غليكان تحليل عقدة: نهج من أسفل إلى أعلى لGlycomics

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

السكرية، البروتينات السكرية، بروتيوغليكان، والجليكوزامينوجليكان تشكل الطبقات الأربعة الرئيسية، والكربوهيدرات المعقدة غير المتجانسة والتي تعرف باسم glycans. كمكونات في كل مكان ولا يتجزأ من غشاء البلازما، الكنان السكري، والمصفوفة خارج الخلية والسوائل، glycans مشاركة في مثل هذه العمليات الكيميائية الحيوية المتنوعة كما الإلتقام والاتجار داخل الخلايا، حركية الخلية، ونقل الإشارة، والتعرف الجزيئي، تنشيط مستقبلات، التصاق الخلايا والتفاعل المضيف الممرض ، بين الخلايا والاتصالات، والترصد المناعي، والمناعي استجابة بدء ¹ الحاضر تقريبا في كل مجال من الحياة، والانزيمات المعروفة باسم glycosyltransferases أن بناء البوليمرات غليكان تعمل جنبا إلى جنب مع هيدروليز الأنتراكينون (المعروف أيضا باسم glycosidases، والذي كسر glycans) لبناء وإعادة تشكيلها، وفي نهاية المطاف تنتج الانتهاء البوليمرات غليكان ^2. وعلى الرغم من كل ناقلة الغليكوزيل قد تعمل على غليكوكونجوغاتيس مختلفة، وهي ناقلة الغليكوزيلتقيم عموما linkage- ومصاوغ كربونيلي محددة رابطة غليكوسيدية عن طريق نقل شاردة أحادي السكاريد من معين النوكليوتيدات تنشيط السكر المانحة (على سبيل المثال، الناتج المحلي الإجمالي فوكوسي) على فئة معينة من يقبلون أليفة النواة (على سبيل المثال، الدهن، ببتيد، الحمض النووي، أو تزايد قليل السكاريد). وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 50٪ من البروتينات (خاصة غشاء والبروتينات إفرازية) هي مرحلة ما بعد translationally تعديلها من قبل بالغليكوزيل ³ حسابات اندماجي البدائية تقدم تقديرا للتفاوتا كبيرا، وبراعة، وخصوصية الممنوحة للبروتينات سكرية التي كتبها بالغليكوزيل؛ على سبيل المثال، إذا كان الركيزة ببتيد لديها فقط 10 مواقع بالغليكوزيل وكل موقع يمكن أن تشكل صلة غليكوزيدية مع 1 من 3 فقط أحادي السكاريد مختلف الغايات الحد، ثم، من الناحية النظرية، وبروتين سكري النهائي يمكن أن تتحمل 3 ¹⁰ = 59049 هويات متميزة. في بروتينات سكرية، والروابط غليكوزيدية تشكل عادة مع الجانب سلسلة النيتروجين سالمخلفات و الهليونين في تسلسل الأسباراجين-X-سر / منتدى المجالس الرومانسية (X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية إلا البرولين) لانتاج N -glycans ² والجانبية سلسلة الهيدروكسيل سيرين وثريونين المخلفات لانتاج يا -glycans ^4. تكوين glycome الخلية (أي مكمل من المنتجات بالغليكوزيل) هي فريدة من نوعها ومحدود، لأنه مع وجود استثناءات قليلة، glycosyltransferases يحمل المانحة الصارم، متقبل، وخصوصية الربط. ⁵ بروتين بلازما الدم هامة وفيرة تعاني بالغليكوزيل الشاذة نتيجة المصب التعبير ناقلة الغليكوزيل غير طبيعي والنشاط بسبب العديد من الحالات المرضية، وخاصة السرطان والأمراض الالتهابية. ^6-24

ويرجع ذلك أساسا إلى عوامل جينية، وglycome بشكل ملحوظ أكثر تنوعا وديناميكية، ومعقدة من بروتيوم وTranscriptome على. ^25،26 بينما ما يقرب من 1٪ من الجينوم الثدييات بترميز تشكيل وتعديل، وتجميع glycans، ²⁷ العائدات بالغليكوزيل بطريقة تناقض ملحوظ مدفوعة غير القالب إلى ببتيد والحيوي الحمض النووي. التفاعل بين كمية النسبية ونشاط الأنزيمات بالغليكوزيل وهذه العوامل البيئية مثل توافر المواد الغذائية والسلائف يحدد في نهاية المطاف الطبيعة، ومعدل، ومدى ارتباط بالغليكوزيل. ^5،28 مرحلة التطور الجنيني (على سبيل المثال، تقرير والتمايز)، وتفعيل الخلوي، وتقدم من خلال التعبير تأثير الجينات دورة الخلية (أي النسخ والترجمة) ويغير هوية وكمية من glycosyltransferases المتاحة، الذي النشاط هو المحدد المنبع الفوري لمحة غليكان الخلية. لأن (بعض) التكاثري، لاصق، وخصائص الغازية من الخلايا السرطانية تشبه الخلايا تخلقي العادية، تغييرات محددة في مسارات السكروز غليكان (على سبيل المثال، وتراكم السلائف والتعبير حررت، aberranر التعديل، اقتطاع الهيكلي، أو تشكيل رواية) تخدم المؤشرات الحيوية السرطان العالمية التي تشير إلى مراحل مختلفة من تشكيل الورم، والتقدم، والهجرة، وغزو ²⁹ وعلى الرغم من ارتباط بالغليكوزيل معقد للغاية، ومن الواضح سوى عدد قليل من التعديلات في بالغليكوزيل أن تمكن السرطان وورم خبيث؛ على ما يبدو، بعض "الشاذة" المنتجات بالغليكوزيل تستفيد بالفعل الخلايا السرطانية من خلال تمكينهم من التهرب من الاعتراف المناعة، والبقاء على قيد الحياة لمطالب الهجرة في البيئات داخل الأوعية الدموية والمنتشر وعرة. ^28،30،31 ليس من المستغرب، وقد كشفت التجارب أن تعطيل أو منع أنماط تغيير التعبير الجيني وتشكيل غليكان الشاذة يمكن أن توقف تكون الأورام. ²⁹ ومع ذلك، فإن glycans الشاذة في الكشف عن عينة biofluid (على سبيل المثال، والبول واللعاب، وبلازما الدم أو المصل) قد لا تكون المؤشرات المباشرة من السرطان (أو مرض آخر)، ولكن المصب بدلا نتائج خفية بعد هامةتغييرات في الجهاز المناعي أو عواقب يمكن قياسها من شرط الخبيثة في الجهاز لا يمكن التنبؤ بها. ³²

على الرغم من أنها تقدم معلومات شاملة عن glycome، العديد من الجزيئية تقنيات glycomics القائم على التفاعل (على سبيل المثال، كتين / صفائف الأجسام المضادة والتمثيل الغذائي / التساهمية التوسيم) تعتمد على الكشف عن هياكل غليكان كلها وليس لتوفير المعلومات الهيكلية المفصلة حول glycans الفردية. في تناقض واضح، ويمكن قياس الطيف الكتلي (MS) تساعد في تحديد وقياس هياكل غليكان الفردية وتكشف هذه المعلومات الهيكلية مثل مواقع التعلق النوى ببتيد. التعبير حررت أو نشاط ناقلة الغليكوزيل واحد فقط يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الجزيئية ضارة في مسارات بالغليكوزيل متعددة. لأن كل ناقلة الغليكوزيل قد تعمل على الركيزة glycoconjugate أكثر من واحد وعبر مختلف البوليمرات غليكان المتزايد، شلالات السكروز حررت تسفر disproporزيادة دوليا هو كميات من المنتج غليكان واحد فقط ولكن عدة فئات غير متجانسة من glycans الشاذة في سوائل البينية أو خارج الخلية، وتعتبر ³³ بيد أن هذه glycans الشاذة الفريدة في بعض الأحيان غير عملي والمؤشرات الحيوية للسرطان أو غيره من الأمراض غليكان-الوجدانية ل، مقارنة مع حمام سباحة كبير من glycans منظمة تنظيما جيدا، وهذه glycans الشاذة تمثل جزء صغير جدا التي قد تبقى في كثير من الأحيان لا يمكن الكشف عنها حتى من قبل هذه التقنيات حساسة للغاية كما مطياف الكتلة. على سبيل المثال، في سوائل الجسم البينية وخارج الخلية، وطيف واسع تركيز البروتين (الذي يمتد ثمانية أوامر من حجم) يمكن أن يمنع الكشف عن بروتينات سكرية النادرة التي يتم من قبل ملثمين الأنواع أكثر وفرة. ³² وعلاوة على ذلك، وتحديد النشاط ناقلة الغليكوزيل لا تزال كبيرة عملي والتحدي النظري لأن العديد من glycosyltransferases غائبة في biofluids السريرية أو تصبح غير نشطة خارج الحي. وعلى الرغم من صعوبة consistenكشف TLY وقياس كميات دقيقة جدا من glycans كاملة فريدة من نوعها، جعلت ممارسي قياس الطيف الكتلي خطوات هائلة نحو توظيف glycans سليمة كعلامات السريرية. لقد وضعت مؤخرا اتباع نهج متكامل لتحليل glycans سليمة أن توظف GC-MS، يسهل الكشف عن جميع المكونة فرع نقطة والسكريات الأحادية-الربط معين ( "العقد غليكان") التي نقلها معا تفرد لكل غليكان وفي كثير الحالات تكون مباشرة بدائل كما الجزيئية التي قياس النشاط النسبي للناقلة الغليكوزيل تحت طائلة المسؤولية (ق).

منذ لأول ذكرت التطبيق المباشر لتحليل غليكان في عام 1958، وقد ثبت اللوني للغاز (GC) تقنية قوية لتحليل ميثليته لكل أحادية و disaccharides، ³⁴ تحديد anomericity والتكوين المطلق، وفصلها عن التحليل الطيفي الشامل لاحق. ³⁵ بين عامي 1984 و 2007، Ciucanu والزملاءقدم والمكرر الصلبة مرحلة permethylation غليكان التقنية التي تستخدم هيدروكسيد الصوديوم وiodomethane، تليها استخراج السائل / السائلة من glycans permethylated باستخدام الماء والكلوروفورم. ^35،36 بين عامي 2005 و 2008، كانغ وزملاء العمل المتكاملة تدور لتوفير الوقت نهج -column في خطوة permethylation. ^37،38 في عام 2008، ابتكرت مجموعة بحث جويتز على كمية الصلبة مرحلة permethylation طريقة غليكان-التنميط باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين (MALDI) قياس الطيف الكتلي للمقارنة والتمييز الغازية وغير محتملة -invasive خلايا سرطان الثدي ^(39)؛ ثم، في عام 2009، وفريق جويتز جنبا إلى جنب الأنزيمية وتقنيات الافراج الكيميائية ليلتصق يا -glycans من بروتينات سكرية سليمة في مخطط permethylation الصلبة مرحلة شديدة القلوية ⁴⁰ على الرغم من أن الإجراء جويتز تسهيل permethylation في وقت واحد، والإفراج الكيميائية. من يا -glycans، تم تطبيقه فقط إلى ما قبل معزولة غليكوالبروتينات. نحن تعديل هذه التقنية في عام 2013 وتكييفه لbiofluids غير المجزأ كاملة وعينات الأنسجة المتجانس من خلال دمج حمض trifluoroacetic (TFA) التحلل، والحد، وأستلة الخطوات. ³³ وهذه خطوات إضافية أيضا إطلاق سراح glycans من السكرية وN -linked glycans من بروتينات سكرية وتحويل لهم في الأسيتات مميثل جزئيا alditol (PMAAs، الشكل 1)، الذي مميزة أنماط مثيلة، وأستلة تسهيل التحليل GC-MS وفريد ​​تميز العقد غليكان المكونة في الأصلي البوليمر غليكان سليمة ⁴¹ (الشكل 2). ³³ في نهاية المطاف، وهذا الإجراء ينتج صورة مركبة لجميع glycans في biofluid مجمع على أساس والتقدير الكمي النسبي المباشر من الميزات غليكان فريدة مثل "fucosylation الأساسية"، "6-sialylation"، "تتوسط GlcNAc"، و "بيتا 1-6 المتفرعة" - كل مستمدة من chromatograp GC-MS واحدقمة التحالف الدولي للموئل. تقدم هذه المقالة مزيد من التحسين من permethylation، أستلة، والعزلة، ومراحل تنظيف جنبا إلى جنب مع تحسينات في طريقة تقدير نسبي.

تحذير: تجنب ملامسة الجلد / العين مع أي من الكواشف المستخدمة في هذه التجربة. عند التعرض، تدفق بدقة المنطقة المتضررة بالماء وطلب المشورة الطبية الفورية.

1. Permethylation وغليكان استخراج

1. إعداد عمود
   1. الحصول على العديد من وحدات العمود microfuge تدور كما العينات لتحليلها. كسر وفصل البلاستيك قبعات أنبوب خزان. وضع مرشح microfuge مصغرة في كل أنبوب خزان. وضع تجميعها الأعمدة تدور microfuge (التي تحتوي على مرشحات صغيرة) في رف microfuge أنبوب.
   2. الحصول على الأسهم من هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حبات (20-40 شبكة). نقل بعض هيدروكسيد الصوديوم إلى قارب وزنها صغير أو، إذا الرطوبة يسبب تراكمها، قذيفة هاون الخزف الساخنة مثل الأوراق المالية العاملة من هيدروكسيد الصوديوم. تجنب استخدام كتل من الخرز هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم أو سحقت / مسحوق.
      تحذير: هيدروكسيد الصوديوم هو مادة سامة قوية وقاعدة للتآكل. تدفق يتعرض الجلد / العينين بالماء لمدة 15 دقيقة. ThorougHLY تنظيف طاولة العمل بعد الانتهاء من التجربة.
   3. استخدام مغرفة صغيرة أو ملعقة، ونقل حبات هيدروكسيد الصوديوم من المخزون تعمل على ملء مرشحات صغيرة microfuge مع هيدروكسيد الصوديوم حتى شطبة الخارجي الأول (~ 5 مم تحت حافة). الاستفادة من المرشحات microfuge شغل على مقاعد البدلاء أعلى لحزم / تكثيف حبات هيدروكسيد الصوديوم.
      ملاحظة: طوال هذه التجربة، لتقليل امتصاص المياه الزائدة من الخرز هيدروكسيد الصوديوم استرطابي، والحفاظ على مستوى من أي سوائل المضافة (مثل، الأسيتونتريل، ثنائي ميثيل سلفوكسيد، تحليلها الحل) فوق سطح العمود التعبئة هيدروكسيد الصوديوم والحد من الاتصال المباشر مع الهواء.
   4. الحصول على مخزون من الأسيتونتريل (إيه سي). نقل ~ 350 ميكرولتر ACN إلى كل مرشح صغير microfuge معبأة هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على هيدروكسيد الصوديوم المغمورة تحت ACN وإزالة فقاعات الهواء الكبيرة عن طريق اثارة مع هلام التحميل ماصة طرف مجعد.
      تحذير: الأسيتونيتريل هو مصدر إزعاج للاشتعال.
   5. عمود الطرد المركزي
      1. ترتيب الأعمدة microfuge متناظر داخل جهاز للطرد المركزي. استخدام أنبوب التوازن إذا لزم الأمر. تجنب إراقة أي حبيبات هيدروكسيد الصوديوم داخل أجهزة الطرد المركزي. إغلاق الغطاء أجهزة الطرد المركزي.
      2. الطرد المركزي الأعمدة (التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وإيه سي) ل~ 15 ثانية في 2400 × ز.
      3. عند الانتهاء من الطرد المركزي، وإزالة الأعمدة microfuge من أجهزة الطرد المركزي، وتجاهل إيه سي في وعاء النفايات الخطرة. الحفاظ على العمود هيدروكسيد الصوديوم التعبئة سليمة.
   6. إضافة ~ 350 سلفوكسيد ثنائي ميثيل ميكرولتر (DMSO) لكل مرشح صغير microfuge معبأة هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على هيدروكسيد الصوديوم المغمورة تحت DMSO وإزالة أي فقاعات الهواء الكبيرة مع طرف ماصة. كما هو موضح سابقا، والأعمدة أجهزة الطرد المركزي ل~ 15 ثانية في 2400 × ز، وتجاهل DMSO مع الحفاظ على هيدروكسيد الصوديوم التعبئة سليمة.
      تحذير: DMSO هو المغير وإزعاج ويمتص بسهولة من خلال الجلد.
   7. سد جميع المرشحات مصغرة microfuge مع المقابس المدرجة في تصفية تدورعدة. نقل ~ 350 ميكرولتر DMSO لكل microfuge فلتر صغير معبأة هيدروكسيد الصوديوم واستخدام 200 ميكرولتر ماصة لإزالة فقاعات الهواء في التعبئة والتغليف هيدروكسيد الصوديوم بحيث تصل DMSO جميع المناطق داخل ثم التعبئة هيدروكسيد الصوديوم. تجنب سحق أو إلغاء مفرط حبات هيدروكسيد الصوديوم. مسحوق هيدروكسيد الصوديوم غير مرغوب فيها. الانتهاء من هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن.
2. إعداد مراقبة الجودة البلازما (QC) عينة (ق)
   ملاحظة: لضمان نتائج متسقة عبر دفعات تجريبية، والنظر في استخدام قسامة واحد على الأقل من عينة مأخوذة من كبير، وجمع معظم متجانس من المواد البيولوجية ذات الاهتمام ليتم تحليلها في كل دفعة. على سبيل المثال، إذا تحليل بلازما الدم، واستخدام قسامة (ق) من مجموعة الجزء الأكبر من بلازما الدم كعينة مراقبة الجودة (ق) في كل دفعة. عينات عملية مراقبة الجودة في بنفس الطريقة التي عينات مجهولة.
   1. الطرد المركزي عينة الأسهم مراقبة الجودة البلازما لمدة 4 دقائق في ~ 10000 × ز. أثناء الطرد المركزي، وبعض راسب عالية الكثافة قد يستقر إلى thالبريد القاع وبعض منخفض الكثافة راسب قد تطفو إلى أعلى البلازما. تجنب سواء عند إزالة قسامة (ق) من البلازما.
   2. انتقل إلى "1.3) إعداد نموذج" أدناه. ثم، والعودة إلى هذه الخطوة بعد الطرد المركزي البلازما كامل.
   3. سحب 9 ميكرولتر من طرد البلازما مراقبة الجودة وتحويلها إلى أنبوب اختبار البولي بروبلين 1.5 مل المسمى بشكل مناسب مجهزة مع قبعة الإضافية اغلاق (يشار إليها فيما يلي باسم "أنبوب اختبار البلاستيك 1.5 مل"). إضافة 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل قسامة. إذا رغبت في ذلك، واستخدام هذه باعتبارها الناقل لمعيار داخلي (ق).
   4. إضافة 270 ميكرولتر DMSO لهذه السيطرة البلازما. دوامة لضمان حل كامل.
3. إعداد عينة
   1. الحصول على أكبر عدد ممكن من أنابيب اختبار من البلاستيك 1.5 مل حيث بلغ عدد (الحليلة) العينات البيولوجية.
   2. نقل 9 ميكرولتر من كل (الحليلة) عينة بيولوجية إلى أنبوب اختبار في المقابل 1.5 مل من البلاستيك. نقل 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 270 ميكرولتر DMSO لكل أنبوب العينة.
   3. مزيج بقوة (على سبيل المثال، دوامة و / أو بشكل متكرر ماصة صعودا وهبوطا) العينات لضمان حل كامل في DMSO.
      تحذير: نفذ الخطوات التالية داخل غطاء الدخان. المستخدمة في الخطوات التالية، iodomethane (CH ₃ I)، ثنائي كلورو ميثان (CH ₂ الكلورين _2، ويعرف أيضا باسم كلوريد الميثيلين)، والكلوروفورم (CHCl _3، ثلاثي كلور الميثان)، هي السوائل المتطايرة قادرة على حل بعض أنواع البلاستيك (على سبيل المثال، قفازات النتريل) . تأكد من استخدام قفازات مقاومة المذيبات. بسبب انخفاض اللزوجة وبخار عالي الضغط، ويمكن لهذه الكواشف يتقطر من طرف ماصة أثناء النقل. تقليل الخسائر كاشف والتعرض المحتمل من خلال عقد المحلول المتاخمة للسفينة الاستقبال.
   4. نقل إجمالي حجم كاف من iodomethane ل، أنبوب نظيفة صغيرة. وسيكون لكل عينة تحليلها يتطلب 105 iodomethane ميكرولتر. نقل ~ 500 ميكرولتر ثنائي كلورو ميثان إلى عنوتإيه أنبوب نظيفة. لمنع انسداد حقنة، وشطف المحاقن مع ثنائي كلورو ميثان مباشرة بعد نقل iodomethane.
      تحذير: Iodomethane غير حساس، متقلب، والسم قوي قادر على إتلاف الجهاز العصبي المركزي أو التسبب في وفاة حالة استنشاقه أو ابتلاعه. ثنائي كلورو ميثان هو مادة مسرطنة محتملة، المغير الإنجاب، وقوية مهيجة قادرة على إلحاق أضرار عدة أجهزة أو التسبب في الموت.
   5. استخدام حقنة التحليلية لإضافة 105 ميكرولتر iodomethane لكل عينة تحليلها. كاب أنابيب تحليلها فورا للحد من تبخر iodomethane. تماما دوامة، وإذا لزم الأمر، الطرد المركزي لفترة وجيزة جميع العينات لضمان عدم وجود السائل يبقى في الحد الأقصى. أي تغيير اللون (على سبيل المثال، إلى اللون البني والأرجواني، أو أصفر) يشير تدهور iodomethane، الأمر الذي قد يعرض للخطر رد فعل permethylation التالية.
   6. شطف حقنة التحليلية المستخدمة لنقل iodomethane مع ثنائي كلورو ميثان 3 مرات على الأقل. هذا سوف يمنع ذلك جيئة وذهابام انسداد. التخلص من هذا شطف، جنبا إلى جنب مع iodomethane اضافية وثنائي كلورو ميثان في وعاء النفايات الخطرة العضوية. وضع أنابيب الاختبار المستخدمة في حاوية النفايات الخطرة.
   7. الحصول على مجموعة جديدة من أنابيب خزان من البلاستيك 2 مل. إزالة الأداة الإضافية قبعات إذا رغبت في ذلك.
   8. افصل مرشحات microfuge مصغرة. الطرد المركزي الأعمدة موصول لمدة 15 ثانية في 2400 × ز، ثم تجاهل أنابيب خزان جنبا إلى جنب مع النفايات السائلة DMSO.
   9. إعادة توصيل الأعمدة تدور طرد، ووضعها داخل أنابيب خزان جديدة. عدد كل عمود الدوران وأنبوب في خزان المقابلة مع نفس رقم العينة. تأكد من أن المقابس مرشح صغيرة ضيقة. تسرب محتمل يمكن أن تؤثر على الخطوة التالية. تقليل الوقت بين إزالة DMSO من الأعمدة تدور ونقل العينات المراد تحليلها على أعمدة الدوران.
   10. Permethylation
       1. كميا نقل كل محلول العينة إلى المقابلة شغل هيدروكسيد الصوديوم حبة شارك microfuge تدورlumn. استخدام 1000-ميكرولتر ماصة لهذه الخطوة. وبعد نقل، تجعيد ~ 2 ملم من نهاية غيض 200 ميكرولتر وترك الأمر في محتويات عمود لاستخدامه كقاعدة النمام. أكرر لجميع العينات.
          ملاحظة: اللزوجة المنخفضة من iodomethane يمكن أن يسبب فقدان عينة لأن الحل تحليلها يمكن أن يتقطر من طرف ماصة أثناء عملية النقل. عقد أنبوب العينة وعمود الدوران المجاورة لبعضها البعض من ناحية، ونقل بسرعة محلول العينة مع جهة أخرى.
       2. السماح للتفاعل permethylation المضي قدما لمدة 11 دقيقة. يقلب كل عينة 4-5 مرات على الأقل خلال هذه الفترة. لتسهيل permethylation كفاءة، والذي يحدث على سطح حبات هيدروكسيد الصوديوم، استخدام نصائح ماصة هلام التحميل تلميح معقوص كما النمامون إلى المزيج بلطف محتويات العمود. خلط العدواني يمكن أن يثقب مرشح تدور، إسحق وتعليق الخرز هيدروكسيد الصوديوم (والتي يمكن أن تقلل من فعالية السائل / استخراج السائل لاحقا)، و / أو يسبب فقدان العينة (كما ساmple-غارقة حبيبات هيدروكسيد الصوديوم يمكن أن الفائض من العمود).
       3. في إطار التحضير للالسائل / السائلة خطوة استخراج اللاحقة، وإعداد كمية كافية من 0.5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) حل في الفوسفات عازلة 0.2 M الصوديوم (7.0 درجة الحموضة)، ليتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة. وسيكون لكل عينة تتطلب ما مجموعه ~ 12 مل من محلول كلوريد الصوديوم لجميع المراحل الثلاث لاستخراج السائل / السائلة.
       4. عند الانتهاء من فترة permethylation 11 دقيقة، على الفور بعد فصل بعناية الأعمدة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 2400 × ز. تجاهل المقابس.
   11. على الفور إزالة الأعمدة تدور من أجهزة الطرد المركزي ووضعها في مجموعة جديدة من فارغة أنابيب تدور الخزان، وترك حل التدفق من خلال تحتوي على glycans permethylated الطازجة وراء. لا يستبعد حدوث اي شيء.
   12. في أقرب وقت ممكن، إضافة 300 ميكرولتر أسيتونتريل (إيه سي) إلى الجافة، والمرشحات تدور شغل هيدروكسيد الصوديوم. أجهزة الطرد المركزي المرشحات تدور لمدة 30 ثانية في 9600 × ز.
   13. فوراذ بعد ذلك، نقل الحل permethylation الرئيسي (أي الحل الذي تم تحضين مع حبات هيدروكسيد الصوديوم لمدة 11 دقيقة ثم نسج من خلال تصفية تدور في أنبوب الطرد المركزي قبل إضافة 300 ميكرولتر من إيه سي في الخطوة السابقة) إلى silanized 13 × 100 ملم أنابيب الاختبار الزجاجية التي تحتوي على ⁴² 3.5 مل من 0.2 M عازلة فوسفات الصوديوم التي تحتوي على 0.5 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0 و خلط (دوامة) على الفور. تجنب نقل أي مخلفات صلبة بيضاء خلال هذه الخطوة. هل كل هذا لعينة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
   14. دون تأخير، ونقل (الجمع) وإيه سي تدور من خلال في كل أنبوب خزان ل(مع) ما تبقى من عينة السائل في أنبوب زجاجي silanized منها، وخلط (دوامة) على الفور. مرة أخرى، وتجنب نقل أي مخلفات صلبة بيضاء خلال هذه الخطوة. كاب، هزة، ودوامة أنبوب زجاجي. كرر لكل عينة. تجاهل الأعمدة هيدروكسيد الصوديوم والماصات باستور في حاويات النفايات المناسبة.
4. السائل / السائلة إضافيction وغليكان تنقية
   1. داخل غطاء الدخان، إضافة 1.2 مل كلوروفورم لكل عينة. بعد ذلك مباشرة، وكأب أنابيب زجاجية silanized وتخلط بقوة المحتويات.
   2. الطاقة والمعادن قبل الحرارة إلى حوالي 75 درجة مئوية في مشعب التبخر. استخدام كتل التدفئة مع الآبار التي يمكن أن تستوعب 13 ملم × 100 ملم أنابيب الزجاج.
   3. الحصول على مجموعة جديدة من الماصات silanized باستور، الماصات باستور غير silanized، وsilanized أنابيب الاختبار الزجاجية مع قبعات.
      تحذير: الكلوروفورم (CHCl ₃₎ هو مصدر إزعاج، المغير، والمحتملة مسرطنة قادرة يتسرب من خلال بعض أنواع من القفازات.
   4. لفترة وجيزة الطرد المركزي (~ 3000 × ز) أنابيب زجاجية تحتوي على عينة لفصل الطبقات المائية والعضوية.
   5. استخدام ماصة غير silanized باستور لاستخراج ما يكفي من الطبقة العليا مائي بحيث ~ 3 ملم من الطبقة المائية يبقى فوق طبقة العضوية القاع.
   6. إضافة 3.5 مل من M نا 0.5حل الكلورين في منطقة عازلة الفوسفات 0.2 M الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7) إلى كل أنبوب زجاجي، مزيج بقوة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (~ 3000 × ز). كما في الخطوة السابقة (1.4.3)، واستخدام ماصة غير silanized باستور لاستخراج طبقة المائية.
   7. كرر الخطوة السابقة (1.4.4)، ولكن ترك ~ 1 مل من الطبقة المائية.
   8. استخدام ماصة باستير silanized نظيفة لنقل الطبقة العضوية إلى silanized 13 × 100 مم أنبوب اختبار زجاج نظيفة وصفت بشكل مناسب. تجنب التلوث المائي عن طريق استخراج بالطريقة التالية:
      1. عقد كل من أنابيب الاختبار الزجاجية silanized الحالية والجديدة المجاورة لبعضها البعض في يد واحدة. مع جهة أخرى، اضغط على لمبة ماصة لخلق فقاعات في حين إدراج ماصة إلى أسفل من خلال طبقة المائية.
      2. مرة واحدة داخل طبقة العضوية، والتوقف عن خلق فقاعات، وعقد لمبة ماصة ثابتة للسماح للطبقات العضوية والمائية لتحقيق الاستقرار وفصل مرة أخرى. ثم حرر ببطء لمبة لسحب أكبر قدر من ORGANIطبقة ج ممكن دون أي تلوث مائي.
      3. رفع بسرعة غيض ماصة من خلال طبقة المائية، ومقاومة رد الفعل الطبيعي للإفراج قليلا لمبة (مما يؤدي إلى سحب بعض التلوث المائي)، في حين رفع ماصة من الأنبوب.
      4. بسرعة نقل الطبقة العضوية المنخفضة اللزوجة إلى أنبوب جديد مجاور. وأي تلوث مائي تكون واضحة كما قطرات سائلة صغيرة على الجزء العلوي من طبقة العضوية المستخرجة في أنابيب زجاجية جديدة. إذا مائي التلوث / كلوريد الصوديوم مرئيا، إزالته مع ماصة. أجهزة الطرد المركزي إذا دعت الحاجة لتجميع قطرات مائي في قطرة واحدة.
   9. التخلص السليم من الأنابيب القديمة الزجاج، الماصات، ومائي والحلول النفايات العضوية. غسل وإعادة تدوير قبعات أنبوب زجاجي.
   10. تجفيف جميع العينات تحت تيار لطيف ومستمر من النيتروجين في مشعب تبخر محمى على حرارة 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ~ داخل غطاء الدخان. لضمان التبريد التبخيري خلال كل الظريف الجاف إلى أسفلملاحظة، وتدفق لطيف ومستمر من النيتروجين يجب أن تزعج سطح السائل دون الرش أو يتناثر السائل. إزالة عينات من مشعب تبخر على تجفيف كامل للعينة النهائية. بقع بيضاء في الجزء السفلي من أنابيب الزجاج المجففة تشير عازلة / تلوث كلوريد الصوديوم.
   11. وقفة الإجراء هنا إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت المتبقي من اليوم لإكمال الخطوة التحلل TFA. مؤقتا (أي، بين عشية وضحاها) تخزين العينات الجافة في -20 درجة مئوية. مواصلة الإجراء بعد التخزين، وإزالة عينات من الثلاجة -20 درجة مئوية، والسماح لهم لتدفئة تماما قبل uncapping.
   12. بينما عينات دافئة، تمهيدا لحمض trifluoroacetic (TFA) التحلل (المرحلة المقبلة)، تعيين عباءة التدفئة مثل أن درجة حرارة محتويات أنبوب اختبار السائل سوف تصل إلى 121 درجة مئوية. إعداد الحل TFA من الأسهم TFA (انظر الخطوة 2.1 أدناه).

2. Trifluoroacetic حمض (TFA) الحلمأة

تحذير: حمض Trifluoroacetic (TFA) هو حمض عضوي للتآكل وتهيج السامة.

1. إعداد كمية كافية من محلول 2.0 M TFA في الماء منزوع الأيونات. وسيكون لكل عينة تحليلها يتطلب 325 ميكرولتر من 2.0 حل M TFA. المركزة TFA هو 13.0 م.
2. إضافة 325 ميكرولتر من 2.0 M TFA لكل عينة تحليلها. لمنع TFA التبخر وفقدان العينة خلال خطوة تجفيف اللاحقة (2.3 أدناه)، بإحكام سقف كل أنبوب عينة فورا بعد إضافة TFA. بمناسبة مستوى حل في جميع أنابيب زجاجية. دوامة كل عينة بدقة قبل الخطوة التالية.
3. احتضان أنابيب العينات توج بإحكام لمدة 2 ساعة في كتلة التدفئة مناسبة قبل ساخنة أو الفرن بحيث محتويات تصل إلى درجة حرارة 121 درجة مئوية. إذا باستخدام كتلة التدفئة بدلا من الفرن، وأنابيب غطاء عينة بورق الألمنيوم لمنع التكثيف من TFA في الجزء العلوي من الأنبوب والتجفيف الجزئي لعينة بقايا في الجزء السفلي من الأنبوب. التحقق من مستويات محلول العينة بعد 20-30 دقيقة.لضمان الحد الأدنى من TFA التبخر. إذا لزم الأمر، وتشديد قبعات أخرى أو استبدال أغطية لتشديد مناسبا.
4. أثناء الانتظار 2 ساعة، مجموعة متعددة تبخر أخرى إلى 75 درجة مئوية للخطوة التالية (انظر 2.4 أدناه).
5. عندما تكون فترة التدفئة 2-ساعة كاملة، والعينات الجافة في 75 درجة مئوية تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين ل~ 15 دقيقة. لا تترك عينات غير المراقب لأكثر من 15 دقيقة. كثيرا ما تحقق العينات، ووقف التدفئة والتجفيف مرة واحدة كل العينات الجافة.
6. وقفة الإجراء هنا إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت المتبقي من اليوم لاستكمال خطوة التخفيض. مؤقتا (أي، بين عشية وضحاها) عينات مخزن في -80 درجة مئوية. مواصلة الإجراء بعد التخزين، وإزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية، والسماح لهم لتدفئة تماما قبل uncapping.

3. الحد

1. داخل غطاء الدخان، وإعداد كمية كافية من 10 ز بوروهيدريد / L الصوديوم (NaBH ₄₎ حل في 1 M العمونيأم هيدروكسيد (NH ₄ OH). وسيكون لكل عينة تتطلب 475 ميكرولتر من هذا الحل. تقديم حل جديد لكل دفعة من العينات. هيدروكسيد الأمونيوم المركزة (27-30٪ ث / ث NH ₃₎ ما يقرب من 14.5 م.
   تحذير: بوروهيدريد الصوديوم (NaBH ₄₎ عبارة عن سموم المتفاعلة مع الماء استرطابي وإزعاج قوي يجب النشرات على اتصال مع أبخرة قابلة للاشتعال عالية المياه التي تسبب حروق خطيرة على اتصال استنشاق، ابتلاع، أو العين / الجلد.
   تحذير: هيدروكسيد الأمونيوم (NH ₄ OH) هو مهيج للتآكل وسموم قادرة على التسبب بحروق شديدة وتلف الجهاز لا رجعة فيه على اتصال استنشاق، ابتلاع، أو العين / الجلد. غسل المناطق المصابة بالماء لمدة 30 دقيقة، ومنع الضحية من فرك أو خدش المناطق المتضررة.
2. لكل عينة، إضافة 475 ميكرولتر من 10 جرام / لتر NaBH ₄ في 1 M NH ₄ OH. عينات المزيج جيدا لإذابة أي مخلفات. كاب أنابيب الاختبار والسماح للتفاعل اختزال أن يستمر لمدة 1 ساعة.
3. أثناء الانتظار 1 ساعة، تعيين متعددة تبخر تسخينها إلى 75 درجة مئوية. استخدام كتلة التدفئة مع الآبار المناسبة للأنابيب الزجاج (انظر 3.4 أدناه).
4. عندما تكون فترة رد الفعل 1-ساعة كاملة، إضافة 63 ميكرولتر الميثانول (MeOH) لكل عينة. هذه الخطوة والخطوة التالية إزالة البورون المتبقية كما ثلاثي بورات - السائل متقلبة نسبيا أن يغلي عند 68 درجة مئوية.
5. العينات الجافة (في مشعب قبل ساخنة) في 75 درجة مئوية تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين ل~ 15 دقيقة. كثيرا ما تحقق العينات ولا تترك لهم غير المراقب. قطرات سائلة صغيرة في الجزء السفلي من أنابيب الزجاج تشير إلى أن العينة لم الجافة.
   ملاحظة: لتمييز فقاعات الهواء من قطرات سائلة، إمالة أنبوب الاختبار. سوف تتحرك إلا قطرات سائلة بعد إمالة، ولكن العكس ليس صحيحا دائما: إذا لم يتحرك فقاعة، يمكن أن يكون لا يزال (صغيرة جدا) قطرة السائل.
6. مرة واحدة sampl الدراسيوفاق جافة تماما، وإعداد 9: حل 1 (ت / ت) من الميثانول (MeOH) وحمض الخليك (AcOH). إضافة 125 ميكرولتر من هذا MeOH: AcOH حل لكل عينة.
7. العينات الجافة (في مشعب قبل ساخنة) في 75 درجة مئوية تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.
8. عندما تكون العينات الجافة تماما، فراغ تجفيف العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة: مكان العينات في حوض استحمام في فراغ البلاستيك (مثل تلك التي تباع من قبل فودسافير)، إغلاق غطاء الفراغ، تعيين الطلب فراغ إلى "فراغ"، ربط خرطوم فراغ، وبدوره على فراغ. لتفكيك فراغ، عكس هذه الخطوات. انتظر النظام لضغط تماما قبل محاولة فتح غطاء الفراغ.
9. وقفة الإجراء هنا إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت المتبقي من اليوم لاستكمال خطوة التخفيض. مؤقتا (أي، بين عشية وضحاها) عينات مخزن في -80 درجة مئوية. مواصلة الإجراء بعد التخزين، وإزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية، والسماح لهم لتدفئة تماما قبل uncappinز.
10. في الوقت الذي تنتظر للحصول على عينات لفراغ الجافة (أو دافئة، بعد التخزين)، وإعداد الكواشف للخطوة التالية. الحصول على عدد من silanized الاوتوماتيكى المخروطية القاع (ع) قنينة (مع غطاء) لكل عينة. وعلاوة على ذلك، قبل الحرارة على حد سواء كتلة التدفئة الضحلة جيدا AS-قنينة وكتلة الزجاج أنبوب في آبار عميقة بحيث محتويات أنبوب زجاجي سوف تصل إلى درجة حرارة تبلغ 50 درجة مئوية.

4. أستلة (المنفذ في الدخان هود)

1. إضافة 18 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء إلى كل عينة. كاب وبدقة دوامة جميع أنابيب إلى حل تماما أي رواسب.
2. إضافة الخل 250 ميكرولتر الخليك إلى كل أنبوب زجاجي. كاب، دوامة بدقة، ويصوتن في حمام مائي لمدة 2 دقيقة لضمان حل كامل من أي مخلفات ورواسب.
3. تغطية أنابيب زجاجية مع رقائق الألومنيوم، واحتضان عند درجة حرارة داخلية تبلغ 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
4. إضافة 230 ميكرولتر يتركز حامض trifluoroacetic (TFA) لكل عينة. سقف على الفورد مزج العينات. ثم، احتضان عينات مغطاة رقائق الألومنيوم لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة داخلية تبلغ 50 درجة مئوية.
5. بعد الحضانة، إضافة 1.8 مل ثنائي كلورو ميثان (CH ₂ الكلورين ₂₎ لكل عينة. سقف وتخلط جيدا.
6. إضافة 2.0 مل منزوع الأيونات الماء إلى كل عينة. كاب وعينات المزيج جيدا. أجهزة الطرد المركزي من 0 إلى 3000 × ز لفصل طبقات. استخدام ماصة غير silanized باستور لأداء السائل استخراج / السائل كما هو موضح في الخطوة 1.4.6، وتجنب تلوث المياه.
7. كرر استخراج مرة أخرى، ليصبح المجموع اثنين الاستخراج. استخدام ماصات باستور silanized لنقل الطبقة العضوية إلى المعنون باسم silanized AS قارورة (عقدت بشكل آمن في رف ع). ملء قارورة AS إلى أقل بقليل من أسنانها.
8. استخدام قبل ساخنة، كتلة التدفئة الضحلة جيدا لعينات الجافة (في AS قارورة) لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية تحت غاز النيتروجين. لا أكثر الجافة. ومن المعروف أن المنتجات النهائية كما الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs).

5. الغاز اللوني - الطيف الكتلي (GC-MS)

1. إعادة كل عينة في 100 ميكرولتر من الأسيتون وتخلط جيدا. استخدام الاوتوماتيكى لحقن 1 ميكرولتر من كل عينة في وضع الانقسام في GC انقسام وضع بطانة (الحفاظ على 280 درجة مئوية، وتحتوي على المكونات الصغيرة من الصوف الزجاجي silanized). استخدام نسبة الانقسام 40. استخدام الهيليوم بوصفها الناقل للغاز في نمط التدفق الثابت في 0.8 مل / دقيقة خلال 30 م DB-5MS العمود GC مع معرف 0.25 مم و 0.25 ميكرون سمك الفيلم.
2. عقد درجة حرارة الفرن GC الأولية في 165 درجة مئوية لمدة 0.5 دقيقة. بعد وقت عقد الأولي، برنامج الفرن إلى منحدر درجة الحرارة، ولكل شوط، من 165 درجة مئوية إلى 265 درجة مئوية بمعدل 10 درجة مئوية / دقيقة (والذي يستغرق 10 دقيقة)، وبعد ذلك على الفور منحدر درجة حرارة 265 درجة مئوية إلى 325 درجة مئوية في معدل 30 درجة مئوية / دقيقة (الذي يأخذ 2 دقيقة) والحفاظ على درجة حرارة 325 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. إجمالي وقت التشغيل في العينة 15.5 دقيقة.
3. استخدام مؤيدضبطها بيرلي ومعايرة مطياف الكتلة لإخضاع مكونات عينة يبلغ حجمه من العمود GC إلى إلكترون التأين (EI، 70 فولت عند 250 درجة مئوية). لمحلل كتلة TOF وتحليل شظايا من م / ض 40 إلى م / ض 800 مع 0.1 ثانية معدل الجمع النبض. تعيين EI خيوط تأخير الوقت المذيبات من 2.5 دقيقة.

تحليل 6. البيانات

1. في حالة استخدام محلل كتلة TOF، خلاصة القول أيونات جزء الأكثر وفرة و / أو التشخيص لكل PMAA من خلال تطبيق إطار شامل من 0.15 دا للحصول على اللوني ايون المستخرج. وقد نشرت أيونات هدف لكل PMAA في أي مكان آخر، ³³ ولكن تم إجراء التعديلات التالية: أيونات تي GLC الآن 145.1 + 205.1. 2-رجل الأيونات 161.1 + 189.1. 3-غال الأيونات 161.1 + 233.1، 6 غال الأيونات 161.1 + 189.1 + 233.1. 2،6 الرجل أيون هو 189.1. أيونات 3،6 الرجل هي 189.1 + 233.1.
2. استخدام QuanLynx أو غيرها من البرامج لدمج المناطق الذروة لكل لخص استخراج اللوني ايون تلقائيا.
يدويا تحقق نتائج التكامل عن طريق عرض كل متكامل اللوني ايون المستخرج. ثم، تصدير البيانات ذروة التكامل إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل وتطبيع البيانات، والذي ينطوي على تقسيم مساحة كل XIC هيكسوز الفردية عن طريق مجموع كل المناطق هيكسوز XIC. وبالمثل، يتم تقسيم مساحة كل فرد HexNAc XIC على مجموع كل المناطق HexNAc XIC. هذا الإجراء ينتج فرة طبيعية لكل هيكسوز الفردي وHexNAc.

وأظهرت اللوني الحالي مجموع ايون (TIC) تظهر permethylation ناجحة، التحلل، والحد، وأستلة من عينات بلازما الدم الإنسان بالنسبة إلى الحالات التي تم فيها تنفيذ خطوتين permethylation الحرجة بشكل غير صحيح في الشكل (3).

مطلق محصول HexNAcs بالنسبة إلى Hexoses:

N -acetylhexosamine (HexNAc) الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs) تميل إلى أن تكون الغلة أقل من hexoses ⁴³ لتقدير العائد المطلق للHexNAcs نسبة إلى hexoses، ست عينات 10 ميكروغرام من N -acetyllactosamine (أ ديساكهارايد Gal1-4GlcNAc) في وقد تم تحليل 10 ميكرولتر من الماء. تم دمج مناطق ذروة TIC لسكر اللبن محطة (تي غال) و 4 GlcNAc. كانت نسبة 4 GlcNAc نسبة إلى المبلغ الإجمالي للتي غال و 4 GlcNAc 11.3 ± 0.7٪ (SEM). على الرغم من أن عائدات HexNAc هي تكرار (انظر أدناه)، والحقيقة أن هذه القيمة هي أقل بكثير من القيمة النظرية من 0.5 يشير إلى أن العائد من HexNAcs أقل جوهريا عن تلك التي hexoses. (العائد النظري HexNAc هو 0.5 لN -acetyllactosamine هو 1: 1 هيكسوز-HexNAc ديساكهارايد)

داخل وInterassay التكاثر:

وتقدم داخل واستنساخ interassay لكافة العقد غليكان المساهمة لا يقل عن 1٪ من إجمالي هيكسوز أو إشارة HexNAc في الجدول 1. تم الحصول على هذه البيانات من قبل 3 المحللين منفصل عن 3 أيام منفصلة، ​​وذلك باستخدام نفس الرصيد من EDTA البلازما. بيانات الاستقرار الاوتوماتيكى بموجب هذا البروتوكول الأمثل ل18 عقد غليكان الأكثر وفرة في البلازما البشرية (أي تلك التي مع> 1٪ من إجمالي هيكسوز أو إشارة HexNAc) ترد في الشكل (4).

معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الملاحظات البارزة الأخرى:

مع تحقيق منهجية permethylation، وجدنا أنه ليس من الضروري لمنع امتصاص الماء حبات هيدروكسيد الصوديوم السابقة المبدئي غسل الأسيتونتريل. لقد وجدنا أيضا أن وجود كمية صغيرة من الماء أثناء الخطوة أستلة النهائية في تركيبة مع فترة وجيزة من التدفئة مع أنهيدريد الخل دون TFA يساعد على تسهيل التفاعل الكامل. وأخيرا، فإن حل السلطة عالية من الوقت من الطيران (TOF) مطياف الكتلة ليست ضرورية لنجاح تحليل العقدة غليكان: نتائج الأولية على أساس حقن مواز من نفس مجموعة من العينات على GC-TOF-MS ورباعي نقل التقليدية المستندة GC-MS تعمل في رصد أيون تحديد وضع (SIM) تظهر نتائج مماثلة من حيث هيكسوز تطبيع النهائي وHexNAc فرة نسبية.

er.within الصفحات = "1">
. الشكل 1. الجزيئية محة عامة عن إجراء تحليل الحامض غليكان جلوبل يا -linked غليكان هي مصورة. يتم إطلاق هذه أثناء عملية permethylation، والتي تم تعديلها من جويتز. ⁴⁰ وبعد permethylation والتحلل، يتم تخفيض السكريات الأحادية ومجموعات الهيدروكسيل الوليدة "علامة" من ​​قبل أستلة. نمط فريد من مثيلة وأستلة في اخر الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs) يتوافق مع فريدة من نوعها "عقدة غليكان" في البوليمر سليمة الأصلي ويوفر الأساس الجزيئي للانفصال وتقدير من قبل GC-MS. N -linked وglycans شحمي سكري وأفرج عن السكريات الأحادية بعلامات الربط خلال التحلل الحمضي. مقتبس من بورخيس وآخرون. ³³ بإذن.> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. نظرة عامة المفاهيمية لمفهوم تحليلي. إن ناقلة الغليكوزيل upregulated (على سبيل المثال، GNT-V) يسبب زيادة في كمية من، بقايا أحادي السكاريد غليكان مرتبط بشكل فريد محددة (أ 2،6 مرتبطة المانوز "العقدة" في هذا المثال) -الذي، من خلال إجراء لاحق glycosyltransferases أخرى، يمكن أن يؤدي إلى تشكيل خليط من هياكل متجانسة بكل غليكان في عدد نسخة منخفضة كل-والتي يمكن أن يكون من الصعب كشف وتحديد بطريقة روتينية. يجمعان تحليليا معا "العقد غليكان" من بين جميع هياكل غليكان الشاذة يوفر قياس بديلة أكثر مباشرة النشاط GNT-V من أي غليكان سليمة واحدة. قياس في وقت واحد N - يا -، والدهون مرتبطة "glyc والعقد "في biospecimens كله كما هو موضح هنا (والأصل في أي مكان آخر ³³⁾ يمثل وسيلة جديدة من الناحية المفاهيمية التي لكشف ورصد الأمراض غليكان-العاطفية مثل السرطان. الفعلية المستخرجة الاستشرابية أيون من 10 ميكروليتر عينات بلازما الدم هو مبين. الأرقام المجاورة ل بقايا أحادي السكاريد في هياكل غليكان تشير إلى الموضع الذي يرتبط بقايا أعلى إلى بقايا أقل. إذا لم يتم الإشارة إلى مواقع الربط في الشرح اللوني بقايا إما في موقف المحطة أو الحرة في حل (على سبيل المثال، الجلوكوز). جميع المخلفات . إلا رابط الحامض اللعابي إلى الأسفل عبر لهم موقف 1؛ الروابط حمض اللعابي إلى الأسفل عبر موقف 2 في تقسيم في اللوني يشير إلى تغيير في الاستشرابية أيون استخراج: م / ض 117 +129 لبقايا هيكسوز وم / ض 116 + 158 لN - acetylhexosamine (HexNAc) المخلفات. مقتبس من بورخيس وآخرون. ³³ بإذن.61 / 53961fig2highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. ممثل النتائج. الاستشرابية الحالية مجموع أيون (الحيازات) للتحليل العقدة غليكان من نفس العينة EDTA الدم البلازما البشرية التي أ) تمت معالجة العينة بشكل صحيح، B) بقايا بيضاء في حل permethylation الذي نسج من خلال هيدروكسيد الصوديوم وقد أجريت العمود إلى الخليط لاحق لاستخراج السائل / السائلة، وC) الحل permethylation الذي نسج من خلال العمود هيدروكسيد الصوديوم تم إضافتها إلى المخزن المؤقت الفوسفات ولكن لا يخلط قبل جيدا لإضافة الكلوروفورم لاستخراج السائل / السائلة. أسطورة الواردة في الشكل 2. يرجى النقر حيحرث لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. الاوتوماتيكى الاستقرار. الاوتوماتيكى الاستقرار أكثر من 48 ساعة ل18 عقد غليكان الأكثر وفرة في البلازما البشرية. في 22 ساعة وتجفف عينة تماما وأعاد في 120 الأسيتون ميكرولتر. كل مجموعة من نقاط البيانات تمثل أربع حقن متتالية من نفس العينة. خطوط سوداء تشمل ± 15٪ من متوسط ​​قيمة تطبيع لكل عقدة غليكان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمثل الجدول 1. البينية واستنساخ interassay. القيم٪ السيرة الذاتية من إجمالي هيكسوز أو HexN مجموعهAC-تطبيع العقد غليكان الفردية. يتم سرد كافة العقد غليكان المساهمة لا يقل عن 1٪ من إجمالي هيكسوز أو إشارة HexNAc. تم الحصول على البيانات من قبل 3 المحللين منفصل عن 3 أيام منفصلة، ​​وذلك باستخدام نفس الرصيد من EDTA البلازما. N = 6 عينات لكل دفعة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول كما جداول البيانات إكسل.

بشكل عام، وإنتاج ناجحة من الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs) من hexoses محفوف صعوبات أقل وأكثر قوة من الإنتاج الناجح لN -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. الآلية الدقيقة وراء هذه الظاهرة كما أنه يلعب بها في كل خطوة من هذا الإجراء غير معروف، ولكن يجب أن تتصل الكيمياء فريد من مجموعة -acetyl N (بدلا من مجموعة الهيدروكسيل) التي هي فريدة من نوعها لHexNAcs نسبة إلى hexoses. وأوضح آلية وراء هذه الظاهرة من حيث صلته حمض المائي في أماكن أخرى. ⁴³ وباختصار، فإن القدرة على -methylacetamido N لتصبح موجبة الشحنة خلال التحلل حمض يجعل الربط غليكوزيدية مقاومة للحمض المائي. وهذا ما يفسر انخفاض المردود من HexNAc نسبة إلى هيكسوز (11.3٪ من إجمالي HexNAc + هيكسوز إشارة، بدلا من 50٪ من الإجمالي) كما هو موضح أعلاه لتحليل N -acetyllactosamine. والجدير بالذكر أن هذا ل نسبياالعائد ower من HexNAcs لا يجعل من الصعب كشف في biofluids والأنسجة المعقدة، أو يحول دون كشف سطحي من العقد غليكان المستمدة من كبيرة، glycans المعقدة (مثل 2،4-مان، 2،6 الرجل، 3،4،6 -man، و3،4-GlcNAc، الشكل 2). ³³ وبالنظر إلى الطريقة التي XIC مناطق ذروة العقد غليكان تم تطبيع (الخطوة 6.3)، طالما أن العائد النسبي لكل فرد HexNAc يبقى قريب متسقة لHexNAcs الآخر ( وهو ما يحدث بالفعل، انظر الجدول 1)، معلومات مفيدة عن الكميات النسبية للHexNAcs مختلفة بين عينات مختلفة يمكن الحصول عليها. هذا ينطبق على hexoses كذلك. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا في وقت سابق ان نسب hexoses إلى HexNAcs عرض سلوك متناسقة الكمي وكذلك ³³ - ظاهرة والتي يتم مراقبتها باستمرار عبر إدماج عينة مراقبة الجودة (ق) في كل دفعة.

الطريقة التي يتم تنفيذ permethylation لها التأثير الأكبر علىالعائد الكلي واستنساخ HexNAc PMAAs. على وجه الخصوص، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تماما التعرض للglycans permethylated إلى القلوية الظروف المائية. اثنين من الخطوات الرئيسية في هذا الصدد هي 1) ترك كل راسب أبيض في الحلول تدور من خلال وراء (خطوات 1.3.13 و1.3.14)، و 2) خلط فورا الحلول تدور من خلال مرة واحدة يتم إضافتها إلى المخزن المؤقت الفوسفات ( الخطوات 1.3.13 و1.3.14). يتم تضمين مخزن مؤقت بدلا من محلول ملحي بسيط في هذه المرحلة واتخاذ خطوات السائل / استخراج السائل اللاحقة لمنع القلوية غير مقصود من محلول مائي. نشك في أنه في ظل الظروف القلوية مجموعة الأسيتيل من المجموعة 2-الأمينية مميثل والأسيتيل من HexNAcs قد تخضع المائي، مما أدى إلى أمين الثانوي أكثر القطبي الذي يقلل من كفاءة الاستخلاص الإجمالية للغليكان المرتبطة في الكلوروفورم.

الميزة الأكثر تميزا بسهولة من HexNAcs permethylated دون جدوى لشدة GlcNAc 4 مرتبطة (4 GlcNAc) الكروماتوغرافي الذروة بالنسبة لأولئك 6-غال، 3،6 الرجل، وكثافة أساسية من الخلفية أثناء النهائي العمود خبز المغادرة (الشكل 3). عندما وفرة مطلقة من 4 GlcNAc PMAA منخفضة، وفرته طبيعية بالنسبة لجميع HexNAcs البعض يميل أيضا إلى أن تكون منخفضة، مع زيادة مصاحبة (بشكل ملحوظ) من 3،4-GlcNAc.

وقد بذلت بعض التغييرات تهدف إلى تحسين مجمل المحصول وفحص متانة منذ نشر موقفنا المبدئي واصفا هذا النهج التحليلي ³³ واحدة من هذه التغييرات هو الطريقة التي الاستشرابية أيون استخراج المتكاملة (XICs) هي طبيعية: لمصلحة من البساطة، نقسم الآن مساحة كل XIC هيكسوز الفردية عن طريق مجموع كل المناطق هيكسوز XIC. وبالمثل، يتم تقسيم مساحة كل فرد HexNAc XIC على مجموع كل المناطق HexNAc XIC. كما يتضح من الجدول 1، interassay الشاملة / بين المحلل reproducibilإيتي لكافة العقد غليكان التي تساهم في> 1٪ من كل هيكسوز أو HexNAc المتوسطات إشارة على 13٪ السيرة الذاتية.

على حد علمنا، وهذا هو التجسيد الوحيد من glycomics أسفل إلى أعلى حقا التي يتم فيها كسر glycans أولا ومن ثم تحليل مكوناتها لبناء صورة واسعة عينة كمية من تكوين غليكان. هنا، بدلا من إطلاق سراح الأنزيمية التقليدي، عملية permethylation يلغي غير reductively (النشرات) O glycans -linked من البروتينات الخاصة بها، ⁴⁰ في حين -linked N يتم الافراج glycans خلال التحلل الحمضي. ³³ واتباع نهج متكامل لglycomics من أعلى إلى أسفل التقليدية ، وهذا النهج هو قادرة على تجميع الميزات غليكان فريدة من الفائدة مثل "fucosylation الأساسية"، "6-sialylation"، "تتوسط GlcNAc"، و "بيتا 1-6 المتفرعة" إلى إشارات تحليلية واحدة (انظر، 4،6-GlcNAc 6-غال، 3،4،6 الرجل والرجل 2،6 العقد في الشكل 2، respectively). في نهج من أعلى إلى أسفل التقليدية، وميزات مثل هذه التي تعتمد في نهاية المطاف على أنشطة فريدة من نوعها من واحد أو اثنين glycosyltransferases الرئيسية ³³ وعادة ما تكون موزعة عبر العشرات من glycans سليمة ويمكن أن تكون في بعض الأحيان صعبة أو مستحيلة لحل (على سبيل المثال، 3-sialylation مقابل 6-sialylation) بسبب الانحطاط من بعض الجماهير غليكان سليمة. وعلاوة على ذلك، أظهرت نهج من أسفل إلى أعلى المعروضة هنا الوعد الأولي في الكشف غير جراحية سرطان الرئة. هي ³³ مزيد من الدراسات جارية للتحقق من صحة هذه النتائج الأولية، فضلا عن نتائج غير منشورة إضافية، ولكن تتعلق الكشف عن أشكال أخرى من السرطان.

أكبر قيود على النهج المبين هنا هو أن يتم تقييد ذلك من حيث حدوده من الكشف، وإذا كان ليتم تطبيقها بروتينات سكرية إلى ما قبل معزولة. بناء على تحليلات غير منشورة من المعايير غليكان الفردية دون البروتين الناقل، حدود الكمي FOص تظهر glycans الفردية للكذب في نطاق ميكروجرام منخفضة. هذه ليست بأي حال LOQs منخفضة من حيث القيمة المطلقة، ولكن هذه الحقيقة لا يهم فيما يتعلق بنطاق أصلا من مقايسة التي لم تكن مصممة لوليس لديها الحاجة إلى تحقيق LOQs منخفضة (على الأقل لأغراض وصفت هنا و في منطقتنا المنشور السابق ^33). في الواقع، والبلازما البشرية / مصل يحتوي على بروتينات سكرية في 10S التركيز ملغ / مل المدى وهذا يعني أن لتحليل بلازما الدم / مصل نحن حقن فقط ~ 1/100 ^عشر من حجم العينة النهائية وتقسيم 40 من أصل 41 أجزاء أن كمية صغيرة للنفايات في ميناء GC حاقن. من دون هذه الممارسة، بعض العقد غليكان يمكن أن تشبع كاشف. لا يمكن الكشف عن كميات بيكو مول من البروتينات السكرية التي يمكن أن تنتج إشارات كافية غليكان سليمة من التقليدية من أعلى إلى أسفل MALDI-MS أو LC-MS النهج القائمة على هذا النهج. مزيد من الصقل لمنهجية جار لمعالجة هذا القيد.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the College of Liberal Arts and Sciences of Arizona State University in the form of laboratory startup funds to CRB. It was also supported by a grant from Flinn Foundation (Grant No. 1977) and by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number R33CA191110. JA was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) under award number R25GM071798. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.