Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Ce protocole décrit l’isolement des cellules souches musculaires et des progéniteurs fibro-adipogènes des muscles squelettiques individuels chez la souris. Le protocole implique la dissection musculaire unique, l’isolement des cellules souches par tri cellulaire activé par fluorescence, l’évaluation de la pureté par coloration par immunofluorescence et la mesure quantitative de l’entrée en phase S par test d’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine.
Le muscle squelettique abrite des populations distinctes de cellules souches adultes qui contribuent à l’homéostasie et à la réparation des tissus. Les cellules souches du muscle squelettique (MuSC) ont la capacité de fabriquer de nouveaux muscles, tandis que les progéniteurs fibro-adipogènes (FAP) contribuent aux tissus de soutien stromaux et ont la capacité de fabriquer des fibroblastes et des adipocytes. Les MuSC et les FAP résident dans un état de sortie prolongée du cycle cellulaire réversible, appelé quiescence. L’état de repos est la clé de leur fonction. Les cellules souches quiescentes sont généralement purifiées à partir de plusieurs tissus musculaires regroupés dans un seul échantillon. Cependant, des études récentes ont révélé des différences distinctes dans les profils moléculaires et la profondeur de quiescence des MuSC isolés de différents muscles. Le présent protocole décrit l’isolement et l’étude des MuSC et des FAP à partir de muscles squelettiques individuels et présente des stratégies pour effectuer une analyse moléculaire de l’activation des cellules souches. Il détaille comment isoler et digérer les muscles de différentes origines développementales, épaisseurs et fonctions, tels que le diaphragme, triceps, gracilis, tibial antérieur (TA), gastrocnémien (GA), soléaire, extenseur digitorum longus (EDL) et les muscles masséters. Les MuSC et les FAP sont purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et analysés par coloration par immunofluorescence et test d’incorporation de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU).
Le muscle squelettique a une grande capacité de régénération en raison de la présence de cellules souches musculaires (MuSC). Les MuSC sont situés sur les myofibres, sous la lame basale, et résident dans un état de repos de sortieprolongée et réversible du cycle cellulaire 1,2,3,4. En cas de blessure, les MuSCs s’activent et entrent dans le cycle cellulaire pour donner naissance à des progéniteurs amplificateurs qui peuvent se différencier et fusionner pour former de nouvelles myofibres 2,5. Des travaux antérieurs ont montré que les MuSCs sont absolument essentiels à la régénération musculaire 6,7,8. De plus, un seul MuSC peut se greffer et générer à la fois de nouvelles cellules souches et de nouvelles myofibres9. Le muscle squelettique abrite également une population de cellules stromales mésenchymateuses appelées progéniteurs fibro-adipogènes (FAP), qui jouent un rôle crucial dans le soutien de la fonction MuSC pendant la régénération musculaire 6,10,11,12.
En raison de leur potentiel à coordonner la régénération musculaire, il y a eu un énorme intérêt pour comprendre comment fonctionnent les MuSC et les FAP. Les MuSC quiescents sont marqués par l’expression des facteurs de transcription Pax7 et Sprouty1, et du récepteur de la calcitonine, une protéine de surface cellulaire, tandis que les FAP quiescents sont marqués par le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes de surface cellulaire (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Des études antérieures ont montré que les MuSC et les FAP pouvaient être purifiés des muscles squelettiques à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Bien que ces protocoles aient considérablement amélioré la capacité d’étudier les MuSC et les FAP, un inconvénient est que la plupart de ces protocoles nécessitent l’isolement des MuSC à partir d’un pool de tissus musculaires différents. Des travaux récents de notre part et d’autres ont révélé des différences dans le phénotype cellulaire et les niveaux d’expression génique entre les MuSC isolés de différents tissus22,23. Les MuSC du diaphragme, des triceps et des graciles montrent une activation plus rapide que les MuSC des muscles inférieurs des membres postérieurs22, tandis que les MuSC du muscle extraoculaire montrent une différenciation plus rapide que les MuSC du diaphragme et des muscles inférieurs des membres postérieurs23.
Ce protocole décrit l’isolement des MuSC et des FAP des muscles squelettiques individuels (Figure 1). Cela comprend la dissection du diaphragme, triceps, gracilis, tibial antérieur (TA), soléaire, extenseur digitorum longus (EDL), gastrocnémien (GA) et masséters. Les muscles disséqués sont ensuite dissociés par digestion enzymatique à l’aide de collagénase II (une protéase qui cible spécifiquement la séquence aminée Pro-X-Gly-Pro dans le collagène, permettant la dégradation du tissu conjonctif et de la dissociation tissulaire24) et de la dispase (une protéase qui clive la fibronectine et le collagène IV, permettant une dissociation cellulaire supplémentaire25). Les MuSC et les FAP sont isolés des suspensions unicellulaires par FACS. À titre d’exemples de tests en aval pour l’analyse cellulaire, l’activation des cellules souches est déterminée par dosage de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), tandis que la pureté cellulaire est déterminée par coloration par immunofluorescence pour les marqueurs spécifiques du type cellulaire Pax7 et PDGFRa.
Le présent protocole a été exécuté conformément aux directives de soins aux animaux de l’Université d’Aarhus et aux réglementations locales en matière d’éthique.
NOTE: Assurez-vous de respecter les règlements du comité d’éthique local pour l’expérimentation animale et la manipulation d’échantillons post-mortem de rongeurs. Les souris sont une source potentielle d’allergènes; Si disponible, activez la ventilation par aspiration et placez-la sur l’espace de travail pour éviter une exposition excessive aux allergènes. Vous pouvez également porter un masque facial si l’expérience est effectuée régulièrement. Ce protocole implique de travailler avec des objets tranchants, et il est recommandé aux chercheurs de se familiariser avec les procédures et la logistique pour appliquer les premiers soins dans le cas d’une coupure.
1. Préparation (1-2 h; la veille de la dissection)
NOTE: Les solutions, les plaques et les milieux sont préparés dans des conditions stériles et filtrés (0,45 μm) avant utilisation, sauf indication contraire. Préparer des solutions mères de dispase (11 U/mL dans le PBS) et de collagénase II (1 000 U/mL dans le PBS) et les conserver à -20 °C (tableau 1). Les souches sont décongelées et utilisées pour la digestion secondaire à l’étape 4.2.6.
2. Préparation (0,5 h; le jour de la dissection):
3. Dissection musculaire (20-30 min)
REMARQUE: Cette section du protocole est effectuée dans un environnement non stérile. La procédure peut être effectuée à l’aide d’une ou plusieurs souris. Cependant, une souris suffit pour préparer à la fois les échantillons pour le tri et les contrôles pour la mise en place de portes de compensation et FACS.
4. Digestion musculaire en suspension unicellulaire (~1 h 35 min)
REMARQUE : Les étapes suivantes comprennent les environnements de travail non stériles (étapes 4.1 à 4.2) et stériles (étape 4.3).
5. Coloration et tri (~40 min + 30 min de tri/échantillon)
REMARQUE : Travaillez dans un environnement stérile sur de la glace pour les étapes suivantes.
6. Essai d’incorporation d’EdU
NOTE: Travailler dans des conditions stériles et utiliser la hotte chimique lors de la manipulation du paraformaldéhyde (PFA) pour les étapes suivantes. EdU est un analogue nucléotidique incorporé dans l’ADN lorsque les cellules passent par la phase S du cycle cellulaire. Il est mutagène à des concentrations élevées. Portez toujours des gants lorsque vous manipulez EdU. Consultez les directives locales pour la manipulation des déchets EdU.
7. Coloration par immunofluorescence
REMARQUE : Cette partie du protocole peut être effectuée indépendamment de la section 6. Lorsque vous sautez la section 6, veuillez effectuer les étapes 6.3.1 et 6.3.2 pour activer la perméabilisation cellulaire avant de passer à l’étape 7.2 ci-dessous.
Conformément au protocole d’isolement individuel des muscles squelettiques (Figure 2), les muscles gracilis, TA, EDL, GA, soléus, triceps, masséter et diaphragme ont été isolés chez trois souris mâles suisses consanguines qui avaient été interrompues d’un programme de sélection local (Figure 2). Après dissociation tissulaire et coloration des anticorps, les MuSCs et les FAP des muscles individuels ont été purifiés par FACS (Figure 3). Le contrôle initial a été obtenu avec un échantillon non coloré pour identifier les cellules et séparer les singulets des doublets (figure 3A). Les vannes subséquentes ont été installées à l’aide de contrôles FMO pour déterminer les seuils de coloration (figure 3B). L’échantillon coloré a ensuite été fermé pour CD31/CD45-FITC et Sca1-PacBlue. La population SCA1+/CD31-/CD45- (FAP) a été triée dans un tube de collecte séparé, tandis que la population doublement négative a été fermée et tracée pour VCAM1-PECy7 et la diffusion vers l’avant (FSC). La population VCAM1+ (MuSC) a été triée dans un tube de collecte séparé. Les MuSC et les FAP ont été quantifiés en pourcentage de singlets (tableau 3) et triés dans des tubes de collecte séparés contenant 500 μL de produit de lavage. Les suspensions unicellulaires du muscle diaphragme et triceps ont une abondance relative plus élevée de MuSC que de FAP, tandis que les autres suspensions unicellulaires ont une abondance relative plus élevée de FAP que les MuSC (tableau 3).
Parmi les cellules triées, 1 000 à 3 000 cellules ont été ensemencées et incubées pendant 24 heures. Après 24 h d’incubation, le milieu a été retiré et remplacé par un milieu frais contenant de l’EdU. Les cellules ont été fixées à 48 h, colorées pour EdU, puis avec des anticorps contre la protéine Pax7 ou la protéine PDGFRa, et imagées à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversée. Les images ont été quantifiées à l’aide du plugin Fiji dans ImageJ. Une coloration robuste de l’EdU a été observée, bien que la fraction de cellules EdU-positives était différente pour les deux types de cellules souches et les différents muscles (Figure 4A-C). Les MuSC isolés de l’EDL ou de l’AG ont montré une incorporation d’EdU significativement plus faible par rapport aux MuSC isolés de l’AT, du diaphragme, du gracilis ou du triceps, tandis que les MuSC isolés du masséter et du soléaire se situent entre les deux et ne sont pas significativement différents de l’un ou l’autre groupe (Figure 4A, B). Cela est cohérent avec nos résultats précédents22. De plus, les tissus à partir desquels les MuSC présentent des niveaux élevés d’incorporation d’EdU sont les mêmes tissus à partir desquels il a été démontré précédemment que les MuSC expriment des niveaux élevés de protéine Pax322. Les FAP isolés de la PC Plus ont montré une incorporation d’EdU significativement plus faible que les FAP isolés de l’AG et du soléaire, tandis que les FAP isolés de l’AT ont montré une incorporation d’EdU significativement plus faible que les FAP isolés du soléaire (figure 4A, C). Cela souligne l’importance d’analyser les cellules souches de tissus individuels plutôt que de mettre en commun les muscles de différents tissus pour les isoler. Pour tous les tissus, la fraction moyenne des MuSC EdU-positifs était plus élevée que la fraction moyenne des PAF EdU-positifs, ce qui suggère que les MuSCs s’activent plus rapidement dans les conditions données.
Enfin, la pureté cellulaire a été confirmée par coloration par immunofluorescence (Figure 4D). En moyenne, 97,71 % (± 1,38 %) des MuSC étaient colorés positifs pour la protéine Pax7, et 88,16 % (±6,35 %) des PAF étaient colorés positifs pour la protéine PDGFRa, confirmant la spécificité de notre procédure d’isolement des cellules souches (Figure 4D).
Figure 1 : Résumé schématique du protocole. Schéma montrant les deux principaux segments du protocole, l’isolement MuSC (panneau supérieur), le test de quiescence (panneau inférieur) et les étapes clés de la méthodologie utilisée dans chacun d’eux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Localisation et isolement musculaires. (A) Un schéma montrant l’emplacement de chaque muscle. (B-S) Démonstration de l’isolement musculaire pour (B-D) gracilis, (E-G) TA/EDL, (H-J) triceps, (K-M) GA/soléaire, (N-P) masséter et (Q-S) muscles du diaphragme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stratégie de contrôle utilisée pour identifier et trier les MuSC et les FAP dans un échantillon de muscle du diaphragme. Les cellules sont identifiées en fonction de la taille des cellules (Forward Scatter (FSC)) et de la granularité (Side Scatter (SSC)). Les singlets sont sélectionnés en fonction de FSC-A et FSC-W. Les cellules de lignée sont fermées pour l’identification ultérieure des MuSC (Lineage-/VCAM1+), et les cellules FAP (Lineage-/SCA1+) sont fermées pour identifier les FAP. La même stratégie de contrôle a été appliquée à (A) un témoin non coloré, (B) des contrôles FMO (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC et FMO-VCAM1-PECy7) et (C) un échantillon coloré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Quantification de l’activation cellulaire par coloration EdU. (A) Images représentatives de la coloration EdU des MuSC (panneaux supérieurs) et des FAP (panneaux inférieurs) à partir d’un échantillon de diaphragme. Les images fusionnées d’EdU et de Hoechst (panneaux de gauche) et les canaux simples en vert (EdU, panneaux du milieu) et en bleu (Hoechst, panneaux de droite) sont montrés. (B,C) Diagramme à barres montrant le pourcentage de MuSCs (B) ou (C) FAPs positifs pour les muscles indiqués. Tracé est la moyenne ± SEM. Chaque point représente une souris. L’analyse statistique a été effectuée dans GraphPad à l’aide de tests t de Student bilatéraux, avec une signification définie sur *p < 0,05 et **p < 0,01. (D) Coloration par immunofluorescence des MuSCs (panneaux supérieurs) et des FAP (panneaux inférieurs) avec des anticorps dirigés contre le marqueur MuSC Pax7 (côté gauche) et le marqueur FAP PDGFRa (côté droit). Les images fusionnées de Pax7 avec Hoechst, suivies des canaux simples, et les images fusionnées de PDGFRa avec Hoechst, suivies des canaux simples. N = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Solutions | Réactifs | Quantité |
Fluide de lavage | F-10 Mélange nutritif (jambon) (1x), +L-glutamine | 445 mL |
Sérum de cheval | 50 mL | |
Stylo/streptocoque | 5 mL | |
Tampon de dissociation (1ère digestion) | Collagénase de type II | 650 U/mL |
Fluide de lavage | 100 mL | |
Stock de dispase (2ème digestion) | Dispase dans PBS | 11 U/ml |
Stock de collagénase (2e digestion) | Collagénase de type II dans PBS | 1000 U/mL |
PBS 1x | PBS 10x concentré en poudre | 9,89 g/L |
Eau autoclavée/stérile | 1 L | |
Eau acide | Acide acétique glacial (100%) Anhydre pour analyse | 5,15 mL |
Eau autoclavée/stérile | 895 mL | |
Solution de collagène (0,002%) | Collagène de peau de veau | 20 mL |
Eau acide | 800 mL | |
Triton X-100 | Triton X-100 | 0,5 % (v/v) |
PBS 1x | 99.5% | |
Blocage du tampon | PBS 1x | 18 mL |
Sérum d’ânesse | 2 mL |
Tableau 1 : Tableau des recettes.
N° d’échantillon | Nom |
1 | Non taché |
2 | Fluorescence moins VCAM1-PeCy7 |
3 | Fluorescence moins SCA1-PacificBlue |
4 | Fluorescence moins CD31/45-FITC |
5 | Coloration expérimentale (les quatre anticorps) |
Tableau 2 : Aperçu de la coloration, des témoins et des échantillons préparés pour chaque tissu avant le tri.
Tissu | Mélange d’anticorps | Cellules | Maillots | Lin neg | PAF | Les CSMU |
Diaphragme | non taché | 100% | 82% | 55% | 0.5% | 0.0% |
FMO Sca1-PacBlue | 100% | 83% | 19% | 0.3% | 4.3% | |
FMO CD31/45-488 | 100% | 84% | 40% | 9.4% | 5.6% | |
FMO Vcam1-PeCy7 | 100% | 78% | 20% | 5.6% | 0.0% | |
Tachée | 100% | 77% | 19% | 2.4% | 3.8% | |
Gracilis | Tachée | 100% | 96% | 11% | 2.6% | 1.4% |
MERCI | Tachée | 100% | 88% | 16% | 2.8% | 2.2% |
EDL | Tachée | 100% | 86% | 26% | 19.2% | 0.8% |
Soléaire | Tachée | 100% | 91% | 41% | 13.3% | 1.1% |
GA | Tachée | 100% | 94% | 51% | 6.1% | 1.5% |
Triceps | Tachée | 100% | 92% | 30% | 2.6% | 4.5% |
Masséter | Tachée | 100% | 85% | 27% | 19.3% | 2.6% |
Tableau 3 : Aperçu de l’abondance relative des types de cellules dans les données FACS.
Plusieurs étapes sont essentielles dans l’exécution de ce protocole pour obtenir de bons rendements. Les muscles individuels ont un petit volume par rapport à la quantité de muscle utilisée dans les protocoles d’isolement en vrac. Il en résulte un risque de dessèchement musculaire pendant la dissection, ce qui réduit le rendement. Pour éviter cela, il est important d’ajouter du milieu aux muscles immédiatement après la dissection. De plus, si la dissection prend plus de temps, la peau peut être retirée d’un membre à la fois pour réduire le temps d’exposition des muscles à l’air. Le volume plus petit entraîne également un risque accru de surdigestion. Pour contrer cela, la méthode actuelle nécessite des quantités plus faibles d’enzyme collagénase II et des temps de digestion réduits par rapport aux protocoles musculaires en vrac 9,16. La digestion enzymatique dépend également de la pureté des enzymes, et une pureté plus faible peut avoir un impact négatif sur le rendement. De plus, la digestion mécanique est essentielle. En cas de coupe insuffisante, la diminution de la surface entravera la digestion enzymatique et réduira le rendement en cellules souches. En cas de coupe excessive, l’augmentation de la surface entraînera une surdigestion et réduira le rendement en cellules souches. Le bain-marie à secousses empêche la précipitation du muscle digéré, améliore la distribution de l’enzyme et aide à créer une température homogène, permettant des temps d’incubation plus courts. Par conséquent, la méthode actuelle permet une réduction significative du temps d’incubation par rapport aux autres méthodes.
Ce protocole dépend de la dissociation et de la purification cellulaires. Ces procédures imitent les lésions tissulaires, ce qui active les cellules souches. De manière cohérente, des études récentes ont révélé que les MuSC modifient leurs programmes d’expression génique au cours de la procédure d’isolement27,28,29,30. En conséquence, les cellules souches purifiées sont différentes des cellules in vivo en termes de profils d’expression génique. Un deuxième facteur limitant le protocole est sa dépendance à l’égard de la FACS, qui nécessite l’accès à un équipement coûteux. FACS est l’étalon-or pour isoler plusieurs populations cellulaires simultanément avec une puretéélevée 20. Les progrès récents utilisant des billes magnétiques et des microbulles offrent des réductions de coûtde 31,32, mais il reste à déterminer s’ils offrent des rendements comparables pour travailler sur des muscles individuels. Enfin, le rendement du protocole est limité en raison de la petite taille des muscles, ce qui pose des restrictions sur les tests potentiels en aval.
Des études antérieures se sont appuyées sur la mise en commun de différents muscles lors de l’isolement des MuSC et / ou des FAP pour maximiser le rendement cellulaire. Cependant, cela fait la moyenne des différences spécifiques aux tissus dans le comportement et la fonction des cellules souches entre les différents muscles. Le protocole actuel permet d’isoler les MuSC et les FAP des muscles individuels pour les analyses en aval de la fonction des cellules souches. À titre d’exemple d’essai en aval, l’activation des cellules souches a été dosée par incorporation d’EdU, révélant que les cellules souches de différents tissus présentent une cinétique d’activation différente. Dans des travaux antérieurs, la faisabilité de l’utilisation d’autres essais en aval a été démontrée; ces tests nécessitent un plus petit nombre de cellules, tels que le séquençage de l’ARN unicellulaire SmartSeq2, la transplantation cellulaire, la PCR microfluidique et les tests d’expansion clonale 22,33,34,35.
En conclusion, ce protocole décrit une méthode de dissection de muscles individuels pour isoler et étudier les MuSC et les FAP. Cette stratégie permettra aux expériences de mieux comprendre la fonction des cellules souches dans différents muscles de la santé et de la maladie.
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents et pas de conflits d’intérêts.
Le tri cellulaire a été effectué au centre FACS de l’Université d’Aarhus (Danemark). Les figures ont été créées à l’aide de Biorender.com. Nous remercions le Dr J. Farup d’avoir partagé l’anticorps anti-PDGFRa du lapin. Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage AUFF à E.P. et des subventions Start Package de NovoNordiskFonden à E.P. (0071113) et à A.D.M. (0071116).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
Scissors | FST | 14568-09 | |
Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
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