos en muestras tanto PFA-fijo y fijo de metanol. También debe señalarse que la autofluorescencia GFP y RFP se pierde después de la fijación de metanol. Si GFP o RFP necesita ser localizada en las células fijadas en metanol, estas proteínas deben ser immunolabeled. Si la absorción Syt1 falla, tiempo de despolarización y la concentración de K⁺ en el buffer de despolarización deben cambiarse en consecuencia. Muchas variaciones del protocolo han sido publicadas, con despolarización veces desde 90 s²⁵ hasta 60 min¹²y con las concentraciones de K⁺ de 45 mM, 50 mM, 70 mM y 110 mM^{6,25,26 ,27}. Cuando debe evitarse actividad recurrente, bloqueadores del receptor de glutamato pueden añadirse durante la despolarización. Finalmente, mientras que alta despolarización K⁺ se cree que es el estímulo más fuerte, los potenciales de acción puede inducir SV reciclaje a más estímulos fisiológicos^22,28. Diferencias en la eficacia de absorción de anticuerpo Syt1 pueden ocurrir en las culturas de la rata y el ratón. En nuestro método, el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Syt1 clon 604.2 (RRID:AB_993036) produce la coloración más fuerte en las culturas de la rata que en culturas de ratón, mientras el anticuerpo policlonal de conejo anti-Syt1 (RRID:AB_11042457) produce la coloración más fuerte en las culturas de ratón, pero varias notas de precaución se discuten a continuación.

Deben considerarse varias advertencias sobre el uso de anticuerpos anti-Synaptotagmin para absorción en SVs. En primer lugar, N-glicosilación de asparragina 24 de Syt1 promueve la absorción de endocytotic de la proteína^29,30. Asparragina 24 forma parte del dominio luminal de Syt1. Los anticuerpos de ratón y conejo que se dirigen contra los aminoácidos 1-12 y 1-8, respectivamente, de Syt1. Mientras que sus epitopos no se superponen con el sitio de N-glicosilación, impedimento estérico o, por el contrario, la inducción de la absorción por Unión de anticuerpos no puede ser excluida. Mutación del sitio de N-glicosilación en Syt1 no afecta la cinética de la endocitosis y la focalización de Syt1 a SVs. Aumenta la fracción de Syt1 restante en la superficie de la membrana plasmática externa cuando la endocitosis es inducida por estímulos débiles. Cuando se aplican estímulos fuertes, tales como alta despolarización K⁺ , reducción en la absorción de Syt1 no observa³⁰. En general, si los anticuerpos interfieren con el sitio de N-glicosilación de alguna manera pueden causar un cambio en la endocitosis SV en comparación con condiciones libres de anticuerpos, pero este cambio debe ser similar para el experimento (en nuestro caso la sobreexpresión de GFP-Rogdi) y el control (en nuestro caso la expresión de GFP). Además, anticuerpos policlonales pueden ser más propensos a inducir problemas estérico y reticulación de anticuerpos monoclonales, debido a un mayor número de copia de anticuerpos se une al epitopo. No somos conscientes de la sistemáticos estudios que comparaban los anticuerpos disponibles uno con el otro; sin embargo, algunos estudios han abordado la validez de ciertos anticuerpos. Por ejemplo, cuando cinética reciclaje SV fueron probadas usando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Syt1 anticuerpo clon 604.2 y cambios de Synaptophluorin-fluorescencia en una comparación directa, se obtuvieron resultados similares, validando el uso de este anticuerpo²⁸. Carga SVs con conejo policlonales Syt1 anticuerpos y grabación transmisión sináptica electrophysiologically revelaron que las sinapsis cargadas habían reducido la transmisión sináptica en forma de pérdida de función mutantes de Syt1. Por lo tanto, estos anticuerpos policlonales afectan la transmisión sináptica. La captación real reveló tanto espontánea como evocada de reciclaje, lo que sugiere que un anticuerpo policlonal es conveniente vigilar una ronda de SV de reciclaje, pero debe tenerse cuidado al interpretar resultados después de la absorción de estos anticuerpos³¹.

Tres ensayos se utilizan habitualmente para estudiar reciclaje de SV, que incluyen membrana etiquetado con styryl tintes, sobreexpresión de Phluorins, y la absorción de anticuerpos Syt1 realizada aquí. Todos los tres ensayos se pueden utilizar para determinar las piernas endocytotic y exocitóticas de SV de reciclaje. Mientras que todos los tres ensayos poderosos beneficios, cada uno tiene una advertencia del principio. Tintes de FM la superficie de la célula toda la etiqueta y se toman en la célula con todas las membranas de reciclaje. Phluorins debe introducirse por la sobreexpresión. Etiqueta de Syt1-anticuerpos contra la proteína endógena, pero algunos anticuerpos pueden afectar su función bajo determinadas condiciones. Sin embargo, cada advertencia puede apropiadamente abordado²¹.

En general, el ensayo de absorción de anticuerpo de Syt1 ha servido a varios propósitos. En primer lugar, fue utilizado para etiquetar selectivamente SVs en espontánea o evocada reciclaje, respectivamente^28,31,32,33. En segundo lugar, se utilizó para determinar el efecto de un fármaco o proteína sobre el grado de SV de reciclaje; por ejemplo, para mostrar que BDNF aumenta la SV tanto espontánea como evocada reciclaje⁶. En tercer lugar, se utilizó para determinar el número de sinapsis con reciclaje SVs como porcentaje del número total de sinapsis morfológicamente definidos^34,35. Esto reveló que overexpressing la molécula de adherencia de célula postsináptica Neuroligin-1 aumenta el porcentaje de sinapsis con SVs²⁵ de reciclaje y que reduce la expresión de receptores de glutamato tipo AMPA disminuye el porcentaje de sinapsis con SVs, aumentando el porcentaje de sinapsis silenciosas presynaptically³⁶de reciclaje. Además, el análisis fue utilizado para analizar la movilidad de la SVs con²⁷ y para determinar la localización de Syt1 usando nanoscopía^13,22,33. Por último, este método todavía se utiliza para probar si o no ciertas proteínas localización a sinapsis funcional⁹. El anticuerpo de Syt1 puede también usarse para estudios a largo plazo, donde el anticuerpo permanece en las neuronas para días siguientes captación³⁷. Esto puede combinarse con una segunda ronda de captación usando un anticuerpo de Syt1 por separado marcado o un anticuerpo dirigido contra el dominio luminal de una proteína diferente de la SV. Esto permite la prueba de que SVs reciclado inicialmente y que reciclar al final de un experimento. Sería interesante adaptar este ensayo a más sistemas modelo intactas, tales como agudas rodajas y organotypic rebanada culturas. En principio, el ensayo de absorción permite la comparación de tejido de tipo salvaje y genéticamente modificados animales o puede combinarse con entrega viral o biolística, es decir., una "pistola de genes", para manipular la expresión de la proteína en estos sistemas modelo. En estos sistemas, se puede estudiar simultáneamente la influencia de ciertas perturbaciones en la maquinaria presináptica, supervisada por el ensayo de absorción y dinámicas de red.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a Irmgard Weiss experta asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por DFG el Cluster de excelencia para la microscopia en la gama del nanómetro y fisiología molecular del cerebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).