Method Article
This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.
Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.
Glycolipids, גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו glycosaminoglycans מהווים ארבעת הסוגים העיקריים של פחמימות מורכבות, הטרוגניות הידוע קולקטיבי גליקנים. כמו רכיבים בכל מקום ובלתי נפרדים של קרום הפלזמה, glycocalyx, ואת תאי מטריקס ונוזלים, גליקנים להתכבד תהליכי ביוכימיים מגוונים כגון אנדוציטוזה, סחר תאי, תנועתיות תא, אות תמרה, הכרה מולקולרית, הפעלת קולטן, הידבקות תא, אינטראקציה לפתוגן המארח , תקשורת, immunosurveillance אינטר, וייזום התגובה החיסונית. 1 הווה כמעט בכל תחום של החיים, אנזימים המכונה glycosyltransferases הבונות לפעול פולימרים glycan בד בבד עם hydrolases glycoside (הידוע גם בשם glycosidases, אשר לשבור גליקנים) לבנות, לשפץ, ובסופו של דבר לייצר סופית פולימרים glycan 2. למרות שכל glycosyltransferase יכול לפעול על glycoconjugates אחר, glycosyltransferaseבדרך כלל קרנות קשר glycosidic ספציפי אנומר linkage- ועל ידי העברת מחצית monosaccharide של תורם סוכר בפרט מופעל נוקלאוטיד (למשל, תוצר-פוקוז) לפי קטגוריה מסוימת של acceptors nucleophilic (למשל, חומצת שומנים, פוליפפטיד, גרעין, או גדלנו oligosaccharide). הערכה הוא כי יותר מ -50% של חלבונים (במיוחד הממברנה וחלבוני הפרשה) הם פוסט-translationally שונה על ידי glycosylation 3 חישובים קומבינטורית בסיסיים לספק הערכת ההשתנות הניכרת, הצדדית, וספציפיות מוענקות גליקופרוטאינים ידי glycosylation.; למשל, אם מצע פוליפפטיד יש רק 10 אתרים glycosylation וכל אתר יכול ליצור הצמדה glycosidic עם 1 מתוך 3 רק הקצוות צמצום monosaccharide שונה, אם כן, באופן תיאורטי, גליקופרוטאין הסופי ניתן להניח 3 10 = 59,049 זהויות נפרדות. בשנת גליקופרוטאינים, קשרים glycosidic יוצרים בדרך כלל עם o חנקן-שרשרת הצדשאריות f asparagine ברצף ASN-X-שירו / Thr (X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין) להניב N -glycans 2 ו-שרשרת הצד hydroxyls של שאריות סרין ו תראונין להניב O -glycans 4. הרכב של של glycome תא (כלומר, המשלים שלו של מוצרי glycosylation) הוא ייחודי ומוגבל כי, עם כמה יוצא מן הכלל, glycosyltransferases להפגין תורם קפדן, acceptor, וספציפיות הצמדה. 5 גליקופרוטאינים פלזמה בדם חשובים ורב סובלים glycosylation סוטה כתוצאה במורד זרם ביטוי ופעילות glycosyltransferase החריגים בשל במצבים פתולוגיים רבים, במיוחד סרטן ומחלות דלקתיות. 6-24
בעיקר בשל גורמים אפיגנטיים, את glycome הוא משמעותי יותר מגוון, דינאמית, ומורכב מאשר proteome ו transcriptome. 25,26 בעוד כ 1% של הגנום היונק המקודד את ההיווצרות, השינוי,הרכבה של גליקנים, 27 תמורת glycosylation בתוך בניגוד בולט-באופן מונחה שאינה תבנית פוליפפטיד וביוסינטזה חומצות גרעין. משחק הגומלין בין כמות הפעילות היחסית של אנזימי glycosylation וגורם סביבתיים כגון זמינות תזונתיות מבשרות שקובע בסופו של דבר את האופי, שיעור, והיקף של glycosylation. 5,28 עובר (למשל, נחישות בידול), הפעלה סלולרית, והתקדמות דרך גן ביטוי השפעת תא המחזור (כלומר, שעתוק ותרגום) ולשנות את הזהות וכמות הזמין glycosyltransferases, שפעילותם היא הגורם המכריע נגד הזרם המיידי של פרופיל glycan של התא. בגלל (חלק) את השגשוג, דבק, ומאפיינים פולשנית של תאים סרטניים דומים לאלה של תאי embryogenic רגילים, שינויים ספציפיים במסלולי biosynthetic glycan (למשל, הצטברות מבשרת, ביטוי ושוחרר, aberranשינוי t, עיצור מבני, או היווצרות רומן) לשרת סמנים לסרטן אוניוורסלי המציינים בשלבים שונים של היווצרות גידולים, התקדמות, הגירה, ופלישה 29 למרות glycosylation הוא מורכב מאוד, כנראה רק כמה שינויים glycosylation יכולים לאפשר היווצרות סרטן וגרורות.; כנראה, מוצרי glycosylation "סוטים" מסוימים אכן נהנים תאים סרטניים בכך שהיא מאפשרת להם להתחמק הכרה חיסונית לשרוד את הדרישות של הגירה בסביבות intravascular ו גרורתי ועוין. 28,30,31 באופן לא מפתיע, ניסויים חשפו כי לשבש או למנוע דפוסי שינה ביטוי גנים והיווצרות glycan סוטה יכולים לעצור tumorigenesis. 29 עם זאת, גליקנים הסוטים זוהו מדגם biofluid (למשל, שתן, רוק, פלזמת דם או בסרום) לא יכולים להיות אינדיקטורים ישיר של הסרטן (או מחלה אחרת), אלא במורד זרם תוצאות של עדין אך משמעותישינויים במערכת החיסונית או השלכות לכימות של מצב הרסני באורגן צפוי. 32
למרות שהם מספקים מידע אוניוורסלי על glycome, טכניקות glycomics מבוסס אינטראקציה מולקולריות רבות (למשל, לקטינים / מערכי נוגדן ומטבוליות / תיוג קוולנטיים) תלוי זיהוי של מבני glycan כולו ואל תספקו מידע מבני מפורט על גליקנים פרט. בניגוד בולט, ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לעזור לזהות ולכמת ומבני glycan פרט לחשוף מידע מבני כגון אתרים מצורפים ליבות פוליפפטיד. ביטוי או פעילות פיקוח ממשלתי של glycosyltransferase רק אחד יכול ליזום מפל של אירועים מולקולריים מזיקים במסלולי glycosylation מרובים. מכיוון שכל glycosyltransferase יכול לפעול על יותר מ המצע glycoconjugate אחד ועל פני פולימרים glycan גדל שונים, מפלי biosynthetic deregulated להניב disproportionally כמויות גדולות יותר של המוצר glycan אבל כמה היחיד בכיתות הטרוגניות של גליקנים סוטה בנוזלי התוך או תאיים. 33 עם זאת, גליקנים סוטה ייחודי כזה לפעמים נחשבים מעשי כסמנים ביולוגיים לסרטן או פתולוגיות glycan-רגשיים אחרים, שכן בהשוואה הבריכה הגדולה של היטב מוסדר גליקנים, גליקנים הסוטים אלה מייצגים רק חלק קטן מאוד היא, לעתים קרובות להישאר לגילוי אפילו בטכנולוגיות כגון רגישות גבוהה כמו ספקטרומטריית מסה. לדוגמא, בנוזלי גוף תוך תאיים, ספקטרום חלבון-הריכוז הרחב (אשר משתרע על פני שמונה סדרי גודל) יכול למנוע זיהוי של גליקופרוטאינים נדירים כי הם רעולים פנים על ידי המינים שופעים יותר. 32 יתר על כן, בקביעת פעילות glycosyltransferase נשארה ניכר מעשי ואתגר תיאורטית כיוון glycosyltransferases רב נעדר biofluids הקליני או להיות פעיל vivo לשעבר. למרות הקושי של consistently גילוי וכימות כמויות אולטרה-דקות של גליקנים שלם ייחודי, מתרגלים של ספקטרומטריית מסה עשו צעדים עצומים כלפי העסקת גליקנים שלמים כסמנים קליניים. פתחנו לאחרונה גישה משלים לניתוח של גליקנים שלם כי, העסקת GC-MS, מקלה על זיהוי של כל סניף נקודות המכוננות מונוסכרידים ספציפי הצמדה ( "צומת glycan") שיחד להקנות ייחודיים לכל glycan ובהרבה במקרים ישירות לשרת פונדקאי מולקולרית כמו זה לכמת את הפעילות היחסית של glycosyltransferase האשם (הים).
מאז שלה דיווח לראשונה בפנייה ישירה ניתוח glycan בשנת 1958, גז כרומטוגרפיה (GC) הוכיחה טכניקה רבת עוצמה כדי לנתח שידורי מפוגל מונו ו disaccharides, 34 לקבוע anomericity שלהם ותצורה מוחלט, ולהפריד אותם לניתוח spectrometric הבאים המוני. 35 בין השנים 1984 ו -2007, Ciucanu ועמיתיוהציג ומעודן טכניקה permethylation glycan-שלב מוצק שהעסיקה הידרוקסיד נתרן iodomethane, ואחריו מיצוי נוזלי נוזלי / של גליקנים permethylated באמצעות מים כלורופורם. 35,36 בין השנים 2005 ו -2008, קאנג ועמיתים לעבודה משולבת ספין חוסך זמן הגישה -column לתוך צעד permethylation. 37,38 בשנת 2008, קבוצת המחקר גץ המציאו-שלב מוצק כמותית permethylation שיטת glycan-פרופיל משתמש יינון-desorption לייזר בסיוע מטריקס (MALDI) ספקטרומטריית מסה כדי להשוות ואפשרות להבחין פולשנית ובלתי תאי -invasive סרטן השד; 39 אז, בשנת 2009, האנזימטית גץ צוות המשולבת וטכניקות שחרור כימיות לדבוק O -glycans מ גליקופרוטאינים שלם בתכנית permethylation מוצק שלב בסיסית מאוד 40 למרות הליך גץ הקל permethylation סימולטני ושחרור כימי. של O -glycans, יושם זה רק כדי glyco טרום מבודדחלבונים. שינינו את הטכניקה הזו בשנת 2013 והתאימה אותו עבור biofluids unfractionated כולו דגימות רקמה הומוגני ידי שילוב חומצה trifluoroacetic (TFA) הידרוליזה, הפחתה, ואת acetylation צעדים. 33 צעדים נוספים אלה גם לשחרר גליקנים מ glycolipids ו- N -linked גליקנים מ גליקופרוטאינים ולהמיר אותם acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs, איור 1), שדפוסי מתילציה-ו-acetylation ייחודי להקל על ניתוח על ידי GC-MS ייחודי לאפיין את בלוטות glycan מכוננת בפולימר glycan ללא פגע המקורי 41 (איור 2). 33 בסופו של דבר, זה הליך מייצר דיוקן מורכב של כל גליקנים בתוך biofluid מורכב הבוסס על ישירה, כימות יחסית של תכונות glycan ייחודיות כגון "ליבת fucosylation", "6-sialylation", "שחצה GlcNAc", ו "בטא 1-6 הסתעפות" - כל נגזר chromatograp GC-MS יחידשיא יק. מאמר זה מציג אופטימיזציה נוספת של permethylation, acetylation, בידוד, ושלב לנקות יחד עם שיפורים במצב של כימות יחסית.
זהירות: הימנע העור / קשר עין עם כל של חומרים כימיים המשמשים בניסוי זה. בחשיפה, ביסודיות לשטוף את האזור הפגוע במים ולפנות לעזרה רפואית מיידית.
1. Permethylation ו glycan הפקת
2. trifluoroacetic חומצה (TFA) הידרוליזה
זהירות: חומצת trifluoroacetic (TFA) היא חומצה אורגנית מאכל מגרה רעילה.
הפחתת 3.
4. acetylation (הנערכת במנדף)
5. גז כרומטוגרפיה - ספקטרומטריית מסה (GC-MS)
6. ניתוח נתונים
הכרומתוגרמה שוטף יון (TIC) מראה permethylation המוצלח, הידרוליזה, הפחתה, ואת acetylation של דגימות פלזמת דם אדם ביחס למקרים בם שני צעדי permethylation קריטיים הוצאו להורג באופן שגוי מוצגת באיור 3.
מוחלטים תשואה של HexNAcs יחסית Hexoses:
N -acetylhexosamine (HexNAc) acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs) נוטים להיות בעלי תשואה נמוכה לעומת hexoses. 43 כדי להעריך את התשואה מוחלטת של יחסי HexNAcs כדי hexoses, שש דגימות של 10 מיקרוגרם של N -acetyllactosamine (א disaccharide Gal1-4GlcNAc) ב 10 μl של מים נותחו. אזורי שיא TIC עבור גלקטוז מסוף (t-גל) ו -4-GlcNAc שולבו. אחוז 4-GlcNAc ביחס לסכום הכולל של t-גל 4-GlcNAc היה 11.3 ± 0.7% (SEM). למרות תשואות HexNAc הן לשחזור (ראה להלן), את העובדה כי ערך זה הוא הרבה פחות מהערך התיאורטי של 0.5 עולה כי התשואה של HexNAcs נמוכה באופן מהותי מזה של hexoses. (התשואה התיאורטית HexNAc הוא 0.5 בגלל N -acetyllactosamine הוא 1:. Disaccharide 1 hexose-HexNAc)
שחזור תוך Interassay:
תוך שחזור interassay עבור כל צומת glycan תורמים לפחות 1% של hexose המוחלט או אות HexNAc ניתן בטבלה 1. נתונים אלה נרכשו על ידי 3 אנליסטים נפרדים ב -3 ימים נפרדים, תוך שימוש באותה המניות של פלזמת EDTA. נתוני יציבות autosampler תחת פרוטוקול אופטימיזציה זה עבור 18 הצמתים glycan בשכיחותו מפלסמה אנושית (כלומר, אלה עם> 1% של hexose מוחלט או אות HexNAc) ניתנים באיור 4.
ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> הערות חשובות אחרות:
תוך אופטימיזציה של המתודולוגיה permethylation, מצאנו כי אין זה הכרחי כדי למנוע ספיחה של מים על ידי חרוזי NaOH לפני שיתחיל כביסה עם אצטוניטריל. גם מצאנו כי הנוכחות של כמות קטנה של מים במהלך השלב הסופי acetylation בשילוב עם תקופה קצרה של חימום עם אנהידריד אצטית ללא TFA עוזרת להקל תגובה מלאה. לבסוף, המתח הגבוה בפתרון זמן של טיסה (TOF) ספקטרומטריית מסה אין צורך לניתוח צומת glycan מוצלח: תוצאות ראשוניות מבוססים על הזרקה מקבילה של אותה הקבוצה של דגימות על GC-TOF-MS ו quadrupole שידור מסורתי מבוסס GC-MS פעל ניטור יון נבחר (SIM) מצב להפגין תוצאות דומות מבחינת hexose המנורמל סופית שכיחותם יחסית HexNAc.
er.within-page = "1">
. סקירה באיור 1. מולקולרית של הליך ניתוח מתילציה glycan העולמי ב- O -linked glycan מודגם; אלה משתחררים במהלך תהליך permethylation, אשר הותאם מ גץ. 40 בעקבות permethylation הידרוליזה, מונוסכרידים מופחתים וקבוצות הידרוקסיל המתהווה "מסומנים" על ידי acetylation. הדפוס הייחודי של מתילציה acetylation בתוך acetates alditol המפוגל חלקי הסופי (PMAAs) תואם את "צומת glycan" הייחודית בפולימר ללא פגע המקורי ומספק את הבסיס המולקולרי פרדה וכימות ידי GC-MS. N -linked ו גליקנים glycolipid משתחררים כמו מונוסכרידים מסומן הצמדה במהלך הידרוליזה חומצית. מעובד מתוך ואח בורחס. 33 באישורו.> אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סקירה מושגית איור 2. מושג אנליטי. Glycosyltransferase שהוגבר (למשל, GnT-V) גורמת לעלייה בכמות משקע monosaccharide glycan ספציפי, מקושר באופן ייחודי (א "צומת" 2,6 צמוד מנוז בדוגמא זו) "שפירושו, דרך הפעולה הבאה של glycosyltransferases האחר, יכול להוביל להיווצרות של תערובת של מבנים הטרוגנית כל-glycan בבית המספר נמוך עותק כל-כל מה שיכול להיות קשה לזהות ולכמת בצורה שיגרתית. אנליטית איגום יחד את "צומת glycan" מבין כל מבני glycan הסוטים מספקת מדידה פונדקאית ישירה יותר של פעילות GnT-V מכל glycan יחיד ללא פגע. המדידה סימולטני של N -, O -, ו ליפיד מקושרים "glyc צומת "ב biospecimens כולו כמתואר כאן (במקור במקום אחר 33) מייצג אמצעי רומן מושגית שבאמצעותו לזהות ולנטר מחלות glycan-רגשיות כגון סרטן. chromatograms יון חילוץ בפועל ממדגמים בפלזמת דם של 10 מיקרוליטר לראות. מספרים סמוכים שאריות monosaccharide במבני glycan לציין את המיקום שבו השאריות הגבוהות צמודות השאריות הנמוכות. אם לא תהיה עמדות הצמדה מצוינות ביאור הכרומתוגרמה השאריות הוא או במצב הסופנים או חינם בתמיסה (למשל, גלוקוז). כל השאריות . מלבד קישור חומצה sialic כלפי מטה דרך 1-עמדתם; קישורים חומצה sialic כלפי מטה באמצעות 2-עמדתה הפילוג הכרומתוגרמה מציין שינוי chromatograms יון חילוץ: m / z 117 129 שאריות hexose ו- m / z 116 + 158 עבור N - שאריות acetylhexosamine (HexNAc). מעובד מתוך בורחס et al. 33 באישורו.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. נציגי תוצאות. Chromatograms הנוכחי יון סה"כ (טיקים) לניתוח צומת glycan של המדגם הזהה פלזמת EDTA הדם האנושי שבה א) המדגם היה מעובד כראוי, ב) המשקע הלבן בפתרון permethylation כי היה סובב דרך NaOH טור בוצע לתוך התערובת עוקבת עבור חילוץ נוזלי / נוזל, ו- C) פתרון permethylation כי הייתה סובב דרך עמודת NaOH נוסף למאגר פוספט אבל לא מעורב באופן יסודי לפני תוספת של כלורופורם להפקת נוזלי / נוזל. מקרא מסופק באיור 2. אנא לחץ here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. יציבות autosampler. יציבות autosampler מעל 48 שעות במשך 18 הצמתים glycan בשכיחותו מפלסמה אנושית. בגיל 22 שעות המדגם היה מיובש לגמרי מחדש בשנת 120 μl אצטון. כל מקבץ של נקודות נתונים מייצג ארבע זריקות רצופות של המדגם הזהה. קווים שחורים להקיף ± 15% משווי המנורמל הממוצע עבור כל צומת glycan. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1. תוך שחזור interassay. ערכים מייצגים CV% של hexose המוחלט או HexN הכוללAc-מנורמל צומת glycan פרט. כל צומת glycan תורמים לפחות 1% של hexose המוחלט או אות HexNAc מפורטים. נתונים נרכשו על ידי 3 אנליסטים נפרדים ב -3 ימים נפרדים, באמצעות המניות הזהות של פלזמת EDTA. N = 6 דגימות לכל אצווה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה כמו גיליון אלקטרוני של Excel.
ככלל, ההפקה המוצלחת של acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs) מ hexoses כרוך בקשיים פחות היא איתנה יותר מאשר ייצור מוצלח של -acetylhexosamine N (HexNAc) PMAAs. המנגנון המדויק מאחורי התופעה כפי שהיא משחקת בחוץ בכל שלב של הליך זה אינו ידוע, אך יש להתייחס הכימיה הייחודית של קבוצת N -acetyl (ולא קבוצת הידרוקסיל) כי היא ייחודית ביחס HexNAcs כדי hexoses. המנגנון מאחורי תופעה זו כפי שהיא מתייחסת הידרוליזה חומצית מוסבר במקום אחר. 43 בקיצור, הקיבולת עבור -methylacetamido N להיות בעלי מטען חשמלי חיובי במהלך הידרוליזה חומצית הופכת את הצמדת glycosidic העמידה בפני הידרוליזה חומצית. זה מסביר את התשואה הנמוכה יחסית HexNAc כדי hexose (11.3% ממסר HexNAc + hexose הכולל, ולא 50% בסך הכל) כמתואר לעיל לניתוח -acetyllactosamine N. יש לציין, זה יחסית lתשואת ower של HexNAcs לא הופכת אותם קשה לזהות biofluids מורכב רקמות, או למנוע זיהוי קליל של בלוטות glycan נגזרו גליקנים גדול ומורכב (למשל, 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Man, ו 3,4-GlcNAc, איור 2). 33 בהתחשב באופן שבו XIC אזורי שיא של בלוטות glycan מנורמלים (שלב 6.3), כל עוד התשואה היחסית של כל HexNAc אדם נותר יחסית עקבי HexNAcs האחר ( אשר הוא עושה, ראה טבלה 1), מידע שימושי על הכמויות היחסיות של HexNAcs השונה בין מדגמים שונים ניתן להשיג. זה נכון גם לגבי hexoses גם כן. יתר על כן, אנו בעבר הראינו כי היחסים של hexoses כדי HexNAcs להציג התנהגות כמותית עקבית כמו גם 33 - תופעה מנוטרת כל זמן באמצעות שילוב של מדגם QC (ים) בכל אצווה.
האופן שבו permethylation מתבצע יש את ההשפעה הגדולה ביותר עלהתשואה שחזור הכוללת של HexNAc PMAAs. בפרט, בזהירות רבה יש לנקוט כדי להימנע מחשיפה לחלוטין של גליקנים permethylated אלקליין תנאים מימיים. שני שלבים עיקריים בהקשר זה הם 1) מה שמשאיר את כל המשקע הלבן הפתרונים-דרך הספין מאחורי (שלבי 1.3.13 ו 1.3.14), ו -2) מייד ערבוב פתרונות הספין לעבור ברגע מתווספים למאגר פוספט ( שלבי 1.3.13 ו 1.3.14). חיץ ולא תמיסת מלח פשוטה כלול בשלב זה ועל צעדי חילוץ הבאים נוזלי / נוזל למניעת alkalinization מכוונת של בתמיסה המימית. אנו חושדים כי בתנאי אלקליין קבוצת אצטיל של קבוצת 2-אמינו המפוגלת acetylated של HexNAcs עשויה לעבור הידרוליזה, וכתוצאה מכך אמינה משני קוטביות יותר מקטין את יעילות החילוץ הכוללת של glycan הקשורים לתוך כלורופורם.
התכונה הבולטת ביותר בקלות HexNAcs permethylated הצלחה היאעוצמת GlcNAc הצמודה 4 (4-GlcNAc) ביחס לשיא chromatographic לאלה של 6-גל, 3,6-Man, ואת עוצמת הבסיס של ברקע במהלך ואופים-אאוט עמודה האחרון (איור 3). כאשר השפע המוחלט של PMAA 4-GlcNAc הוא נמוך, יחסית השפע המנורמל שלה לכל HexNAcs האחר נוטה גם להיות נמוך, עם גדלה מקבילה (רוב ניכרת) של 3,4-GlcNAc.
כמה שינויים שנועדו לייעל חוסן התשואה assay הכוללת נעשו מאז הפרסום הראשוני שלנו בתיאור גישה האנליטית זה 33 אחד השינויים הללו היא הדרך שבה chromatograms יון החילוץ המשולב (XICs) מנורמל:. למען הפשטות, אנחנו עכשיו לחלק את שטח כל XIC hexose היחיד על ידי הסכום של כל האזורים XIC hexose; כמו כן, באזור של כל פרט HexNAc XIC מחולק בסכום של כל תחומי HexNAc XIC. כפי שניתן לראות בטבלה 1, הכוללת interassay / בין-אנליסט reproducibility עבור כל צומת glycan שתורמים> 1% של ממוצעי אות hexose או HexNAc שלהם 13% CV.
למיטב ידיעתנו, זהו הגלגול רק של glycomics מלמטה למעלה אמיתית שבו גליקנים המחולקות ראשונות למטה ואז ומרכיביהן נתחו לבנות דיוקן מדגם רחב כמותית של רכב glycan. כאן, במקום לשחרר האנזימטית מסורתית, תהליך permethylation הלא reductively מבטל (משחרר) O גליקנים -linked מהחלבונים שלהם, 40 בעוד N -linked גליקנים שפורסמו במהלך הידרוליזה חומצית. 33 כגישת משלים glycomics מלמעלה למטה המסורתי גישה, זה הוא מסוגל הבריכה כולל glycan ייחודי של עניין כגון "fucosylation הליבה", "6-sialylation", "שחצתה GlcNAc", ו "בטא 1-6 הסתעפות" לאותות אנליטית אחת (ראו, 4,6-GlcNAc , 6-גל, 3,4,6-Man ו-Man 2,6 צמתים 2 איור, respectively). בגישות מלמעלה למטה מסורתיות, תכונות כגון אלה כי בסופו של דבר התלוי על הפעילויות הייחודיות של glycosyltransferases מפתח אחד או שניים 33 מופצים בדרך כלל על פני עשרות גליקנים שלמים ולפעמים יכולות להיות קשה או בלתי אפשרי לפתור (למשל, 3-sialylation לעומת 6-sialylation) בשל הניוון של כמה המוני glycan ללא פגע. יתר על כן, הגישה מלמטה למעלה המוצג כאן הוכיחה הבטחה ראשונית הלא פולשני לאיתור סרטן הריאות. 33 מחקרים נוספים נערכים כדי לאמת את הממצאים הראשוניים הללו, כמו גם נוספות, עדיין תוצאות לא פורסמו הנוגעים לגילוי של צורות אחרות של הסרטן.
המגבלה הגדולה ביותר של הגישה המתוארת כאן היא שזה מוגבל מבחינת גבולותיה של זיהוי, אם היו לחול על גליקופרוטאינים טרום מבודדים. בהתבסס על ניתוחים פורסמו תקני glycan פרט ללא חלבון מוביל, גבולות כימות FOr פרט גליקנים להופיע לשקר בטווח מיקרוגרם הנמוך. אלה הם בהחלט לא LOQs נמוך במונחים אבסולוטיים, אך עובדה זו אינה משנה לעניין היקף שנועד במקור של assay-אשר לא תוכנן עבור ואין לו צורך להשיג LOQs נמוך (לפחות למטרות המתוארות כאן בפרסום הקודם שלנו 33). למעשה, מפלסמה אנושית / הסרום מכיל גליקופרוטאינים ב 10s של מגוון בעלי כוונות טובות ריכוז מ"ג / מ"ל כי לניתוח הפלזמה בדם / סרום אנחנו רק להזריק ~ 1/100 ה של נפח דגימה הסופי ולפצל 40 מתוך 41 חלקים כמות קטנה כי לבזבז בנמל מזרק GC. ללא תרגול זה, כמה מן הצמתים glycan יכול להרוות את גלאי. כמויות Picomole של גליקופרוטאינים שיכולים לייצר אותות glycan שלמים נאותים על ידי גישות מלמעלה למטה הקונבנציונלי MALDI-MS או LC-MS מבוססים לא ניתן לאתר באמצעות גישה זו. עידון נוסף על המתודולוגיה מתנהל לתקן מגבלה זו.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the College of Liberal Arts and Sciences of Arizona State University in the form of laboratory startup funds to CRB. It was also supported by a grant from Flinn Foundation (Grant No. 1977) and by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number R33CA191110. JA was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) under award number R25GM071798. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved